PASTOREX STAPH-PLUS 1 x 50 56356 5 x 50 56353 Latex-Agglutinationstest För Identifiering Av Staphylococcus Aureus 881175 2015/01 1- AVSEDD ANVÄNDNING PASTOREX STAPH-PLUS är ett snabbt agglutinationstest för samtidig detektion av fibrinogenaffinitet (koagulas), protein A och kapsel polysackarider hos Staphylococcus aureus. 2- ÖVERSIKT Staphylococcus aureus är en av de mest vanligt förekommande patogenerna i kliniska prov. Att snabbt kunna skilja mellan den här arten och andra mindre virulenta stafylokocker är av största vikt för att ge patienten rätt behandling. Testet för detektion av produktion av fritt koagulas kan användas för identifiering av Staphylococcus aureus (11, 12).Detta test tar dock 4 till 24 timmar i anspråk och dessutom kan det förekomma plasmavariationer mellan olika partier som kan påverka reaktionen (16). Agglutinationsreagenser har utvecklats för att ge en snabbare och mer pålitlig detektion av Staphylococcus aureus (3). I dessa agglutinationstester används latex som har sensibiliserats med fibrinogen och IgG för att möjliggöra detektion av koagulas och protein A, biokemiska karakteristika hos S. aureus. Man har dock kunnat observera att vissa stammar av Staphylococcus aureus (huvudsakligen meticillinresistenta stammar) ej agglutineras av dessa agglutinationstester (15). En studie av dessa stammar har visat att samtliga innehåller kapsel polysackarider (4). Det är därför troligt att den polysackaridkapsel som omger hela bakterien under vissa förhållanden (direkta prov, isolerade odlingar och bakteriekloner) maskerar protein A och koagulaset, vilket förhindrar agglutination av latexpartiklar som endast har sensibiliserats med fibrinogen och IgG. 3- PRINCIP PASTOREX STAPH-PLUS har framtagits för samtidig detektion av följande tre komponenter: 1) Fibrinogenaffinitetsfaktorn, även kallad bundet koagulas. 2) Protein A, som har affinitet för det kristalliserbara Fc-fragmentet i immunoglobulin G (IgG). 3) Kapsel polysackarider i Staphylococcus aureus. Reagenset är gjord av latexpartiklar som har sensibiliserats med fibrinogen och IgG samt specifika monoklonala antikroppar (patenterade av Institut Pasteur) som svarar mot kapsel polysackarider hos Staphylococcus aureus (1, 5, 6, 8, 10). Kombinationen av fibrinogen, IgG och antikapsel monoklonala antikroppar i samma reagens gör det möjligt att identifiera väl inkapslade stammar av Staphylococcus aureus såväl som dåligt inkapslade stammar. När det gäller väl inkapslade stammar agglutineras bakterien av anti-kapsel polysackarid antikroppar. För stammar som har förlorat sina polysackaridkapslar agglutineras bakterien av fibrinogen och IgG. Framodlade isolat av Staphylococcus aureus blandas med latexreagensen på ett objektglas. När isolatet och reagensen har blandats fullständigt granskas objektglaset. En agglutination som är synlig för ögat visar att blandningen innehåller Staphylococcus aureus-organismer. 4- INNEHÅLL 1. PASTOREXTM STAPH-PLUS, Kit med 50 test, kod 56356 : Latex test : en droppflaska innehållande 1 ml röd latex, sensibiliserats med bovin albuminlösning. med fibrinogen, IgG och monoklonala antikroppar mot kapsel polysackarider hos Staphylococcus aureus. Konserveringsmedel: <1.5% ProClin 300. Negative control : en droppflaska med 1 ml negativ kontrollreagens bestående av röd latex som sensibiliserats med bovin albuminlösning. Konserveringsmedel: <1.5 % ProClin 300. 16 agglutinationskort för engångsbruk. 150 stavar. 2. PASTOREXTM STAPH-PLUS, Kit med 5 x 50 test, kod 56353 : Latex test : testreagens, fem droppflaskor (1 ml). Negative control : negativ kontrollreagens, fem droppflaskor (1 ml). Agglutinationskort för engångsbruk, 4 x 16. Stavar, 3 x 100. 1
5- FÖRVARING Alla reagenser är stabila fram till det bäst-före-datum som anges på etiketten, förutsatt att de förvaras i +2-8 C och inte utsätts för kontamination. Förvara latexreagensflaskorna stående. LATEXREAGENS FÅR EJ FRYSAS. 6- NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM EJ INGÅR Platinöser för uppsamling av bakteriekolonier. Desinfektionsbehållare eller autoklavpåse för använda kort. 7- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Pastorex Staph-plus är endast avsett för testning av bakteriekulturer och skall inte användas direkt på kliniska prov. Resultatens kvalitet är beroende av att man strikt följer god laboratoriesed (GLP). Alla reagenser och prov skall användas vid en temperatur på 18-30 C. Vidrör inte reaktionsytan på agglutinationskorten. Skaka latexflaskorna före användning. Torka av spetsen på reagensdroppflaskan så att dropparna blir väl kalibrerade. Håll reagensflaskan lodrätt när dropparna appliceras. Använd de plaststavar som ingår i kitet när du blandar latexreagensen med bakteriekolonier. Använd inte trästavar. Använd en ny stav för varje reaktion. Kasta allt använt engångsmaterial i en avfallspåse som kan köras i autoklav eller i ett desinfektionsbad. HYGIEN- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR Använd alltid rådande tekniker och försiktighetsåtgärder för att undvika mikrobiologiska risker. Obs. Reagenserna innehåller ProClin 300 < 1.5%. Mer information om risk- och försiktighetsinformation för vissa kemiska komponenter i testkitet hittar du på etiketterna och i den information som finns sist i bruksanvisningen. Säkerhetsdatabladet (SDS) finns tillgängligt på www.bio-rad.com. 8- ANVÄNDNINGSMETOD 1) PROVBEREDNING Alla prov som används med kitet måste vara rena och färska. Följande isolationsmedium eller motsvarande medium rekommenderas: Agarmedier Trypto-kasein-soja-agar Columbia-agar + fårblod Columbia-agar Blodagar Mannitol-salt-agar Baird-Parker-medium med additiv MRSASelect Utför Gramfärgning och katalastest på den framodlade bakteriekulturen. Kolonier som testas med reagensen i PASTOREX STAPH-PLUS bör vara grampositiva kocker som är katalaspositiva. 2) AGGLUTINATIONSREAKTION Homogenisera latexreagenserna noggrant genom att skaka dem. Vortexa reagensen vid behov. Applicera en droppe testreagens i en av cirklarna på agglutinationskortet. Applicera en droppe negativ kontrollreagens i en annan cirkel. Ta upp en till tre grampositiva, katalaspositiva kolonier med hjälp av en ögla eller plaststav och emulgera dem i en droppe latexlösning under tio sekunder. Upprepa steg 4 för den negativa kontrollösningen. Homogenisera genom att försiktigt rotera kortet. Resultaten måste avläsas inom 30 sekunder efter det att du har börjat rotera kortet. Utvärdera resultaten enligt följande kriterier och kasta sedan kortet i en desinfektionsbehållare. Återanvänd inte kortet. 9- UTVÄRDERING AV RESULTATEN POSITIV REAKTION Vid en positiv reaktion bildas aggregat enbart med testreagensen, synliga för blotta ögat i normalt ljus inom 30 sekunder efter det att kortet har börjat roteras. Aggregaten av latexpartiklar kan vara av olika storlek med en mer eller mindre grumlig, rosa bakgrund. Långsam eller svag agglutination kan tyda på en icke-specifik agglutination. 2
NEGATIV REAKTION Vid en negativ reaktion bildas inga aggregat i suspensionen, som behåller sitt mjölkaktiga utseende. OTYDBARA RESULTAT Otydbara resultat uppkommer vid agglutination av suspensionen med den negativa kontrollen. Använd i dessa fall en annan identifieringsmetod. Du kan till exempel undersöka förekomsten av fritt koagulas och värmestabilt DNase. 10- KVALITETSKONTROLL AV TESTET Undersök latexreagensen varje gång den används genom att kontrollera att det inte förekommer någon agglutination när latexlösningen appliceras på kortet. Latexlösningen bör med jämna mellanrum testas mot tidigare identifierade stammar av Staphylococcus aureus och Staphylococcus epidermidis. Testreagensen ska uppvisa agglutination med Staphylococcus aureus men inte med Staphylococcus epidermidis. 11- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och prepareras i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutlig marknadsföring av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad. 12- TESTRESULTAT PASTOREX STAPH-PLUS har utvärderats i flera olika laboratorier (2, 13, 14). Totalt har 440 stammar av S. Aureus och 138 andra stafylokockstammar testats med kitet. Odlingarna identifierades med hjälp av Gramfärgning, test av katalasaktivitet och koagulastest med rörmetoden. Avvikande prov testades vidare via biokemisk analys och ett alternativt snabbtest som finns på marknaden. S. aureus-stammar kontrollerades även för meticillinkänslighet. Resultatet av känslighetstestningen av meticillinresistenta S. aureus (MRSA) och meticillinkänsliga S. aureus (MSSA) samt det totala resultatet för alla stammar av Staphylococcus aureus presenteras i tabell 1. Resultatet av specificitetstestningen av andra stafylokockstammar än S. aureus presenteras i tabell 2. Tabell 1 Resultat för PASTOREX STAPH-PLUS på MRSA- och MSSA-isolat Totalt Positiva Negativa Relativ känslighet MRSA MRSA Samtliga S. aureus * exklusive ett otydbart resultat 217 * 217 0 100% 222 222 0 100% 439 * 439 0 100% Meticillinresistenta S. aureus Som framgår av tabell 1 identifierades 217 av 217 väldefinierade MRSA-isolat med PASTOREX STAPH-PLUS. De tre avvikande kulturerna befanns efter kontroll vara S. aureus-stammar. Två av dessa stammar gav en negativ reaktion med ett alternativt snabbtest och en stam uppvisade ett otydbart resultat både med PASTOREX STAPH-PLUS och ett alternativt snabbtest. Känsligheten hos PASTOREX STAPH-PLUS för MRSA beräknades till 100 %, exklusive det otydbara resultatet som motsvarar 0,4 % av samtliga analyserade stammar. Meticillinkänsliga S. aureus Samtliga 222 MSSA-stammar som odlades gav ett positivt resultat med PASTOREX STAPH-PLUS, vilket framgår av tabell 1. Känsligheten med den här populationen MSSA var 100 %. Andra Stafylokocker Tabell 2 Resultat för PASTOREX STAPH-PLUS på andra Stafylokockstammar Totalt Positiva Negativa Relativ specificitet Andra stafylokockstammar 138 1 137 99.3% 3
Även 138 stafylokockisolat av annan typ än S. aureus bland andra S.epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. schleiferi och S. lugdunensis analyserades med PASTOREX STAPH-PLUS. Negativa resultat erhölls för 137 av de 138 isolaten, vilket framgår av tabell 2. De avvikande resultaten identifierades som en S. lugdunensis-stamde var även positiva med ett alternativt snabbtest. 13- TESTETS BEGRÄNSNINGAR Staphylococcus lugdunensis och Staphylococcus schleiferi har visats ha en fibrinogenaffinitetsfaktor (7,9) och kan reagera med testet för koagulasdetektion beroende på stammarna och isoleringsmediet. Eftersom det är känt att vissa stafylokockstammar, i synnerhet Staphylococcus aprophyticus, kan orsaka icke-specifik agglutination av latexpartiklar, bör den kontrollatex som ingår i kitet användas med varje testad organism. Staphylococcus intermedius och Staphylococcus hyicus, som förekommer i djurpatologi men som mycket sällan isoleras hos människa, kan ge en positiv reaktion med de klassiska koagulastesterna och kan därför teoretiskt sett även reagera med tester för detektion av fibrinogenaffinitetsfaktorn. Möjligheten av korsreaktioner bör beaktas. Vissa streptokocker innehåller ett protein som har affinitet för immunoglobulinernas Fc-fragment och kan därför reagera med latex. Icke-specifika reaktioner med latexmetoder har även rapporterats för ytterligare arter, till exempel Escherichia coli och Candida albicans (17). Användaren rekommenderas att utföra Gramfärgning och katalastest på kolonierna innan de testas med latextestet. Falskt negativa reaktioner kan inträffa om den isolerade Staphylococcus aureus inte alstrar fibrinogenaffinitetsfaktorn, protein A eller kapsel polysackarider som de specifika monoklonala antikropparna svarar mot. Om bakteriesuspensionen bereds med otillräckligt antal kolonier kan falskt negativa resultat erhållas. 14- BIBLIOGRAFI 1. Boutonnier A., Nato F., Bouvet A., Lebrun L., Audurier A., Mazie J.C., and Fournier J.M. Direct testing of blood cultures for detection of the serotype 5 and 8 capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 1989. 27: 989-993. 2. Davies S. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the evaluation of rapid agglutination methods, Br. J. Biomed. Sci., 1997, 54:13-15. 3. Esserts I., and Radebold K. Rapid and reliable identification of Staphylococcus aureus by a latex agglutination test. J. Clin. Microbiol. 1980. 641-643. 4. Fournier J.M., Boutonnier A., and Bouvet A. Staphylococcus aureus strains which are not identified by rapid agglutination methods are of capsular serotype 5. J. Clin. Microbiol. 1989. 27:1372-1374. 5. Fournier J.M., Bouvet A., Boutonnier A., Audurier A., Goldstein F., Pierre J., Bure A., Lebrun L., and Hochkeppel H.K. Predominance of capsular polysaccharide type 5 among oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 1987. 25:1932-1934. 6. Fournier J.M., Hannon K., Moreau M., Karakawa W.W., and Vann W.F. Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1987. 138:561-567. 7. Freney J., Brun Y., Bes M., Meugnier H., Grimont F., Grimont P.A.D., Nervi C., and Fleurette J. Staphylococcus lugdunensis sp. No. and Staphylococcus schleifer sp. Nov., two species form human clinical specimen. J. Clin. Microbiol. 1989. 38:2110-2111. 8. Hochkeppel H.K., Braun D.G., Vischer W., Imm A., Sutter S., Staeubli U., Guggenheim R., Kaplan E.L., Boutonnier A., and Fournier J.M. Serotyping and electron microscopy studies of Staphylococcus aureus clinical isolates with monoclonal antibodies to capsular polysaccharide types 5 and 8. J. Clin. Microbiol. 1987. 25:526-530. 9. Jean Pierre H., Darbas H., Jean-Roussenq A., and Boyer G. Pathogenicity in T cases of Staphylococcus schleiferi, a recently described species. 10. Karakawa W.W., Fournier J.M., Vann W.F., Arbeit R., Schneerson, R.S. and Robbins. J.B. Method for the serological typing of the capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22:445-447. 11. Kloos W.E. and Lambe D.W. (1991). Staphylococcus Manual of Clinical Microbiology, 5th Ed. Edited by Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., and Shadomy J.J. American Society for Microbiology, Washington, D.C., Pages 222-237. 12. Kloos W.E., and Scleifer K.H. Staphylococcus Bergeyís manual of systematic bacteriology. 1986, vol. 2, 1013-1035. 13. Luijendijk AD., Alex van Belkum, Verbrugh H., and Kluytmans J. Comparison of Five Tests for Identification of Staphylococcus aureus from Clinical Samples. J. Clin. Microbiol., 1996, 34:2267-2269. 14. Neher C., Allerberger F., Prodinger W. Dierich M.P., Evaluation of commercially available agglutination tests for methicillinresistant. 8 th ECCMID Congress, Lausanne, 1997. 15. Ruane P.J., Morgan M.A., Citron D.M., and Mulligan M.E. Failure of rapid agglutination methods to detect oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 1986. 24:490-492. 16. Selepack S.T., and Witebsky F.G. Inoculum size and lot-to-lot variation as significant variables in the tube coagulase test for Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22:835-837. 17. Kronvall G. A Surface Component in Group A, C, and G Streptococci with Non-Immune Reactivity for Immunoglobulin G. J. Immunology., 1973, vol.11, 1401-1406. 4
5
6
Distributed in the USA by Bio-Rad Laboratories Diagnostics Group 6565 185th Avenue N.E. Redmond, WA 98052-5039 For Customer Orders Call : 1-800-2-BIORAD For Technical Service Call : 1-800-2- BIORAD (1-800 224-6723) Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2015/01 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881175 www.bio-rad.com 7