Blodgruppserologi, immunhematologi

Transkript

1 Blodgruppserologi, immunhematologi Första steget antikropp binder till antigen Joninteraktion beror förstås på jonstyrkan Hydrofoba bindningar, icke polära grupper undviker vatten och binder till varann. Värme ökar bindningsstyrkan Vätebindningar, exoterma, ökar alltså vid sänkt temperatur Van der Waal krafter, ökar ju närmare antikroppen och antigenet är till varandra Undanträngning av vatten 1 2 Formation av intra cellullära bryggor mellan cellerna (fria antikropps o antigen bindningsställen) 1. Aggregation 2. Repulsion 3. Koncentrationen av antigen kontra antikropp Temperatur För en antikropp med temperaturoptimum på 37⁰ minskar bindningshastigheten vid en lägre temperatur. Åtgärd, Inkubationen förlängs eller miljön ändras Vissa antikroppar binder till vid 37⁰ men dissocierar snabbt. Åtgärd, sänk temperaturen efter sensibiliseringen. Eluering av antikroppar, upphettning till 56⁰ dissociationen ökar. 3 4 Jonstyrka Minska jonstyrkan, associationen ökar T.ex. med LISS Low Ion Strength saline. Om jonstyrkan blir för låg --- ospecifik adsorption av immunglobuliner (antikroppar) ph Under normala förhållanden är erytrocyterna negativt laddade (sialinsyra). ph 7,0-7,5 Antikroppar har en svagt positiv laddning. Vandrar katodalt i elektriskt fält. Användning av PBS garanterar att den använda koksaltlösningen inte är sur. Salthalt 0,9 %. Isoton. Surt ph leder till ökad dissociation. Detta förhållande används vid eluering

2 Antigen densitet Antalet antigen och antigenets placering i membranet påverkar agglutinationen Vid underskott av antikroppar (många antigen) få eller inga agglutinat Vid överskott av antikroppar Prozonefenomen. Alla antigen är blockerade inga bryggor, inga agglutinat. Späd! 7 8 Första steget Antikropp binder till antigen Andra stadiet Bryggor av antikroppar mellan de sensibiliserade erytrocyterna, IgM binder i NaCl Ig G kräver förstärkt testmiljö (protein + centrifug ) och/eller en andra antikropp (AHG). IAT 9 10 Främst Ig-M. IgG anti-a och anti-b + enstaka anti-m Antikroppar som aktiverar komplement ger hemolys, kan misstolkas som negativ reaktion Vi använder EDTA som binder kalciumjoner som krävs för aktivering av komplementsystemet Indirekt agglutination med Antiglobulinteknik eller enzymbehandling av blodkropparna

3 Antiglobulinteknik Enzymbehandling av blodkropparna Enzymtekniker svåra att standardisera men bra för bestämning vid förekomst av flera antikroppar Proteaser alla har en bred specificitet för peptidbindningar Bromelin från ananas Ficin från fikon Papain från papaya Trypsin, chymotrypsin och neuroaminidas Neuroaminidas spjälkar gärna bort för mycket och T-antigenet (normalt gömt i cellmembranet) blottläggs, direktagglutineras av en T-antikropp Antiglobulintester Beskrevs redan 1908 av Carlo Moreschi,fast han inte förstod det. Moreschi's phenomen. Moreshi märkte att inkubation med tyfoid bakterier och utspätt get anti-tyfoidserum inte visade någon agglutination. Men efter tillsats av anti get serum agglutinerades bakterierna. R. Coombs och hans kollegor som uppfann/upptäckte AHG reaktionen i Cambridge 1945, [Coombs et al., 1945] kungjorde att Moreshis observation var en tidig applikation av AHG reaktionen Indirekt antiglobulintest påvisa antikroppar in vitro bundna IAT Direkt antiglobulintest påvisa antikroppar in vivo bundna DAT

4 Vad visar bilden? Ringa in det/de rätta svaren 1 p Positivt Resultatet av en Direkt antiglobulintest Negativt resultat av en Direkt antiglobulintest Positivt resultat av en Indirekt antiglobulintest Negativt resultat av en Indirekt antiglobulintest Jk a A B D C c E e K David Marie Stefan Anna- Carin Rahil Carl- Anton Sofia Sabina Anas Kim Henrik Naz Sara Leif Frida N Johan Betty Åsa Milan Salwa Carolin Pontus Frida G Hind Rebecka % Jk a hos europeer hos 0% hos 24 4

5 Other blood group incompatibility (RhC, HDFN också känt som erytroblastosis fetalis Rhesus D hemolytisk sjukdom ABO hemolytisk sjukdom Anti-Kell hemolytic disease of the newborn Rhesus c hemolytic disease of the newborn Rhesus E hemolytic disease of the newborn Rhe, Kid, Duffy, MN, P and others) Examples of autoimmune hemolysis WAIHA Warm antibody autoimmune hemolytic anemia IgG Idiopathic SLE Evans syndrome (antiplatelet antibodies and hemolytic antibodies) Cold antibody autoimmune hemolytic anemia IgM IDIOPATISK Infektiös mononukleos (Epstein Barr) (anti-i) Paroxysmal cold hemoglobinuria Donald-Landsteiner antikropp anti-p som binder till P-antigenet. Ex Treponema pallidum (syfilis), haemofilus influenza och mycoplasma pneumonia ( anti-i) 'Paroxysmal Nocturnal Haemoglobinuria Decay accelerating factor (Decay,To break down into component parts) Komplement decay-accelerating factor CD55 Ökar nedbrytning av C3konvertaset.C3bBb blockerar bildning av MAC. Cromer blodgrupp DAF fungerar som receptor för Echovirus och coxsackie B viruses Vid testning med gelteknik används kolonner med AHG i Matrixet vilket eliminerar behovet av tvättfas. Metoden kräver inte kontroll av negativa resultat Provlösningen och icke bundet immunglobulin blir kvar i reaktionskammaren

6 Förstärkningsteknik för svaga antikroppar PEG (AHG måste vara anti-igg Uppvärmning Eter Surgörning För bestämning av feto-maternell blödning (för att bestämma mängden anti-d, Rhprofylax) Kvantifiering av anti-d hos immuniserad moder Genotypning av foster Transfunderade patienter Serologiska problem Screening av blodgivare Standardisering av celler för testpaneler (dos) DAT positiva celler För att förutsäga risken för HDFN. Vanligast vid RhD men även Rhc ock K DNA från amniocyter, celler från korionvilli, fetalt DNA ur maternellt blodprov

7 För att kunna erbjuda korrekt matchat blod till patienter med kroniskt transfusionsbehov (dvs patienter med hemoglobinopatier) För att bestämma RhDvarianter För att bestämma AB0grupp vid avvikande serologiska testresultat För att lösa serologiska oklarheter Tex erytrocytgruppering A men serum gruppering visar anti-a För att finna givare med speciella blodtyper där tillförlitliga testsera saknas eller är mycket sällsynta T.ex. Dombrock. För att bestämma zygotin hos celler för användning som testerytrocyter tex normaltypade Fy(a+b-) kan vara Fy a Fy a Fy a Fy eller Fy a Fy x Prover som inte kan typas serologiskt pga att erytrocyterna är sensibiliserade (coatade, mantlade) med IgG in vivo Fostererytrocyter som bundit IgG1 eller IgG3 ak bryts ned och frisätter hemoglobin Bilrubin, kan mätas i fostervätskan efter en amniocentes. Bilrubin kernikterus Mer exakta data genom att mäta B-Hb och B- EVF direkt hos fostret EVF bör vara 0,35-0,40 Dopplermätning av blodflöde (ökad hjärtminutvolym vid anemi)

8 Blodkomponenter Blodgruppering AB0 och Rh x 2 med två olika reagens Ak-undersökning på serum från modern DAT på barnets blodkroppar Finns antikropp skall förprov göras med givarblodet och serum från modern Ge 0positivt Rh negativt blod. Om barnet är DAT positivt måste orsaken utredas genom jfr undersökningar på mor och barn Leukocytfiltrerat och bestrålat och lagrat mindre än 5 dagar

9 Kvantifiering av ak Monocyt monolayer assay MMA Chemilumiscenstest CLT Antibody Dependent cell-mediated Cytotoxity ADCC Märkning av givarblodet med Cr 51 och ge 0,5-1,0 ml och mäta överlevnaden, utgångsvärde, efter 10 och 60 minuter (Görs sällan) Testet mäter den antikroppsmedierade frisättningen av C3 51 från testblodkroppar som hemolyserats med lymfocyter eller monocyter som effektorceller Mäter effektorcellernas adhesion och fagocytos av de IgGklädda cellerna i närvaro av luminol,resultatet uttrycks i % av ett monocytsvar på en positiv kontroll. Värden över 30% indikerar en moderat till svår fosterpåverkan Anti-K i låg titer kan ge en svår HDFN genom att bryta ned de tidiga förstadierna till erytrocyter Liten mängd hemoglobin och bilrubin i fostervattnet Alloimmunisering med K-antigen svarar för ca 10 % av alla allvarligt påverkade foster Monocyter separeras frå n patienten och blandas med antikroppsklädda erytrocyter

10 55 56 Patienter som kommer att kräva transfusioner under lång tid bör blodgrupperas med avseende på fenotyp för alla de viktigaste blodgruppssystemen. Använd molekylärbiologisk teknik. Tex Thalassemier, HbS, THE BRISTOL INSTITUTE FOR TRANSFUSION SCIENCES and THE INTERNATIONAL BLOOD GROUP REFERENCE LABORATORY Welcome to the International Blood Group Reference Laboratory and the Bristol Institute for Transfusion Sciences. Sited in Bristol, England, IBGRL and BITS are National Blood Service laboratories. The IBGRL was established in 1946 to provide Reference Services related to blood transfusion. In 1952, the IBGRL was designated a collaborating centre for the World Health Organisation. One of IBGRL s functions is to maintain a database of donors with rare blood types. Authorized laboratories can interrogate the International Rare Donor Panel directly via this web site. The IBGRL has a distinguished record of research in blood transfusion science. Some of this research has led to the generation of a range of monoclonal antibodies which are available to researchers around the world as IBGRL Research Products Sensivitet är antalet erhållna positiva resultat jämfört med antalet sant positiva resultat Specificitet är totala antalet negativa resultat jämfört med antalet sant negativa resultat Metod jämförs med metod som fått epitetet Guldstandard Negativt prediktivt värde (npv) är ett begrepp inom statistiken som definieras som andelen av de som testas negativa för en sjukdom som verkligen är negativa. Det negativa prediktiva värdet beror på prevalensen i populationen, en hög prevalens ger ett lågt npv

11 Positivt prediktivt värde (ppv) är ett begrepp inom statistiken som definieras som andelen av dem som testas positiva för en sjukdom som verkligen är positiva. Det positiva prediktiva värdet beror på prevalensen i populationen, en hög prevalens ger högt ppv. Bredare antigensprofil som kan varieras beroende på lokala skillnader, tex Di a och Mur Som är sällsynt bland europeer och afrikaner men har en frekvens på 5 % hos kineser och japaner och upp emot hos 54 % hos Brasiliens Kainganges indianer. Mur antigenet finns hos mellan 5-10 procent i Kina. Anti Di a förekommer hos 3,5 % av alla multitransplanterade i Brasilien och kan orsaka svår HDFN (komplementaktiverande) Nej Halveringstid för tillfört anti-d är dagar Genom att utvälja testceller som är negativa för all möjliga antigen utom ett Reagerar bara med de erytrocyter som har antigener med mer än en specificitet kodade av samma gen Tex anti-f som reagerar med celler som uttrycker c och e antigener på samma proteinkedja. Reagerar alltså med DCe/dce men inte DCe/DCe eller DCe/DcE Tex anti-k + anti-jka + anti-s K negativ incidens 0.91, Jka negativ incidens 0.23, SW negativ incidens 0,48 0,91x0,23x 0,48 = 0,1 eller 1 på

12 Patientens totala med transfusioner under mindre än 24 timmareller en akut ersättning av halva den uppskattade blodvolymen per timme blodvolym har ersatts Om man har eller haft irreguljära erytrocytantikroppar av klinisk betydelse När metoden för ak-screening inte uppfyller krav på känslighet Patient som fått ABO inkompatibel organtransplantation inom tre månader Foster eller nyfödda som transfunderats på grund av alloimmun sjukdom Speciell uppmärksamhet för patienter tillhörande populationer med antigen som markant skiljer sig från befolkningen i allmänhet Feber > 38C Il 6 från T-celler o mastceller till hypothalamus Frysningar Ångest, ländsmärtor Blodtrycksfall (anafylatoxiner, histamin) Bakteriell kontamination eller feltransfusion Klåda Urtikaria Blodtrycksfall Feber Anafylaktisk reaktion med chock Dyspne (andnöd) Blodtrycksstegring Transfusionsrelaterad akut lungskada Trasiga cellmembran, granulainnehåll från leukocyter

13 Avbryt transfusionen Håll fri ven väg Kontrollera vitalfunktioner medvetande, andning, blodtryck Rätt blodenhet? Meddela medicinskt ansvarig läkare Meddela blodcentral, behov av akut provtagning? Dialys, antibiotika, venesectio, aferes