Screening av fetalt RHD i maternell plasma. Åsa Hellberg BMA, PhD Klinisk immunologi och transfusionsmedicin Labmedicin Skåne

Transkript

1 Screening av fetalt RHD i maternell plasma Åsa Hellberg BMA, PhD Klinisk immunologi och transfusionsmedicin Labmedicin Skåne

2 När används blodgruppsgenomisk typning? oberoende analys vid oklara serologiska resultat alternativ till fenotypning om patienten har fått blod (s.k. transfusionsblandbild) eller är positiv med direkt agglutinationsteknik (DAT) bekräftelse av homozygoti hos: givare av testerytrocyter, den blivande pappan för att bedöma risken att fostret kommer att ärva antigenet som mamman är immuniserad mot. alternativ när blod ej finns tillgängligt bestämning av fosterblodgrupp foster till immuniserad, gravid kvinna foster till RhD neg, gravid kvinna cellfritt fetalt DNA cffdna

3 Bakgrund cffdna Volume 350, Issue 9076, 16 August 1997 Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum Dennis Lo et al. Påvisades DNA från Y-kromosomen 1998 påvisades RHDpos DNA i RhD neg gravida kvinnor Tidigare krävdes fostervatten eller CVS för att kunna undersöka fostrets blodgrupp

4 Fetalt DNA (cellfritt fetalt DNA, cffdna) huvudsakligen från placenta, trofoblaster fragmenterat (<200bp) utgör 5-20% av det cellfria DNA riklig produktion snabb metabolisering mätbar koncentration v 5 ej detekterbart post-partum (1-2 dagar) Undantag enl. Invernizzi et al Hum Genet 2002;110:587 Bild från wiki common

5 Provtagning Plasma versus amnion/cvs Lättare provtagning Billigare provtagning Lättare att upprepa Ingen ökad risk för missfall ökad immunisering av modern

6 Applikationer cffdna Kan användas för prediktion av: Fetal blodgruppsstatus Trisomier Kön och könsbundna sjukdomar Andra ärftliga monogena sjukdomar Thalassemi Sjukdomar varvid ökade koncentrationer av fetalt DNA föreligger Havandeskapsförgiftning (preeklampsi) Prematur födelse (Jakobsen, Clausen et al. High levels of fetal DNA are associated with increased risk of spontaneous preterm delivery Prenat Diagn Apr;32)

7 Svårigheter cffdna Låg DNA-koncentration Krävs: Realtids-PCR NGS (Next Generation Sequencing) Trisomi-bestämning

8 Svårigheter cffdna Begränsad transporttid (>24-48h) + prov transporteras i RT + förvaras i RT/kyl + EDTA-rör - minskar fraktionen fetalt DNA

9 Immunisering Kliniskt relevanta antigen: RhD Rhc RhE Kel Risk* 15% 1-3% 1-2% Uppstår vid: förlossning invasiv diagnostik under graviditet Inkompatibel blodtransfusion 85% * För RhD-immunisering om profylax ej ges

10 Immunisering Risker vid immunisering fetal anemi fetal hjärtsvikt fetal hyperbilirubinemi intrauterin fosterdöd

11 Risker vid immunisering anemi hjärtsvikt hyperbilirubinemi intrauterin fosterdöd Hur många drabbas? 15% är RhD-negativa 60 % av dessa bär ett RhD-positivt barn 1-2% blir immuniserade 1/3 immuniserade under pågående graviditet graviditeter/år

12 Immunisering Risker vid immunisering anemi hjärtsvikt hyperbilirubinemi intrauterin fosterdöd Hur många drabbas? 15% är RhD-negativa 60 % av dessa bär ett RhD-positivt barn 1-2% blir immuniserade 1/3 immuniserade under pågående graviditet graviditeter/år Hur många blir allvarligt påverkade? behöver blod som foster och/eller nyfödd ett fåtal foster dör

13 RhD-profylax RhD-profylax 1968 USA 1969 Sverige, efter förlossning och vid invasiva ingrepp i många länder ges det även v29-30 till alla RhD-neg kvinnor tillverkas av human plasma anti-d av IgG typ

14 Analys av fosterblodgrupp cffdna 2001 RHD & SRY, IBGRL, Bristol 2003 RHD, Sanquin, Amsterdam 2004 RHD, NRLGBT, Lund Analysen används för kvinnor som är Immuniserade Sanquin Bristol Lund RHD v 9 v16 v16 RHc v 9 v16 v16 RHC - v16 RHE v 9 v20 K1 v 12(v18) v20 HPA1a v 16

15 RHD-screening projekt, Stockholm 2010 Danmark 2011 (0701) Nederländerna 2013 projekt Bristol/UK 2014 Finland 2016 (0901) Norge Test v 8 (7) nu 10 (8) Profylax v 29 & postnatalt 5 olika center Test v 25 Profylax v 29 & postnatalt Nationellt center Test v 27 Profylax v 30 & postnatalt Nationellt center Test v 12 Profylax v 29 & postnatalt Nationellt center Test v 24 Profylax v 30 & postnatalt 4 olika center (Oslo, Trondheim) Test v 24 Profylax v 28 & postnatalt

16 RHD-screening projekt, Stockholm Test v 8 (7) Profylax v 29 & postnatalt 5 olika center Riktad profylax till endast de kvinnor som bär Test påv RHD-positiva 25 foster. Profylax v 29 & postnatalt 2010 Danmark I länder där profylax tidigare gavs till alla RhD Nationellt negativa center kvinnor undviks nu profylax att ges till 40%. Test v 27 Profylax v 30 & postnatalt Juli 2011 Nederländerna 2013 projekt Bristol/UK 2014 Finland 2016 Norge Nationellt center Test v 12 Profylax v 29 & postnatalt Nationellt center Test v 24 Profylax v 30 & postnatalt olika Test v XX Profylax v XX & postnatalt

17 RHD-screening Skåne och Blekinge Test v 10 (8) Profylax v 29 & postnatalt Analys inom 5 dagar

18 RHD-screening Skåne och Blekinge Halland Test v 10 (8) Profylax v 29 & postnatalt Analys inom 5 dagar

19 RHD-screening DNA-extraktion, Klinisk Virologi, Lund MagNA Pure LC DNA isolator Roche Realtids-PCR med RHD-kit Real time PCR ABI Prism SDS 7000

20 RHD-screening EDTA-rör in, realtidsplatta ut Fil med plattlayout Realtids-PCR med RHD-kit (Devyser) Fil med plattlayout Analys tolkas: 2 personer (BMA) Svar läggs in: 2 personer (BMA) Analys godkänns: 1 person (läkare) Real time PCR ABI Prism SDS 7000

21 RHCE/RHD Pseudogen Ψ Orsak till 66% RhD neg fenotyp i Afrika Orsak till 15% RhD neg fenotyp i Afrika Singleton et al., Blood 2000

22 RHCE/RHD 96,4% likhet Pseudogen Ψ Orsak till 66% RhD neg fenotyp i Afrika Orsak till 15% RhD neg fenotyp i Afrika Singleton et al., Blood 2000

23 Real-time PCR GAPDH RHD

24 Real-time PCR GAPDH