Alternativa metoder för att påvisa antibiotikaresistens. Håkan Janson



Relevanta dokument
Equalis kvalitetssäkringsprogram 2018

Mekanismer för antibiotikaresistens

Antibiotikaresistens. Christian G. Giske Docent / BÖL Klinisk mikrobiologi Karolinska Universitetssjukhuset 14 mars 2012

Isolering av bakterier Diskdiffusion E-test och utvidgad resistensbestämning Vid multiresistenta fynd - anmälning till vårdhygienen.

Antibiotikaresistens

Aktuellt resistensläge Helena Sjödén och Torbjörn Kjerstadius Klinisk mikrobiologi

KAD-associerad UVI hos 70-årig man med prostatacancer.

Klimatförändringen en drivkraft för vattenburen smitta? Ann-Sofi Rehnstam-Holm Högskolan Kristianstad

Resistensläget hos Urinvägspatogener i Region Örebro län. Martin Sundqvist Överläkare, PhD Lab medicin, Mikrobiologi, USÖ STRAMA dag

Antibiotikaresistens 2018 Blekinge och Kronoberg. Klinisk mikrobiologi för Blekinge och Kronoberg

Implementering av en ny ESBL-definition

Bakteriella resistensmekanismer och antibiotikaresistens på akutsjukhus i Stockholms län Christian G. Giske

Vad är ESBL? Ett hotande resistensproblem bland gramnegativa bakterier?

Antibiotikaresistens

Antibiotika verkningsmekanismer. Christian G. Giske Biträdande överläkare / Med Dr Klinisk mikrobiologi Karolinska Universitetssjukhuset 18 mars 2010

Antibiotikaresistens. Tinna Åhrén Regionala Strama, Västra Götalandsregionen

Antibiotikaresistens 2017 Blekinge och Kronoberg. Klinisk mikrobiologi för Blekinge och Kronoberg

Antibiotikaresistens orsaker konsekvenser - åtgärder

Staphylococcus aureus sårisolat aggregerade data från ResNet

STRAMA-dag Långdragna sår gör AB nytta? Provtagning och resistensförhållanden Eva Törnqvist, Mikrobiologen, USÖ

Antibiotikaresistensur ett vårdhygienperspektiv!

1 (5) RESISTENSLÄGET I KALMAR LÄN JULI-DECEMBER 2014.

Antibiotikaresistens i blododlingar

KAD-associerad UVI hos 70-årig man med prostatacancer.

MRB multiresistenta bakterier. Smittskydd Värmland

Bakteriologisk diagnostik av urinodlingar och resistensläge för viktiga urinvägspatogener

Antibiotikaresistens i blododlingar

Antibiotikaresistens i blododlingar

Antibiotikaresistens i Blekinge och Kronoberg Klinisk mikrobiologi för Blekinge och Kronoberg

Antibiotikaresistens i blododlingar

Bli en antibiotikasmart doktor! Basutbildning för läkare 10 november 2015

Antibiotikaresistens i blododlingar

Kommentarer till resistensläget 2012

RESISTENSLÄGET I KALMAR LÄN FÖRSTA HALVÅRET 2015.

Resistensåterkoppling Värmland STRAMA-möte 19/

Antibiotikaresistens i blododlingar

ESBL, VRE och tarmpatogener bland friska förskolebarn i Uppsala

Antibiotikaresistens i blododlingar

Anmälningspliktiga resistenta bakterier (ARB) MRSA, VRE, ESBLcarba och ESBL

Antibiotikaresistens i blododlingar

Antibiotikaresistens i Uppsala län och Sverige

MultiResistenta Bakterier. ESBL ESBLcarba. tarmbakterier VRE MRSA PNSP

Antibiotikaresistens i Region Skåne

Epidemiologiska resistensdata minimini-pricklista

Infektioner hos äldre

Antibiotikaresistens i blododlingar

En värld utan antibiotika - ett troligt framtidsscenario?

Anmälningspliktiga resistenta bakterier (ARB) MRSA, VRE, ESBLcarba och ESBL

Antibiotikaresistens i Region Skåne

Smittskyddsdag Hudiksvall Gävle. Smittskydd, Vårdhygien, Kliniskt Mikrobiologiskt Laboratorium

MRSA, VRE och ESBL. 11 november Lokalt smittskyddsansvariga inom primärvården. Ulla-Britt Thollström (Anna Hammarin) Smittskydd Stockholm

Selektion av resistenta bakterier vid väldigt låga koncentrationer av antibiotika.

Ackrediteringens omfattning Unilabs AB, Laboratoriemedicin, molekylärbiologi 1329

Antibiotikaresistens i blododlingar

RESISTENTA BAKTERIER MRSA, VRE, ESBL och ESBLCARBA

Kommentarer till resistensläget jan-juni 2014

Kliniskt viktig antibiotikaresistens. Martin Sundqvist Överläkare, PhD Lab medicin, Mikrobiologi, USÖ STRAMA

Ackrediterade analyser klinisk mikrobiologi

REFERENSLABORATORIEVERKSAMHET

Alexander Fleming Nobelföreläsning 1945

Hur kan vi behandla infektioner med MDR gramnegativa bakterier? Kombinationsbehandling och tester info r detta?

Antibiotikaresistens. Martin Sundqvist Överläkare, PhD Lab medicin, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro STRAMA-utbildning Långholmen

Komponent/Undersökning System/Provtyp Metod/Mätprincip Utrustning Enhet

Snabb resistensbestämning. Martin Sundqvist leg läk, MD Avd för klinisk mikrobiologi, Växjö

JA! Antibiotika resistens Är multiresistenta bakterier verkligen ett hot? Rapport 2009

AMA + SMA AMASMA SST rör gul kork

Växt/ Ingen växt Respektive Bakterier/ Ej. bakterier - CFU <15 CFU CFU >100 CFU. - CFU/mL 1x10 3-1x10 4 1x10 4-1x10 5 >1x10 5

ESBL i Norden (men fokus på Sverige)

Antibiotikaresistens i blododlingar

Gymnasieskolan Knut Hahn Projektrapport - Anna Goos

Multiresistenta bakterier en enkel resa till Eländet

ESBL och ESBL-carba ofarlig kolonisering eller ett folkhälsoproblem?

Ackrediteringens omfattning

Analyser klinisk mikrobiologi, centrallaboratoriet Aleris Medilab

Antibiotikaresistens Vad innebär r det i praktiken? Professor Inga Odenholt Infektionskliniken Malmö

Multiresistenta bakterier

Ackrediteringens omfattning Unilabs AB, Laboratoriemedicin, molekylärbiologi

Statens jordbruksverks författningssamling Statens jordbruksverk Jönköping Tfn

Snabb Resistensbestämning med disk diffusion. Emma Jonasson

Ackrediterade analyser klinisk mikrobiologi

Antibiotikaresistens en fara för folk och fä. Christina Greko Strama VL Djurhälsa och antibiotikafrågor

Ackrediterade analyser klinisk mikrobiologi

Karbapenemasdetektion med MALDI-TOF. Martin Sundqvist MD, PhD Laboratoriemedicinska länskliniken, Klinisk Mikrobiologi Universitetssjukhuset Örebro

Bakteriologisk odling

Smittskyddsdagen Smittskyddsenheten

ESBL-resistens hos tarmbakterier. Förslag till åtgärdsprogram Bakgrundsdokument December 2007

Växt/ Ingen växt Respektive Bakterier/ Ej. bakterier - CFU <15 CFU CFU >100 CFU. - Växt/ Ingen växt - Kalmar

Kommentarer till resistensläget jan-maj 2012

MALDI-TOF - vad är nytt? Åsa Johanson, leg BMA Klinisk Mikrobiologi, Växjö

Metod/Mätprincip Utrustning Enhet Lab/Ort Bihålesekretodling Sekret Speciell odling/ VITEK MS Biomerieux Växt av/ingen växt

Arbetsgrupp preanalys LmD Vera Thorén Bengtsson 1

Ackrediteringens omfattning Aleris Medilab, Klinisk mikrobiologi, Täby

EQUALIS användarmöte patientnära analyser Sara Karlsson Söbirk Klinisk mikrobiologi Lund / Infektionskliniken Helsingborg

Diagnostik vid bakteriella infektioner Christian G. Giske

Rekommendation för laboratoriediagnostik och bärarscreening av karbapenemasproducerande gram-negativa stavar

Riskprofil Livsmedel som spridningsväg för antibiotikaresistens

MRSA Antalet fall har ökat och är det högsta hittills i Dalarna. 15 är smittade i Sverige, resten utomlands.

Sveriges åtgärdsprogram mot ESBLresistens. Karin Tegmark Wisell, MD PhD Sektionschef antibiotikaresistens och vårdhygien Smittskyddsinstitutet

ESBL. Rubrik. Morgondagens normalflora? Underrubrik. Torsten Sandberg. Infektion. Sahlgrenska Universitetssjukhuset. Infektion

Clostridium difficile diagnostik. Lucía Ortega Klinisk Mikrobiologi Växjö

Transkript:

Alternativa metoder för att påvisa antibiotikaresistens Håkan Janson

Traditionell resistensbestämning Fenotypisk testning Lappdiffusion Buljongspädning Detektion med utodling (Golden standard) Detektion med fotometri Detektion med fluorofotometri Detektion med turbidometri (VITEK) Detektion med kalorimetri Agarspädning

Begränsningar med fenotypisk testning Ett stort inokulat i renkultur krävs Komplicerad preanalytisk process Begränsat organism-spektrum Analytisk variabilitet Lång tidsåtgång Relativt hög kostnad (om man inkluderar alla steg)

Molekylär resistensbestämning PCR för enstaka kända resistensgener Makrolider (erytromycin, klaritromycin etc) Meticillinresistens (meca, mecc) Vancomycinresistens (vana, vanb) Enstaka betalaktamaser (tex utbrott av ESBL) Multiplex-PCR ev medmicro-array om man letar efter flera Aminoglykosider, tetracyklin, betalaktamer, kloramfenikol, erytromycin, kinoloner, sulfa, trimetoprim, rifampicin, isoniazid ESBL av olika slag ESBL-CARBA av olika slag

Begränsningar med molekylär resistensbestämning Vissa analyser är enkla meca, vana, vanb, Andra är mer avancerade (ESBL mm) Somliga är mycket svårtolkade (porin-mutationer etc) Ofta måste man sekvensera PCR produkter Det är svårt att avgöra om genen uttrycks eller ej Kan inte detektera alla resistensmarkörer Hög kostnad Inte allmänt accepterade

Resistensbestämning av bakterier vi inte odlar Antalet agens vi detekterar med molekylärbiologiska metoder ökar Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Clostridium difficile MRSA, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, EHEC Hur hanterar vi resistensbestämningen av dem?

Makrolidresistens är ett icke försumbart problem I arter som Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae Helicobacter pylori Chlamydia trachomatis Arterna är svåra att odla men lätta att detektera med PCR Makrolidresistens kan detekteras med PCR med hög känslighet och specificitet

Traditionell Helicobacter pylori detektion och resistensbestämning Relevant när man misstänker terapisvikt Odling av biopsi från magslemhinnan Resistensbestämning mot Claritromycin, Metronidazol och Amoxicillin Resistensen är ibland svår att läsa av Bl a pga mögelöverväxt

Helicobacter pylori detektion och claritromycin resistensbestämning 23S rrna genen Realtids-PCR detektion Smältpunktsanalys avgör claritromycinkänsligheten Mutationer

Funderingar kring gonokocker (enligt Cathy Ison) Hur ska man kombinera resistensbestämning och molekylärbiologi för gonokocker? Endast 54% av PCR-fynd kunde konfirmeras med odling 72% av de med symptom kunde konfirmeras med odling Patientnära test på inmarsch GeneXpert för GC/CT har bra känslighet (Tabrizi J Clin Micro 2013) Man måste behålla odlingsexpertisen för att kunna övervaka resistensutvecklingen. Sentinelprovtagning för odling under 3 mån/år kan vara en lösning För bedömning av behandlingssvikt fungerar inte PCR utan där måste man odla och resistensbestämma

Andel MRSA 2011 Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net)

MRSA-förekomst i Sverige Antal MRSA i Sverige (från SMI:s hemsida)

MRSA-screening i realtid Halmstadsmodellen Anrikning i selektiv buljong DNA-extraktion Kvantifiering av S. aureus-specifik gen På vissa lab även meca-gen På andra MRSA med SCCmec Besvaring av PCR-negativa prov efter 1 dygn Utodling av PCR-positiva prov

MRSA screening i Skåne mecc (LGA251) = en ny variant av mec gen som vi fn inte hittar i molbiol screening. Därför odlas alla buljonger med mycket S. aureus ut

Måste vi överhuvudtaget odla MRSA? Med mec och nuc metod JA meca finns även i andra stafylokockarter -> blandningar av MRSE och MSSA blir falskt positiva Med Huletsky-metoden dvs SCCmec JA

SCCmec fallgropar Nya SCCmec-varianter kommer att bli falskt negativa Kända MRSA-stammar kan mutera och bli methicillin-känsliga men ändå förbli PCR-positiva

Snabbare MRSAscreening som kan utföras lokalt Cepheid GeneXpert eller motsvarande Låg sensitivitet (61%) och PPV (38%) enligt Roisin 2012 Eur J Clin Microbiol

Vancomycinresistenta Enterokocker (VRE) Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net)

Vancomycinresistenta enterokocker (E. faecium och E. faecalis) Två olika resistensgener vana Resistent mot både Vancomycin och Teicoplanin vanb Resistent mot Vancomycin men känsligt för Teicoplanin vana/b gener kan bäras av många andra bakteriearter (Clostridium, Bacillus, Eggerthella m fl) Dessa är ej anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen

Antal VRE i Sverige Specifika kloner orsakar då och då stora utbrott Antal VRE i Sverige 700 600 500 400 300 200 100 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

VRE - buljonganrikning

Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner 2004

Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner 2011

Kan man detektera ESBL (Extended Spectrum BetaLactamases) med PCR? ESBL A Klassisk ESBL som hämmas av betalaktamasinhibitor (> 100 varianter av t ex CTX-M, SHV, TEM-typ) ESBL M Betalaktamas av AmpC- eller OXA-typ. Många varianter. Hämmas av oxacillin men inte av betalaktamasinhibitorer ESBL - Carba Den värsta sorten eftersom dessa även är bryter ned karbapenemer (imipenem, meropenem)

ESBL-CARBA Icke metallobetalaktamaser Klass A KPC (USA, Israel, Grekland), SME, IMI, NMC, GPC Klass D (OXA-enzymer) OXA-48 (Turkiet, mellanöstern, nordafrika), OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58 Metallobetalaktamaser (Klass B) NDM (Indien, Pakistan) VIM (endemisk i Grekland, spridd i världen) IMP (19 varianter spridda i världen), GIM, SPM, SIM Många ESBL-stammar är multiresistenta Vissa ESBL-Carba är totalresistenta

Andel Klebsiella pneumoniae som har nedsatt känslighet för karbapenemer 2011

Andel Klebsiella pneumoniae som är resistenta mot 3:e generationens cefalosporiner 2011

ESBL screening direkt från rektal-swab med multiplex PCR Fungerar rent tekniskt bra Anrikning behövs ej men bör DNA extraheras Färgad pinne bättre än faeces Hittar bara de varianter man letar efter Hittar inte nya varianter Bra vid utbrott av en given klon Detekteras med specifik PCR mot just den ESBLvarianten

Fenotypisk resistensbestämning Metod Princip < 10 5 Agarspädning Automatisk resistenstest Icke-växt på media innehållande olika abkoncentrationer Buljongspädning Optisk mätning av tillväxt i substrat Växtinhibition i buljong innehållande olika abkoncentrationer cfu Billig Autom atisk Hetero gen res Äkta MIC Snabb Nej Ja Nej Ja Ja Nej Nej Ja Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja Nej Diskdiffusion Inhibition runt en ab-disk Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Nej E-test Inhibition runt en remsa med ab-gradient Nej Ja Ja/Nej Ja Ja Nej

Annan befintlig resistensbestämning Metod Princip < 10 5 Kromogena agarsubstrat Fluoroscerande färgning PCR Realtids mikroskopi Färgomslag när en produkt bryts ner Mikroskopi av levande/döda celler i närvaro av fluroforer DNA amplifiering av resiistensgener Filmande av bakteriers delning cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Snabb Nej Ja/Nej Nej Ja Nej Nej Ja Ja Nej Nej Nej Ja Ja Ja/Nej Ja/Nej Nej Nej Ja Ja Ja Nej Nej Nej Ja

Nära förestående resistensbestämning Metod Princip < 10 5 Cantilever teknologi Mikrokalorimetri Flödescytometri Spinn av magnetiska kulor MALDI-TOF MS Mikrodroppar Helgenomsekvensering Detektion av värmeproduktion Vägande av bakterier med cantilever vibrationer Detektion av levande/döda celler Olika spinn beroende på hur många bakterier som fastnat Detektion av abdegradering + mönster Tillväxt eller substratkonversion i nl droppar Sekvensering av hela genom cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Snabb Ja? Ja Nej Ja Ja/Nej Ja? Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej? Ja Nej Nej Ja/Nej Nej Ja Ja Nej Nej Ja/Nej Ja? Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja/Nej Ja Nej Ja Nej Nej Nej

Isoterm mikrokalorimetri Man mäter värmeproduktionen/reduktion över tid (t ex när bakterier tillväxer) Tekniken beskrevs 1780 (is i ett utrymme smälte snabbare ju större djur man lade i) Första artikeln är från 1918 (Hill) Svenskar bakom den moderna designen (Wadsö 1968) Torvald Ripa använde mikrokalorimetri för att mäta vilka tillsatser som var bäst för blododlingar (1977)

Design

Man mäter: Värmeflöde i mw Energi i Joule (W x s) P = E / t W = J / s

Exempel på resultat

Mycket bra korrelation med buljongspädning dock ej mycket snabbare Von Ah et al, BMC Microbiology 2009, 9:106

Helgenomssekvensensering av framvuxna bakteriestammar Billigt, enkelt och snabbt Det kostar idag ca 60 euro för ett bakteriegenom Kan göras på små bordsinstrument Resultat inom 24 timmar Resultat kan användas till Typning och resistensbestämning (se Eyre 2012 BMJ Open) 95% sensitivitet och 95% specificitet på ab-bestämning 99,7% konkordans mellan fenotypisk AST och WGS AST (Zankari JAC 2013 på 200 stammar och 3051 tester) Utesluta släktskap hos fenotypiskt lika stammar (se Köser 2012 NEJM) Fastställa spridningsvägar både lokalt och globalt

Problem med helgenomssekvensering Avancerade förberedelser Dyrt om man kör få prov Genererar enorma mängder data Svårt för lekmän att analysera resultat Automation är nödvändig

ResFinder - Gratisverktyg för analys Databas med kända resistensgener On-line mjukvara som gör en BLAST sökning gentemot databasen Färdiga helgenom Ofärdiga helgenom Korta eller långa sekvenser www.genomicepidemiology.org

ResFinder hittar vad den skall bland redan sekvenserade bakteriegenom

Test av ResFinder (och MLST) 200 isolat (50 var av E. coli, S typhimurium, E. faecalis, E. faecium) isolerade från danska grisar 3051 fenotypiska test gjordes 482 blev resistenta 2569 blev känsliga Konkordans 99,74% 7 skilde sig mellan fenotyp och genotyp (6 st var streptomycin i E. coli) MLST och resistensprofil korrelerade dåligt (förutom för Salmonella typhimurium). Resistensmönster är alltså inget särskilt bra epidemiologiskt verktyg Zankari et al. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 771 777

Resistensbestämning som kan komma Metod Princip < 10 5 Bakteriefag amplifiering Apoptosmarkörer Flödescytometri Kolorimetrisk detektion av respiration Elektroniska näsor Impedans Infraröd spektroskopi Detektion av apoptosmarkörer Detektion av fagreplikering i levande celler Detektion av levande/döda celler Optisk detektion av cell respiration Detektion av flyktiga organiska ämnen Elektrisk skillnad mellan levande och döda celler Absorptionsspektrum av bakterier under IR-ljus cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej Nej Ja Snabb Ja Ja/Nej Nej Nej Nej Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Ja/Nej Ja/Nej Ja Ja Ja Nej Nej Ja Nej Ja Ja Nej Ja Ja Nej? Ja Nej Nej Ja/Nej Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Nej Ja/Nej

Resistensbestämning som kan komma 2 Metod Princip < 10 5 LC-ESI MS Metabolomics (inkl ROS) Mätning av mikroljud NMR Raman spektroskopi RNA sekvensering Proteomics av levande döda celler samt resistensmarkörer Förändringar i intracellulära molekyler Skillnader i vibrationer mellan levande och döda bakterier Molekylär uppsättning med magnetresonans Absorption hos laserstrålade bakterier cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Snabb Nej Nej Ja Nej Nej Ja/Nej Nej? Ja Nej Nej Ja Ja? Ja Nej Nej Ja/Nej Nej? Ja Nej Nej Nej Ja Ja Ja Ja/Nej Nej Ja/Nej Skillnader i genexpression Ja Nej Ja Nej Nej Nej

Konklusion ett Fenotypisk antibiotikaresistenbestämning kommer att förbi essentiellt för att: Hitta nya resistensmekanismer Detektera kombinationer av icke resistensgener som leder till fenotypisk resistens (efflux, poriner) Hitta känsliga stammar hos de som bär på resistensmarkörer

Konklusion två Molekylära resistensmetoder är ett viktigt komplement För enkel detektion av vissa markörer/kloner För potentialen i helgenomsekvensering Många nya spännande alternativa metoder är på gång Det kan dock ta flera år innan de är i rutinbruk på lab Ett undantag är MALDI-TOF