Örebro Universitet Institutionen för hälsovetenskap och medicin Enheten för klinisk medicin Program: Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin Kurs: BMLV C, Biomedicinsk laboratorievetenskap, Examensarbete, BL1701 Datum: 2015-05-25 Absolut kvantifiering av DNA från Streptococcus pneumoniae och Escherichia coli i blodprover från sepsispatienter med hjälp av Droplet Digital PCR-teknik Författare: Magdalena Forsberg Handledare: Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
SAMMANFATTNING I Sverige avled under 2013 sammanlagt 1042 personer i sepsis (blodförgiftning) orsakad av olika bakteriella agens. Golden standard för diagnostik av sepsis är blododling, men med polymerase chain reaction (PCR) kan man detektera genetiskt material från bakterier i blodet hos patienter. Mängden deoxyribonukleinsyra (DNA) i patientens blod har visat sig ha betydelse för hur allvarlig sjukdomen är. Med droplet digital PCR (ddpcr) delas PCR-reaktionen upp i ca 20000 oljedroppar som efter PCR kan läsas i en flödescytometer som positiva eller negativa. Syftet var att sätta upp en metod för kvantifiering av Streptococcus pneumoniae och Escherichia coli i helblod från patienter med sepsis orsakad av dessa bakterier för att följa DNA-mängden under sjukdomsförloppet. Bakteriellt DNA extraherades från patientprover och analyserades med ddpcr. För patienter med sepsis orsakad av S. pneumoniae var 40% positiva för bakteriellt DNA i minst ett prov, medan siffran för E. coli var 60,7%. Bakteriellt DNA kunde påvisas för båda agens upp till dag 7. Att följa bakteriemängd skulle lämpa sig i klinisk verksamhet för att bedömma hur allvarlig patientens infektion är, samt för att utvärdera behandlingseffekt. Nyckelord: Sepsis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, ddpcr
INNEHÅLLSFÖRTECKNING BAKGRUND... 1 Sepsis... 1 Streptococcus pneumoniae... 1 Escherichia coli... 2 Polymerase chain reaction... 2 Realtids-PCR... 3 ddpcr... 4 SYFTE... 6 MATERIAL OCH METOD... 6 Provmaterial... 6 DNA-extraktion... 7 Optimering av ddpcr för Streptococcus pneumoniae... 8 ddpcr på patientprover med Streptococcus pneumoniae... 9 Optimering av ddpcr för Escherichia coli... 10 ddpcr på patientprover med Escherichia coli... 11 RESULTAT... 11 Optimering av ddpcr för Streptococcus pneumoniae... 11 ddpcr på patientprover med Streptococcus pneumoniae... 13 Optimering av ddpcr för Escherichia coli... 15 ddpcr på patientprover med Escherichia coli... 17 DISKUSSION... 20 REFERENSER... 23
BAKGRUND Sepsis Sepsis, eller blodförgiftning, innebär en okontrollerad systemisk aktivering av immunförsvaret till följd av en infektion, och definieras med hjälp av fyra kliniska kriterier (1). Kriterierna för en sepsis är att kroppstemperaturen överstiger 38 C eller understiger 36 C, att pulsen överstiger 90 slag per minut, att andningsfrekvensen är högre än 20 andetag per minut, samt att antalet leukocyter är förhöjt, sänkt eller att det finns många omogna leukocyter (1). Om det finns funktionsrubbningar på ett eller flera organ klassas tillståndet som svår sepsis (1). Om det genomsnittliga blodtrycket i kroppen understiger 65 mmhg har patienten drabbats av septisk chock (1). I Sverige avled under 2013 sammanlagt 1042 personer i sepsis orsakad av olika bakteriella agens, vilket motsvarar drygt 1% av alla dödsfall under det året (2). Några av de viktigaste bakteriella agens förknippade med sepsis är Streptococcus pneumoniae, stafylokocker och Escherichia coli (3). Infektioner i luftvägarna är grundorsaken hos 40-50% av alla sepsispatienter, medan infektioner i urinvägarna och gastrointestinala systemet orsakar ca 30% respektive 25% av fallen (4). Golden standard för diagnostik av sepsis är blododling (5), men med polymerase chain reaction (PCR) kan man detektera genetiskt material från bakterier i blodet hos patienter i flera dagar efter det att antibiotika administrerats (6). Mängden deoxyribonukleinsyra (DNA) i patientens blod har visat sig ha betydelse för hur allvarlig sjukdomen är (5), och även mängden immunoglobulin M har visat sig vara som högst hos de patienter som är mest allvarligt sjuka (7). Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae, även kallade pneumokocker, är grampositiva bakterier med en oval form (8), som förekommer i par eller korta kedjor (9). Sjukdomsframkallande pneumokocker har en polysackaridkapsel, och det finns över 90 olika serotyper (8). S. pneumoniae kan orsaka flera olika typer av infektioner, och är exempelvis den vanligaste orsaken till samhällsförvärvad pneumoni, meningit och otitis media (9). I den friska populationen är 5-50% bärare av bakterien (9), och infektioner ses oftast hos barn 1
under 2 år samt personer över 60 års ålder (8). Det finns även ett antal sjukdomar som kan öka risken för pneumokockinfektion (8, 9). Vid PCR-detektion av S. pneumoniae har genen för autolysin, lyta, visat sig ha hög specificitet och är en bra målgen för denna typ av analyser (10). Escherichia coli Den gramnegativa staven E. coli är den fakultativt anaeroba bakterie som förekommer i störst antal i colon och faeces hos människa (9). Bland samhällsförvärvade urinvägsinfektioner är E. coli den vanligaste orsaken, och det är även E. coli som är vanligast vid sepsis orsakad av gramnegativa stavar (9). Bakteriens förmåga att framkalla sjukdom beror på ett flertal egenskaper (9). E. coli har pili som underlättar vidhäftning till epiteliala celler hos människa (8), polysackaridkapseln försvårar fagocytos av bakterien, lipopolysackarider från cellväggen fungerar som ett endotoxin som kan orsaka flera sepsissymtom, och exotoxiner kan påverka tunntarmens celler och orsaka diarré (9). En gen med hög specificitet för E. coli som ofta används som målgen vid molekylärdiagnostisk detektion av bakterien är genen för β-d-glukuronidas, uida (11). Polymerase chain reaction PCR utvecklades i USA under 1980-talet och är en metod som används för att amplifiera nukleinsyrasekvenser (12). PCR efterliknar in vitro hur replikeringen av DNA sker in vivo, med samma komponenter och samma slutresultat (12). Den stora skillnaden är att PCR på kort tid kan ge lika många kopior av sekvensen som det skulle tagit dagar för kroppens celler att åstadkomma, med PCR kan man dessutom välja en specifik sekvens som ska kopieras (12). Komponenterna i en PCR-reaktion är primers som bestämmer vilken region av DNA som ska kopieras, nukleotider som byggs på och förlänger primrarna, polymerasenzym som krävs för påbyggnaden av nukleotider, samt ett prov-dna som ska kopieras (12). Dessutom behövs buffertar och joner av olika slag för att reaktionen ska ske optimalt (12). Ett PCR-program består av ett förvalt antal cykler, för varje cykel dubblas antalet kopior av målsekvensen vilket gör att man efter N cykler har 2 N kopior av sekvensen man är 2
intresserad av (12). Varje cykel består av tre steg, i det första steget denatureras det dubbelsträngade DNAt vid hög temperatur så att man erhåller två enkelsträngade sekvenser (12). Nästa steg är annealing där primrarna hybridiserar till komplementära delar på DNA-strängarna för att i tredje steget, primerextensionen, förlängas med nukleotider med hjälp av polymeraset (12). Efter att kopieringen av målsekvensen är färdig analyseras produkten med exempelvis gelelektrofores, vilket främst ger ett kvalitativt resultat (13). De tre största fördelarna med PCR-metoder är att de är snabba, känsliga och robusta (14). Med bara en DNA-molekyl som utgångspunkt kan man på kort tid få en tillräckligt stor mängd kopior för vidare analyser, och så länge målsekvensen är intakt kan man få en amplifiering med PCR även om provet utsatts för ogynnsamma förhållanden (14). En av de huvudsakliga nackdelarna med PCR är att man för att kunna syntetisera primers till analysen måste veta hur sekvensen runt omkring målsekvensen ser ut (14). En annan begränsning är att sekvenser längre än 5000 baspar inte kan amplifieras med pålitligt resultat (14). Realtids-PCR En variant av PCR som är mer inriktad på kvantifiering är realtids-pcr, där PCRprodukten kvantifieras samtidigt som amplifieringen sker (13). Det finns flera varianter av realtids-pcr, men gemensamt för alla är att det under analysens gång genereras en fluorescenssignal som detekteras (13). I den enklaste formen av realtids-pcr används en fluorescerande färg som binder starkt till dubbelsträngat DNA, fluorescenssignalen blir starkare ju fler kopior av DNAt som finns i provet (13). Fluorescenssignalen jämförs mot en kalibreringskurva som gjorts utifrån standarder med känd koncentration (13). En annan variant är realtids-pcr där en fluorescensprobe binder in till en del av målsekvensen (13). På proben finns en fluorescensfärg men även en så kallad quencher som hindrar fluorescenssignalen (13). Under extensionssteget kommer polymeraset att klyva fluorescensfärgen och quenchern från proben, vilket gör att de hamnar för långt isär för att quenchern ska kunna hindra signalen och man kan detektera fluorescensen, signalens styrka är direkt proportionerlig mot mängden PCR-produkt (13). 3
ddpcr Digital PCR (dpcr) bygger på att PCR-reaktionen för målsekvensen delas upp i en stor mängd mindre reaktioner där vissa kommer innehålla målsekvensen medan andra inte gör det (15). Efter PCR kommer då dessa mindre reaktioner kunna läsas av som positiva eller negativa, och med hjälp av Poisson-statistik erhålls en absolut kvantifiering av målsekvensen (15). Vid dpcr används samma primers och prober som vid kvantitativ realtids-pcr (qpcr) (16). Multiplex-analys med dpcr kan åstadkommas genom användandet av fluorescens av olika färger eller olika koncentrationer (17), vilket gör det möjligt att analysera flera sekvenser i samma reaktion (18). I den första kommercialiserade varianten av dpcr sker analysen på chip där reaktionen delas upp i omkring 800 mindre reaktioner med hjälp av ventiler, på nyare chip kan man åstadkomma en uppdelning på upp till en miljon mindre reaktioner (17). En annan variant av dpcr är droplet digital PCR (ddpcr) där PCR-reaktionen delas upp i ca 20000 oljedroppar som efter PCR kan läsas i en flödescytometer (15). Vid ddpcr laddas PCR-reaktionen tillsammans med olja på en kassett som sedan utsätts för ett vakuum som drar vätskorna genom en kanal där de delas upp i tusentals droppar med en bestämd volym (15). Dropparna samlas i en brunn och kan därifrån flyttas till en PCR-platta genom pipettering (15). Efter PCR analyseras dropparna i en detektor en och en med avseende på fluorescenssignal och registreras som antingen positiva eller negativa (15). Den absoluta koncentrationen av målsekvensen i ursprungsprovet kan beräknas utifrån antalet positiva droppar eftersom dropparnas storlek är känd (15). Poisson-korrektion justerar för förekomst av flera exemplar av målsekvensen i samma droppe (19). En översikt av arbetsgången vid ddpcr ses i Figur 1. 4
Figur 1. Schematisk översikt av arbetsgången vid en droplet digital PCR. Bildkälla: http://www.bio-rad.com/en-se/product/qx200-droplet-digital-pcr- system?hplink=[life%20science%20research]%20[featured%20product%20- %20Product%20Description] Ekvationen som används för den absoluta kvantifieringen är λ = -ln(1-p) där λ är antalet DNA-molekyler per reaktion och p är andelen positiva reaktioner (15). λ och antalet analyserade droppar ger tillsammans den absoluta koncentrationen av målsekvensen i PCR-reaktionen (15). Antalet droppar som PCR-reaktionen delas upp i är avgörande för säkerheten hos kvantifieringen, ett större antal droppar gör analysen säkrare och precisare, vilket gör att man med ett stort antal droppar kan analysera även låga koncentrationer av målsekvensen (15). Även om det är möjligt att få runt 20000 droppar i en ddpcr-analys blir antalet ofta lägre, men så länge antalet droppar är över 10000 är precisionen hög (20). Det stora antalet droppar i en ddpcr gör att man med stor precision kan kvantifiera den önskade målsekvensen, men vid ett större antal droppar blir volymosäkerheten på dropparna större vilket begränsar hur många droppar reaktionen är lämplig att delas in i (20). Att reaktionen delas upp i droppar som analyseras var och en för sig ger en stor känslighet även för små variationer i fluorescensintensitet, men vid låga DNAkoncentrationer har metoden visat sig ha en sämre precision (21). Uppdelningen i droppar som endast analyseras som positiva eller negativa ger metoden en hög tolerans vad gäller effektiviteten hos amplifieringen (15), att analysen inte görs 5
förrän efter amplifieringen är avslutad gör den även mer tolerant mot PCR-inhibitorer (19). Det finns en mängd olika ämnen från olika källor som kan fungera som PCRinhibitorer, exempelvis kalciumjoner, etanol, kollagen och hemoglobin (22). Till skillnad från många andra metoder för att kvantifiera nukleinsyrasekvenser behöver dpcr ingen kalibreringskurva för att kvantifiering ska erhållas (18). Om man jämför ddpcr med qpcr så är den analytiska sensitiviteten och kvantifieringsområdet liknande (21, 23), men ddpcr kan detektera lägre koncentrationer än qpcr (23). ddpcr har även en lägre variation än qpcr (19), och ddpcr är mindre känslig mot inhibitorer (21). ddpcr-systemet QX200 (Bio-Rad Laboratories Inc., Solna, Sverige) som använts i denna studie är anpassat för användning av TaqMan hydrolysprober och har två kanaler för fluorescensdetektion (24). SYFTE Målet var att sätta upp en metod för kvantifiering av S. pneumoniae och E. coli i helblod från patienter med sepsis orsakad av dessa bakterier för att följa DNA-mängden under sjukdomsförloppet. MATERIAL OCH METOD Provmaterial Provmaterialet bestod av blodprover i rör med tillsats av etylendiamintetraättiksyra (EDTA) tagna från patienter vid infektionsklinikerna i Örebro och Karlstad som samlats in i samband med blododling vid misstänkt sepsis. Patienter med påvisad sepsis orsakad av S. pneumoniae (30 patienter) eller E. coli (28 patienter) inkluderades i denna studie, och ytterligare blodprover togs på dessa patienter under pågående antibiotikabehandling. Förutom prov taget i samband med blododlingen (dag 0), togs prover när blododlingen blev positiv för bakterieväxt (dag 1-2), samt dag 3, 7, 14 och 28. Även om målet var att samtliga patienter skulle provtas vid dessa sex tillfällen varierade antalet prover som togs för respektive patient, utebliven provtagning berodde på olika logistiska orsaker. 6
Proverna frystes in i 20% glycerol och förvarades i frys -70 C. För prover som togs tidigt i studien, eller prover som behövde sättas om, användes i vissa fall blod som frysts in utan glycerol. Samtliga patienter lämnade skriftligt samtycke till att delta i det forskningsprojekt där proverna ingår, och det finns ett godkännande från Etikprövningsnämnden med diarienummer 2009/024 för genomförandet av studien. Som negativ kontroll användes MilliQ-vatten, och som positiv kontroll gjordes för S. pneumoniae en spädning av referensstam CCUG 33638 (Culture Collection, Göteborgs Universitet, Göteborg, Sverige) med en beräknad koncentration på 8*10 3 bakterier/ml baserat på viable count. Positiv kontroll för E. coli var referensstam CCUG 17620 (Culture Collection, Göteborgs Universitet) med en beräknad koncentration på 10 4 bakterier/ml. DNA-extraktion Extraktion av DNA utfördes med hjälp av SelectNA Blood Pathogen Kit (Molzym GmbH, Bremen, Tyskland), som i det första manuella steget bryter ner humant DNA och därefter renar fram det bakteriella DNAt. Extraktion av det bakteriella DNAt skedde i instrumentet Arrow (NorDiag, Oslo, Norge). Till provrör pipetterades 1 ml av respektive prov. Därefter tillsattes 250 µl CM-buffer för en mild lysering av endast humana celler, varpå provet blandades med vortex i 15 sekunder och ställdes i rumstemperatur i 5 minuter. Röret centrifugerades snabbt för att få bort eventuell vätska ur locket innan 250 µl av buffer DB1 och 10 µl MolDNase B tillsattes för nedbrytning av humant DNA. Provet blandades med vortex i 15 sekunder och fick sedan stå i rumstemperatur i 15 minuter. Sedan centrifugerades röret med hastigheten 12000xg vid 20 C i 10 minuter. Supernatanten sögs bort och slängdes. Pelleten löstes i 1 ml RS-buffer genom att röras ut med pipettspetsen och sedan pipetterades lösningen upp och ner tills den var helt homogen. Provet blandades snabbt med vortex innan centrifugering med hastigheten 12000xg vid 20 C i 5 minuter. Supernatanten sögs bort och slängdes. Därefter löstes pelleten i 80 µl RL-buffer genom omrörning med pipettspets och pipettering upp och ner tills lösningen var homogen. Provet blandades snabbt med vortex för att sedan centrifugeras snabbt för att avlägsna 7
vätska från locket. För att lysera bakterierna sattes 20 µl BugLysis och 1,4 µl β- mercaptoetanol till röret. Provet blandades med vortex i 15 sekunder. För att extrahera det bakteriella DNAt sattes röret i instrumentet Arrow som laddats med pipettspetsar monterade på pumphuvuden, reagenskassetter, SelectNA tubes med 20 µl Proteinase K, samt SelectNA tubes för uppsamling av det framrenade DNAt enligt instruktioner på instrumentets display, och instrumentets program Blood Pathogen v2.0 kördes. Optimering av ddpcr för Streptococcus pneumoniae Optimering av annealingtemperatur för PCR-reaktionen för S. pneumoniae utfördes genom en PCR-körning med prover av känd koncentration med temperaturgradient i PCR-instrumentet. Prov från referensstam CCUG 33638 med koncentrationen 8*10 4 bakterier/ml samt 8*10 3 bakterier/ml, samt en negativ kontroll kördes vid åtta olika annealingtemperaturer från 55 C till 65 C. Mastermixen bestod av 1x Supermix (ddpcr supermix for probes, Bio-Rad Laboratories Inc.), 0,9 µm forward primer (5 CAGCGGTTGAACTGATTGA 3 (25), Sigma-Aldrich, Stockholm, Sverige), 0,9 µm reverse primer (5 TGGTTGGTTATTCGTGCAA 3 (25), Sigma-Aldrich), 0,25 µm probe (6-FAM-AGCTGGAATTAAAACGCACGAG-MGBNFQ (26), Life Technologies, Stockholm, Sverige), samt MilliQ-vatten till slutvolymen 15 µl. Till detta sattes 5 µl templat. Hela provvolymen sattes tillsammans med 70 µl Droplet generatorolja (Droplet generator oil for probes, Bio-Rad Laboratories Inc.) på en droplet generator cartridge (DG8 droplet generator cartridge, Bio-Rad Laboratories Inc.), cartridgen täcktes med en gasket (DG8 droplet generator gasket, Bio-Rad Laboratories Inc.) och placerades i dropletgeneratorn (QX200 droplet generator, Bio-Rad Laboratories Inc.). De genererade dropparna fördes över kolumnvis till en 96-hålsplatta som täcktes med en genomstickbar folie och förseglades. Därefter kördes ett PCRprogram med en förvärmning vid 95 C i 10 minuter för enzymaktivering, följt av 40 cykler där proverna denaturerades i 30 sekunder vid 94 C följt av ett annealing- och extensionssteg i en minut där rad A i 96-hålsplattan hade annealingtemperatur 65 C, rad B 64,5 C, rad C 63,3 C, rad D 61,4 C, rad E 59 C, rad F 57 C, rad G 55,7 C och rad H 55 C. Därefter följde en deaktivering av enzymerna vid 98 C i 10 minuter innan proverna kyldes till 4 C. Programmet kördes på maskinen C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc.) utrustad med en CFX96 Real-Time System-modul (Bio- Rad Laboratories Inc.). Efter PCR-programmets slut lästes dropparna av med en droplet 8
reader (QX200 droplet reader, Bio-Rad Laboratories Inc.) och analyserades med datorprogrammet QuantaSoft software. För optimering av primerkoncentration sattes prover med känd koncentration i en PCRkörning där tre olika reaktionsblandningar med varierande primerkoncentration användes. Mastermix innehöll 1x Supermix, forward och reverse primers (0,5 µm, 0,9 µm respektive 1,2 µm), 0,25 µm probe, samt MilliQ-vatten till slutvolymen 12 µl. Till detta sattes 8 µl templat av prov från CCUG 33638 med koncentrationen 8*10 4 respektive 8*10 3, samt en negativ kontroll. Droppar genererades på samma sätt som vid temperaturoptimeringen. PCR-programmet som användes hade en förvärmning vid 95 C i 10 minuter för att aktivera enzymerna, följt av 40 cykler med denaturering vid 94 C i 30 sekunder och ett kombinerat annealing- och extensionssteg vid 59 C i en minut. Programmet avslutades med en värmning vid 98 C i 10 minuter för att deaktivera enzymerna, och därefter kyldes proverna till 4 C. Samma PCR-utrustning som för temperaturoptimeringen användes. Efter avslutad PCR lästes dropparna i en droplet reader och analyserades med datorprogrammet QuantaSoft software. Probekoncentrationen optimerades med en PCR-körning med tre olika reaktionsblandningar med varierande probekoncentration. Mastermixen bestod av 1x Supermix, 0,9 µm forward primer, 0,9 µm reverse primer, probe (0,1 µm, 0,25 µm respektive 0,4 µm), samt MilliQ-vatten till slutvolymen 12 µl. Till detta sattes 8 µl templat av prov från CCUG 33638 med koncentrationen 8*10 4 respektive 8*10 3, samt en negativ kontroll. Droppar genererades på samma sätt som vid föregående optimeringar. Samma PCR-program som vid primertitreringen användes, och dropparna lästes på samma sätt i droplet reader och analyserades med datorprogrammet QuantaSoft software. ddpcr på patientprover med Streptococcus pneumoniae För patientprover användes de koncentrationer och den annealingtemperatur som gett bäst resultat vid optimeringarna, därför bestod mastermixen av 1x Supermix, 0,9 µm forward primer, 0,9 µm reverse primer, 0,1 µm probe, samt MilliQ-vatten till slutvolymen 12 µl. Till detta sattes 8 µl templat från respektive patientprov. Droppar genererades på samma sätt som vid optimeringarna, och samma PCR-program som vid primer- och probetitreringarna användes. Resultatet lästes av med droplet reader och 9
analyserades med QuantaSoft software. Samtliga prover från dag 0 och dag 1-2 analyserades. Prover från efterföljande dagar analyserades endast om tidigare prov var positivt för bakteriellt DNA. Optimering av ddpcr för Escherichia coli Optimering av annealingtemperatur för PCR-reaktionen för E. coli utfördes på samma sätt som för S. pneumoniae. Prov från referensstam CCUG 17620 med koncentrationen 10 4 bakterier/ml samt 10 3 bakterier/ml, samt en negativ kontroll analyserades vid åtta olika annealingtemperaturer från 55 C till 65 C. Mastermixen bestod av 1x Supermix, 0,9 µm forward primer (5 CAGTCTGGATCGCGAAAACTG 3 (27), Sigma-Aldrich), 0,9 µm reverse primer (5 ACCAGACGTTGCCCACATAATT 3 (27), Sigma- Aldrich), 0,25 µm probe (P2 6-FAM-ATTGAKCAGCRTTGG- MGBNFQ (27), Life Technologies), samt MilliQ-vatten till slutvolymen 15 µl. Till detta sattes 5 µl templat. Droppar genererades på samma sätt som vid övriga ddpcr-körningar. Samma PCRprogram som för temperaturoptimering av S. pneumoniae användes, och avläsning skedde på samma sätt. För primertitrering gjordes tre mastermixar med varierande primerkoncentration. Mastermixen bestod av 1x Supermix, forward och reverse primers (0,5 µm, 0,9 µm respektive 1,2 µm), 0,25 µm probe, samt MilliQ-vatten till slutvolymen 12 µl. Till detta sattes 8 µl templat av referensstam CCUG 17620 med koncentrationen 10 4 bakterier/ml respektive 10 3 bakterier/ml, samt en negativ kontroll. Droppar genererades på samma sätt som vid övriga analyser. Därefter kördes ett PCR-program med en förvärmning vid 95 C i 10 minuter för att aktivera enzymerna, följt av 40 cykler med denaturering vid 94 C i 30 sekunder och ett kombinerat annealing- och extensionssteg vid 56 C i 1 minut. Programmet avslutades med en värmning vid 98 C i 10 minuter för att deaktivera enzymerna, och därefter kyldes proverna till 4 C. Samma PCR-utrustning som för övriga PCR-körningar användes, och avläsning och analys skedde på samma sätt i droplet reader och QuantaSoft software. Probetitrering gjordes med tre olika probekoncentrationer. Det gjordes en mastermix med 1x Supermix, 0,9 µm forward primer, 0,9 µm reverse primer, probe (0,1 µm, 0,25 µm respektive 0,4 µm), samt MilliQ-vatten till slutvolymen 12 µl. Till detta sattes 8 µl templat av CCUG 17620 med koncentrationen 10 4 bakterier/ml respektive 10 3 10
bakterier/ml, samt en negativ kontroll. Droppar genererades på samma sätt som för övriga analyser, och samma PCR-program som vid primertitreringen användes. Därefter analyserades dropparna på samma sätt som tidigare. ddpcr på patientprover med Escherichia coli I enlighet med optimeringsresultaten för koncentrationer och annealingtemperatur gjordes för patientprover en mastermix bestående av 1x Supermix, 0,9 µm forward primer, 0,9 µm reverse primer, 0,25 µm probe samt MilliQ-vatten till slutvolymen 12 µl. Till det sattes 8 µl templat. Droppar genererades på samma sätt som tidigare, och samma PCR-program som vid primer- och probetitreringen användes. Dropparna analyserades som tidigare. Det prov som togs tidigast i sjukdomsförloppet för varje patient analyserades, därefter analyserades efterföljande prover för de patienter där bakteriellt DNA påvisats. RESULTAT Optimering av ddpcr för Streptococcus pneumoniae Vid temperaturoptimeringen erhölls resultatet i Figur 2, där grå droppar är negativa och blå positiva. Samtliga provbrunnar innehöll över 10000 droppar. Den temperatur som gav minst spridning på dropparna, och en tydlig skillnad mellan de positiva och negativa dropparna var 59 C. Högre annealingtemperaturer gav ingen eller liten skillnad mellan positiva och negativa droppar, medan lägre temperaturer gav mer spridning hos de positiva dropparna. 11
Figur 2. Resultat i QuantaSoft software för temperaturoptimering av droplet digital PCR för Streptococcus pneumoniae. Testade annealingtemperaturer är 65,0 C (A01, A02), 64,5 C (B01, B02), 63,3 C (C01, C02), 61,4 C (D01, D02), 59,0 C (E01, E02), 57,0 C (F01, F02), 55,7 C (G01, G02) och 55,0 C (H01, H02). Den temperatur som gav det mest samlade resultatet med tydlig skillnad mellan positiva och negativa droppar var 59 C. Figur 3 visar resultatet från primertitreringen, där primerkoncentrationen 0,9 µm gav resultatet med minst spridning på dropparna. Samtliga provbrunnar hade ett godkänt antal droppar. Figur 3. Resultat från QuantaSoft software för primertitrering för Streptococcus pneumoniae. Testade koncentrationer är 0,5 µm (A01, B01, C01), 0,9 µm (D01, E01) och 1,2 µm (F01, G01, H01). För 0,9 µm erhölls det mest samlade resultatet. 12
För probetitrering erhölls resultat enligt Figur 4, där probekoncentrationen 0,1 µm gav resultatet med minst spridning av dropparna och lägst bakgrundsfluorescens. Ett godkänt antal droppar erhölls för alla prover. Figur 4. Resultat från QuantaSoft software för probetitrering för Streptococcus pneumoniae. Testade koncentrationer är 0,1 µm (A01, B01), 0,25 µm (C01, D01, E01) och 0,4 µm (F01, G01, H01). Det bästa resultatet erhölls med probekoncentration 0,1 µm, där dropparna var mer samlade och bakgrundsfluorescensen lägre än för de övriga koncentrationerna. ddpcr på patientprover med Streptococcus pneumoniae Hos 18 av de 30 patienterna kunde inget bakteriellt DNA från S. pneumoniae påvisas i proverna från dag 0 eller dag 1-2. Resultatet för patienterna som blev positiva för bakterie-dna i något av proverna sammanfattas i Tabell 1. Andelen prover positiva för bakteriellt DNA per dag redovisas i Figur 5. Ej analyserade prover räknas som negativa. För prover från dag 0 och dag 1-2 presenteras ett medelvärde från upprepade analyser. Medelvärdet för den positiva kontrollen var 1172 bakterier/ml, den negativa kontrollen blev negativ i samtliga analyser. För patient 1 uppmättes vid dag 1-2 koncentrationen 24 bakterier/ml blod, vid dag 3 kunde inget bakteriellt DNA påvisas. Patient 2 hade vid dag 0 104688 bakterier/ml blod, vid dag 1-2 68125 bakterier/ml blod, dag 7 var koncentrationen nere på 25 bakterier/ml blod, och dag 14 påvisades inget 13
bakteriellt DNA i patientens blod. Patient 3 hade vid dag 1-2 koncentrationen 547 bakterier/ml blod, men vid dag 3 kunde inte längre något bakterie-dna påvisas. För patient 5 uppmättes dag 0 41 bakterier/ml blod, medan provet från dag 1-2 var negativt för bakteriellt DNA. För patient 6, patient 9 och patient 17 var koncentrationen dag 1-2 86, 49 respektive 289 bakterier/ml blod, vid dag 3 påvisades inget bakterie-dna hos patienterna. Patient 20 hade vid dag 0 24 bakterier/ml blod och vid dag 1-2 15 bakterier/ml blod. Dag 7 kunde inget bakteriellt DNA påvisas. För patient 21 kunde i provet från dag 0 inget bakteriellt DNA påvisas, men vid dag 1-2 uppmättes koncentrationen 92 bakterier/ml blod. Vid dag 3 påvisades inget bakterie- DNA. Patient 28 hade vid dag 1-2 99 bakterier/ml blod, vid dag 3 kunde inget bakterie-dna påvisas. Patient 29 hade i provet från dag 0 26 bakterier/ml blod, medan det i provet från dag 1-2 inte kunde påvisas något bakteriellt DNA. Patient 30 hade ett prov från dag 0 med 87 bakterier/ml blod, och ett prov från dag 3 som var negativt för bakteriellt DNA. Figur 5. Andelen prover positiva för bakteriellt DNA, angivet i procent, per dag för patienter med sepsis orsakad av Streptococcus pneumoniae (blå) eller Escherichia coli (orange). Ej analyserade prover räknas som negativa. 14
Tabell 1. Sammanställning av bakteriekoncentrationen i blodet från patienter med sepsis orsakad av Streptococcus pneumoniae. Samtliga koncentrationer är angivna i bakterier/ml blod. Patienter negativa för bakteriellt DNA har utelämnats ur tabellen. Prov som saknas är markerade med streck. Patient Dag 0 Dag 1-2 Dag 3 Dag 7 Dag 14 1-24 0 2 104688 68125-25 0 3-547 0 5 41 0 6-86 0 9-49 0 17-289 0 20 24 15-0 21 0 92 0 28-99 0 29 26 0 30 87-0 Optimering av ddpcr för Escherichia coli I Figur 6 ses resultatet från optimeringen av annealingtemperatur för E. coli. Av de testade temperaturerna var 55,7 C den temperatur där dropparna var mest samlade, och det fanns en tydlig skillnad mellan positiva och negativa droppar. Vid högre temperaturer minskade skillnaden i fluorescens mellan de positiva och negativa dropparna, och den lägre temperaturen gav mer spridning på de positiva dropparna. Samtliga brunnar innehöll minst 10000 droppar. 15
Figur 6. Resultat i QuantaSoft software för temperaturoptimering av droplet digital PCR för Escherichia coli. Testade annealingtemperaturer är 65,0 C (A01, A02), 64,5 C (B01, B02), 63,3 C (C01, C02), 61,4 C (D01, D02), 59,0 C (E01, E02), 57,0 C (F01, F02), 55,7 C (G01, G02) och 55,0 C (H01, H02). Den temperatur som gav det mest samlade resultatet med tydlig skillnad mellan positiva och negativa droppar var 55,7 C. Figur 7 visar resultatet från primertitreringen, där koncentrationen 0,9 µm gav minst spridning på de positiva dropparna. Samtliga brunnar innehöll ett godkänt antal droppar. Figur 7. Resultat från QuantaSoft software för primertitrering för Escherichia coli. Testade koncentrationer är 0,5 µm (A01, B01, C01), 0,9 µm (D01, E01) och 1,2 µm (F01, G01,H01). För 0,9 µm erhölls det mest samlade resultatet. 16
Resultatet från probetitreringen ses i Figur 8, och visar att probekoncentrationen 0,25 µm gav den tydligaste skillnaden mellan positiva och negativa droppar med den lägsta spridningen av de positiva dropparna. I alla brunnar fanns ett godkänt antal droppar. Figur 8. Resultat från QuantaSoft software för probetitrering för Escherichia coli. Testade koncentrationer är 0,1 µm (A01, B01), 0,25 µm (C01, D01, E01) och 0,4 µm (F01, G01, H01). Det bästa resultatet erhölls med probekoncentration 0,25 µm, där dropparna var mer samlade än vid 0,4 µm och skillnaden i fluorescens mellan positiva och negativa droppar tydligare än för 0,1 µm. ddpcr på patientprover med Escherichia coli Inget bakteriellt DNA från E. coli kunde påvisas i det första provet hos 11 av de 28 patienterna. För de patienter som blev positiva för bakteriellt DNA i något av proverna sammanfattas resultatet i Tabell 2. I Figur 5 visas andelen positiva prover per dag, ej analyserade prover räknas som negativa. För första provet från varje patient redovisas medelvärdet från upprepade analyser. Medelvärdet för den positiva kontrollen var 5273 bakterier/ml, den negativa kontrollen blev negativ i samtliga analyser. Patient 3 hade dag 0 270 bakterier/ml blod, dag 1-2 kunde inget bakterie-dna påvisas. Patient 4 hade vid dag 1-2 47 bakterier/ml blod, och vid dag 3 kunde inget bakteriellt DNA påvisas. 17
Patient 9 och patient 11 hade 125 respektive 75 bakterier/ml blod i provet från dag 0, dag 1-2 påvisades inte längre något bakterie-dna. Patient 13 hade dag 3 koncentrationen 59 bakterier/ml blod, och dag 14 fanns inte längre något påvisbart bakteriellt DNA hos patienten. För patient 15 och 16 påvisades vid dag 1-2 984 bakterier/ml blod respektive 136 bakterier/ml blod, inga uppföljningsprover fanns för dessa patienter. Patient 17 hade i provet från dag 0 2328 bakterier/ml blod, dag 1-2 var koncentrationen 83 bakterier/ml blod, och vid dag 3 kunde inget bakteriellt DNA längre påvisas. Patient 19 hade vid dag 3 39 bakterier/ml blod, och vid dag 7 var provet negativt för bakteriellt DNA. Patient 20 hade 72 bakterier/ml blod vid dag 3, uppföljningsprov saknades. Hos patient 21 påvisades i provet från dag 1-2 131 bakterier/ml blod, men dag 3 påvisades inget bakteriellt DNA. Patient 22 hade vid dag 0 en koncentration på 75 bakterier/ml blod, vid dag 1-2 påvisades inget bakterie-dna. Patient 23 och 24 hade vid dag 3 50 respektive 89 bakterier/ml blod, vid dag 7 påvisades inget bakteriellt DNA i blodet hos någon av patienterna. Patient 25 hade vid dag 1-2 80 bakterier/ml blod, vid dag 7 påvisades inget bakterie- DNA. För patient 26 var koncentrationen dag 3 219 bakterier/ml blod, och vid dag 7 92 bakterier/ml blod. Inget uppföljningsprov fanns. Hos patient 27 påvisades dag 1-2 50 bakterier/ml blod, men dag 3 påvisades inget bakteriellt DNA. 18
Tabell 2. Sammanställning av bakteriekoncentration i blodet för patienter med sepsis orsakad av Escherichia coli. Samtliga koncentrationer är angivna i bakterier/ml blod. Patienter negativa för bakteriellt DNA har utelämnats ur tabellen. Prov som saknas är markerade med streck. Patient Dag 0 Dag 1-2 Dag 3 Dag 7 Dag 14 3 270 0 4-47 0 9 125 0 11 75 0 13 - - 59 0 15-984 - - - 16-136 - - - 17 2328 83 0 19 - - 39 0 20 - - 72 - - 21-131 0 22 75 0 23 - - 50 0 24 - - 89 0 25-80 - 0 26 - - 219 92-27 - 50 0 19
DISKUSSION För patienter med sepsis orsakad av S. pneumoniae var 40% positiva för bakteriellt DNA i minst ett av proverna, medan siffran för E. coli var 60,7%. Andelen positiva prover per dag (se Figur 5) följde för S. pneumoniae en starkt nedåtgående trend redan från dag 0, medan E. coli hade en jämn andel positiva prover ända till dag 7 då siffrorna snabbt sjönk. Bakteriellt DNA kunde påvisas under längre tid för E. coli än för S. pneumoniae, då sju patienter med E. coli var positiva för bakteriellt DNA vid dag 3 eller senare medan det endast var en patient med S. pneumoniae som var positiv under samma tidsperiod. Sista dag med positivt prov var för båda agens dag 7. Hos två patienter för varje bakterie påvisades bakteriellt DNA i fler än ett prov, men för E. coli saknades uppföljningsprover för fyra patienter med positiva prover. Patient 2 med S. pneumoniae-sepsis hade en markant högre koncentration av bakteriellt DNA i blodet än övriga patienter, vilket skulle kunna tyda på att denna patient har en allvarligare sepsis, ett samband som tidigare visats (5). Hos patient 21 med S. pneumoniae-sepsis påvisades inget bakteriellt DNA i provet från dag 0, men däremot i provet från dag 1-2. Provet från dag 0 extraherades om för att bekräfta detta resultat. Vad detta resultat beror på är oklart, men man skulle kunna misstänka en behandlingsproblematik med återväxt av bakterier. Eftersom de positiva kontrollernas förväntade koncentration baserades på viable count fanns en stor osäkerhet i beräkningarna då viable count ska ses mer som en uppskattning av i vilken storleksordning koncentrationen ligger än som en noggrann kvantifiering (28). Det är därför inte konstigt att kontrollernas uppmätta koncentrationer avviker från de beräknade, och eftersom de blev positiva i samtliga analyser, samtidigt som de negativa kontrollerna alltid var negativa, kan alla resultat anses pålitliga. Proverna i studien frystes till en början in utan glycerol, för att sedan frysas in med 20% glycerol. Det verkar dock inte ha någon betydelse för resultatet om blod med eller utan glycerol använts. Även om metoden kräver flera arbetsmoment känns den relativt enkel och lättanvänd. 20
Kvantifieringen är stabil, utan stora variationer mellan olika körningar av samma prov, och metoden är inte beroende av en kalibreringskurva. Metoden detekterar även låga koncentrationer, om än med lite större osäkerhet. Eftersom inte alla droppar följer med genom alla steg av analysen är prover med låga koncentrationer mer utelämnade åt slumpen, om det endast finns ett fåtal kopior av målsekvensen från början finns risken att dessa faller bort under analysens gång. Hur stor påverkan detta har kommer undersökas vidare. En stor nackdel med metoden är analysen av resultaten, det är inte alltid självklart var man ska välja att lägga tröskelvärdet för att avskilja positiva och negativa droppar, och valet av tröskelvärde kan ha stor påverkan på vilka prover som bedöms som positiva. För S. pneumoniae fanns det hela tiden en tydlig skillnad i fluorescens mellan de positiva och de negativa dropparna, och tröskelvärdet var således lätt att välja så att alla negativa droppar hamnade under. När det gäller E. coli fanns däremot ofta droppar som låg strax ovanför de klart negativa, men som det var oklart om de var negativa eller positiva. Tröskelvärden för E. coli placerades därför ut så att de stämde överens med de prover som var klart positiva, eftersom dessa prover var de som hade tydligast skillnader i fluorescens mellan positiva och negativa droppar. Detta resulterade i att de negativa kontrollerna hade droppar som bedömdes som positiva, och därför sattes ett krav på minst tre positiva droppar för att ett prov skulle bedömmas som positivt, till skillnad från S. pneumoniae där det räckte med en positiv droppe för att provet skulle anses positivt. De droppar hos E. coli som låg strax ovanför de negativa i fluorescens, men inte så högt som de klart positiva, kan ha orsakats av ospecifik amplifiering eller mutationer där primers eller probe inte passat optimalt med målsekvensen och därför gett en lägre fluorescens, men för att utreda detta behöver man gå vidare med DNAsekvensering. För användande av denna metod inom klinisk verksamhet är extraktionen av bakteriellt DNA det begränsande momentet då det endast går att extrahera högst tolv prover åt gången med den metod jag använt, och det är en tidskrävande process. När proverna väl är extraherade kan man analysera upp till 94 prover åt gången, då det på 96-hålsplattan behöver finnas plats för positiv och negativ kontroll. Det finns dock en tendens till generellt sjunkande fluorescens hos de prover som sätts sist vid de tillfällen ett stort antal prover analyseras samtidigt, vilket förmodligen beror på att proben är känslig vid 21
exponering för ljus. Metoden skulle lämpa sig att använda i klinisk verksamhet för att snabbt bedömma hur allvarlig patientens infektion är, och genom att följa bakteriekoncentrationen över tid kan man utvärdera effekten av antibiotikabehandling. Om inte koncentrationen går ner behöver man förmodligen se över val av antibiotika. Sammanfattningsvis är ddpcr en bra metod för att kvantifiera bakteriellt DNA i blodprover från sepsispatienter, men metoden behöver utvärderas ytterligare genom jämförelse med annan metod innan den kan tas i kliniskt bruk. 22
REFERENSER 1. Felner K, Smith RL. Sepsis. I: McKean SC, Ross JJ, Dressler DD, Brotman DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital Medicine. New York: McGraw-Hill; 2012. 2. Dödsorsaker 2013 [Internet] Socialstyrelsen: 2015 [citerad 2015-04-23] Tillgänglig från: http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2015/2015-2-42 3. Svår sepsis och septisk chock [Internet] Internetmedicin [uppdaterad 2014-12- 01; citerad 2015-04-01] Tillgänglig från: http://www.internetmedicin.se/page.aspx?id=109 4. Han J, Cribbs SK, Martin GS. Sepsis, Severe Sepsis, and Septic Shock. I: Hall JB, Schmidt GA, Kress JP, editors. Principles of Critical Care. 4 th ed. New York: McGraw-Hill; 2014. 5. Ziegler I, Josefson P, Olcén P, Mölling P, Strålin K. Quantitative data from the SeptiFast real-time PCR is associated with disease severity in patients with sepsis. BMC Infect Dis. 2014; 14 (155). 6. Bronska E, Kalmusova J, Dzupova O, Maresova V, Kriz P, Benes J. Dynamics of PCR-based diagnosis in patients with invasive meningococcal disease. Clin Microbiol Infect. 2006; 12: 137-141. 7. Tamayo E, Almansa R, Carrasco E, Ávila-Alonso A, Rodríguez-Fernández A, Wain J et al. Quantification of IgM molecular response by droplet digital PCR as a potential tool for the early diagnosis of sepsis. Crit Care. 2014; 18 (3): 433. 8. Ryan KJ, Ray C, editors. Sherris Medical Microbiology. 6 th ed. New York: McGraw-Hill; 2014. 9. Levinson W, editor. Review of Medical Microbiology and Immunology. 13 th ed. New York: McGraw-Hill; 2014. 10. Abdeldaim G, Herrmann B, Mölling P, Holmberg H, Blomberg J, Olcén P, Strålin K. Usefulness of real-time PCR for lyta, ply, and Spn9802 on plasma samples for the diagnosis of pneumococcal pneumonia. Clin Microbiol Infect. 2010; 16: 1135-1141. 11. Chern EC, Siefring S, Paar J, Doolittle M, Haugland RA. Comparison of quantitative PCR assays for Escherichia coli targeting ribosomal RNA and single copy genes. Lett Appl Microbiol. 2011; 52 (3): 298-306. 23
12. Buckingham L. Molecular Diagnostics. 2 nd ed. Philadelphia: F.A. Davis Company, 2012. 13. Reed R, Holmes D, Weyers J, Jones A. Practical Skills in Biomolecular Sciences. 3 rd ed. Harlow: Pearson Education Limited, 2007. 14. Baynes JW, Dominiczak MH, editors. Medical Biochemistry. 3 rd ed. Maryland Heights: Mosby Elsevier, 2009 15. Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, Belgrader P, Heredia NJ, Makarewicz AJ et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 2011; 83: 8604-8610. 16. Manoj P. Droplet digital PCR technology promises new applications and research areas. Mitochondrial DNA. 2014 april 29, early online. 17. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods; 9 (6). 18. Huggett JF, Whale A. Digital PCR as a Novel Technology and Its Potential Implications for Molecular Diagnostics. Clin Chem. 2013; 59 (12): 1691-1693. 19. Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, Gallichotte EN, Ruf IK, Hindson BJ et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 2013; 10 (10): 1003-1005. 20. Pinheiro LB, Coleman VA, Hindson CM, Herrmann J, Hindson BJ, Bhat S, Emslie KR. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 2012; 84: 1003-1011. 21. Yang R, Paparini A, Monis P, Ryan U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddpcr) with quantitative PCR (qpcr) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int J Parasitol. 2014; 44: 1105-1113. 22. Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 2012; 113 (5): 1014-26. 23. Dreo T, Pirc M, Ramsak Z, Pavsic J, Milavec M, Zel J, Gruden K. Optimising droplet digital PCR analysis approaches for detection and quantification of bacteria: a case study of fire blight and potato brown rot. Anal Bioanal Chem. 2014; 406: 6513-6528. 24. QX200 Droplet Digital PCR System [Internet] Bio-Rad Laboratories, Inc. [citerad 2015-05-25] Tillgänglig från: http://www.bio-rad.com/ense/product/qx200-droplet-digital-pcr-system 24
25. Sheppard CL, Harrison TG, Morris R, Hogan A, George RC. Autolysin-targeted LightCycler assay including internal process control for detection of Streptococcus pneumoniae DNA in clinical samples. J Med Microbiol 2004; 53: 189 95. 26. Thulin-Hedberg S, Olcén P, Fredlund H, Mölling P. Real-time PCR detection of five prevalent bacteria causing acute meningitis. APMIS 2009: 117 (11): 856-60. 27. Ken J. Yoshitomi, Karen C. Jinneman, Stephen D. Weagant. Optimization of a 30-minor groove binder-dna probe targeting the uida gene for rapid identification of Escherichia coli O157:H7 using real-time PCR. Molecular and Cellular Probes 2003; 17: 275 280. 28. TVC: Total Viable Count [Internet] Wirral: Cheshire Scientific Ltd [citerad 2015-05-12] Tillgänglig från: http://www.cheshirescientific.co.uk/microorganisms/tvc.php 25