Next Generation Sequencing Anna Gréen, Klinisk Genetik, Linköping
Vad är Next Generation sequencing? First Generation sequencing- ex Sanger och pyrosekvensering 2005-massiv parallell sekvensering Stora mängder (tusentals till miljontals) DNA fragment sekvenseras samtidigt
Plattform Kemi Läslängd Fördel Nackdel 454 Pyrosekvens ering 700 Lång läslängd SOLiD Ligering 100 Låg felfrekvens Hög felfrekvens i Homopolymer Korta reads Ion Proton Proton-Pyro 200 Kort körtid Hög felfrekvens i Homopolymer PacBio Real-time sekvensering 14000 Längst läslängd Hög felfrekvens MiSeq Sequencing by synthesis 600 Låg felfrekvens Dyrt NextSeq Sequencing by synthesis 300 Låg felfrekvens Dyrt HiSeq /HiSeq 10X Sequencing by synthesis 300 Låg felfrekvens Dyrt
Vad kan man använda NGS till? Targeted resequencing-genpaneler Sekvensering av exom (humant) Sekvensering av hela genom (humant) Transcriptome analyser Methylation sequencing Chip-Seq Finns många olika tekniker!!!!
Vad använder vi på Klinisk Genetik? Genpaneler-Genetisk hjärtsjukdom och Plötslig Hjärtdöd Kliniskt exom-gener som är kliniskt relevanta Helgenomsekvensering Non-Invasive Prenatal Testing Mycket annat-mikrobiologi, klinisk kemi, onkologi.
Sekvensering av utvalda gener- Tillvägagångssätt Bestäm vilka varianter, gener (eller andra genomiska regioner) du vill sekvensera Beroende på storleken av den genomiska regionen och önskat sekvensdjup, mm, välj assay för att anrika dessa regioner Preparera prover och sekvensera resultat i form av en datafil (fastq) Bestäm om sekvensvariationer/ mutationer/ indels finns med hjälp av bioinformatik eller integrerade programvaror
DNA av god kvalitet A260/A280 1.8-2.0 A260/A230 >1.5 Kvantifiering med fluorescens Bibliotekspreparation Next Generation Sequencing Bioinformatik Kommunikation är bra! Rapport Svårt, många varianter ACMG guidelines
Fastq Dataanalys SAM/BAM fil Ta bort adaptorer, aligna sekvenser till genomet Lägga upp sekvenser på varandra Pileup Rå vcf fil Calling av varianter vcf fil Filter och andra verkyg
Vad kan vi använda NGS till? Sekvensering av utvalda gener Sekvensering av kliniskt exom (humant) Sekvensering av hela genom (humant) NIPT-Non invasive prenatal testing
Implementering av NGS i Kliniken Sekvenseringen måste bli korrekt (hg19) och av hög kvalitet De utvalda exonerna/generna måste ha god täckning, helst 100% Mutationer/Deletioner/Insertioner och SNP:s måste hittas med stor säkerhet Validering mot Sanger-sekvensering
Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) Inlagring av fett och bindväv i höger kammare Sämre pumpförmåga, rytmrubbningar Plötslig hjärtdöd prevalence 1 in 2,000 till 1 på 5,000 Autosomal dominant Familjär förekomst i ~ 30 % av fallen PKP2, DSP, DSG2, DSC2, JUP, DES, TGFB3, TMEM43, RYR2, TTN
ARVC Tidigare sekvenserades exonerna hos 5 gener på Cellbiologen/Klinisk Genetik med Sangersekvensering- PKP2, DSP, DSC2, DSG2 och JUP Exonerna i dessa gener (och ytterligare gener) kan sekvenseras samtidigt med MiSeq (och flera patientprover kan köras samtidigt) HaloPlex design för PKP2, DES, DSC2, DSG2, JUP, DSP, TGFB3, TMEM43, TTN, RYR2 De sekvenserade fragmenten mappas mot det humana genomet Med hjälp av bioinformatik kan man sedan bestämma vilka mutationer som finns i de valda generna
Hur bra blir data? Våra krav: Sekvenseringen måste bli korrekt (hg19) och av hög kvalitet De utvalda exonerna/generna måste ha god täckning, helst 100% Mutationer/Deletioner/Insertioner och SNP:s måste hittas med stor säkerhet Validering mot Sanger-sekvensering
HaloPlex-MiSeq sekvenseringskvalité-mycket bra!
Ett problematiskt område i designen- DSP exon 1
Täckning- Bra men inte perfekt
Mutations och SNP:s detekteras med hög säkerhet i alla tre analysmetoder vi använder
Validering av HaloPlex mot Sanger- Sekvensering Vi får samma sekvens när vi använder HaloPlex och Sanger sekvensering Alla SNP:s och mutationer som hittats i generna PKP2, DSP, DSC2, DSG2 and JUP med Sanger hittas också med HaloPlex (27 prover) Några ytterligare mutationer hittas med HaloPlex-sanna Analysen nu ackrediterad av Swedac
Validering Valideringen svår-speciellt deletioner och insertioner Referensprover-ex Platinum genomes Validering blir dyrt när det är en dyr teknik Svensk förening för medicinsk genetik-sfmg guidelines men också exempel?
Bedömning av varianter Bedöma patogenicitet hos en variant är svårt!!! Bra lagarbete behövs-medicinsk, laborativ, bioinformatisk kompetens American Collage for Medical Genetics ACMG clinical laboratory standards for nextgeneration sequencing Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology
Stora hjärtpanelen/plötslig hjärtdöd Plötslig hjärtdöd är ofta svårt att diagnostisera (framförallt hos unga och barn) och dödsorsaken kan vara svårbestämd Många fall har en genetisk orsak Sekvensering av de gener som misstänks vara inblandade kan bidra till diagnos eller fastställande av dödsorsak Möjliggör genetisk vägledning
Genetisk hjärtsjukdom/plötslig hjärtdöd Plötslig hjärtdöd/stora hjärtpanelen 88 gener-i samarbete med Rättsgenetik ARVC Long QT, Short QT, Brugada Hypertrophic cardiomyopathy Dilated cardiomyopathy, Marfan/Loey Dietz LV-noncompaction, CVPT, Duchenne, FHC
Sekvensering av kliniskt exom (humant) Grundtanke: Stora hjärnpanelenutvecklingstörning, med mer än 300 gener Men många skickeprover är det och geners koppling till sjukdom uppdateras ständigt Forskningsintresse Beställningstider för reagens Focused exome (Agilent), TruSightOne (Illumina). Välkommen NextSeq.
Kliniskt exom-våra slutsatser Olika assayer har olika fördelar och nackdelar med avseende på täckning och sekvenseringskvalitet Fullgod täckning fås endast med NextSeq Data från MiSeq är bättre än NextSeq och ev HiSeq NextSeq var i början inte tillräckligt bra
Sekvensering av hela genom (humant) Clinical genomics-scilife Hi10X inköpta 6 prover skickade Dataanalys pågår Förberedelse för enorma datamängder och stor datakapacitet Framtiden?
Non-Invasive Prenatal Testing Alldeles strax i kliniken!
Slutsatser Sekvensering med MiSeq ger mycket god kvalitet och säkerhet i bestämda varianter Mycket vana behövs för både det laborativa, bioinformatiken och bedömningen av varianter Tekniken mer färdig än medicinenbedömningen av varianter är svår och mycket medicinska data saknas ännu Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology ACMG clinical laboratory standards for nextgeneration sequencing Assuring the quality of next-generation sequencing in clinical laboratory practice. Gargis AS