PLASMA SOM ERSÄTTNING FÖR SERUM I KONTROLLER OCH KALIBRATORER

Hälsa och samhälle PLASMA SOM ERSÄTTNING FÖR SERUM I KONTROLLER OCH KALIBRATORER UNDERSÖKNING AV MATRISEFFEKTER FÖR ANALYS AV LÄKEMEDEL MED LC-MS/MS- TEKNIK THERÉSE ERLANDSSON Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap V, 15 hp Biomedicinska Analytikerprogrammet Juni 2012 Malmö Högskola Hälsa och Samhälle 205 06 Malmö

PLASMA SOM ERSÄTTNING FÖR SERUM I KONTROLLER OCH KALIBRATORER UNDERSÖKNING AV MATRISEFFEKTER FÖR ANALYS AV LÄKEMEDEL MED LC-MS/MS- TEKNIK THERÉSE ERLANDSSON Erlandsson, T. Plasma som ersättning för serum i kontroller och kalibratorer. Undersökning av matriseffekter för analys av läkemedel med LC-MS/MS-teknik. Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Hälsa och Samhälle, Utbildningsområde Biomedicinsk laboratorievetenskap, 2012. Vid nuvarande framställning av kontroller och kalibratorer för läkemedelsanalys med LC-MS/MS-teknik används idag serum där fibrinogenet har fällts ut med kalciumklorid. Eftersom detta tros ge upphov till ökad jonsuppression skulle plasma där fibrinogen istället tagits bort genom frysning/tining kunna användas. Denna studie har utförts för att undersöka om och hur dessa två olika matriser skiljer sig vad gäller bland annat jonsuppression och enhancement, och studien innefattar även obehandlad plasma. Studien har utförts i samband med analys av två olika metoder för läkemedel, som bland annat utgörs av neuroleptika och bensodiazepiner. Postkolonn-infusion utfördes för båda metoderna och ingen nämnvärd jonsuppression eller enhancement kunde påvisas för någon av de tre olika matriserna. Kalibreringskurvor togs även fram för att undersöka skillnader mellan matriserna och här var dessa skillnader marginella. Nyckelord: frysning/tining, jonsuppression, LC-MS/MS, läkemedelsanalys, matriseffekt, plasma, postkolonn-infusion, serum. 1

PLASMA AS REPLACEMENT FOR SERUM IN CONTROL AND CALIBRATION SAMPLES A STUDY OF MATRIX EFFECTS FOR ANALYSIS OF DRUGS WITH LC-MS/MS TECHNIQUE THERÉSE ERLANDSSON Erlandsson, T. Plasma as replacement for serum in control and calibration samples. A study of matrix effects for analysis of drugs with LC-MS/MS technique. Degree Project, 15 Credit Points. Biomedical Laboratory Science, Malmö University: Health and Society, Department of Biomedical Laboratory Science, 2012. For the current preparation of control and calibration samples for drug analysis with LC-MS/MS technique, serum is used where the fibrinogen has been precipitated with calcium chloride. Seeing as this may have an increased risk of ion suppression, it might be possible to use plasma where the fibrinogen has been removed by freeze/thaw-cycles instead. This study has been carried out to determine if and how there are any differences, such as ion suppression and enhancement, between the two matrices along with untreated plasma. The study has been performed along with two different methods for analysing drugs, such as neuroleptics and benzodiazepines. Post-column infusion was made for both methods and no appreciable ion suppression or enhancement were demonstrated for any of the three different matrices. Calibration curves were retrieved to determine differences between the matrices and these distinctions were marginal. Keywords: drug analysis, freeze/thaw, ion suppression, LC-MS/MS, matrix effect, plasma, post-column infusion, serum. 2

FÖRORD Jag skulle vilja tacka mina handledare Anders Blomgren, Anne Cato och Kerstin Larsson för en väldigt bra handledning och för allt stöd under dessa tio veckorna. Vill även rikta ett tack till Specialkemi, Labmedicin Skåne i Lund och enhetschef Boel Olsson för att jag fick tillstånd att använda material och lokaler på plats till mitt försök. 3

INNEHÅLLSFÖRTECKNING INLEDNING 5 Matriseffekter 5 Provmatriserna 6 Syfte 7 Frågeställning 7 MATERIAL OCH METOD 7 Matrisframtagning 8 Infusionstest 9 Kalibreringskurvor 10 RESULTAT 10 Infusionstest 12 Kalibreringskurvor 13 DISKUSSION 16 REFERENSER 19 4

INLEDNING Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) är ett instrument som utgörs av en vätskekromatograf (HPLC) kopplad till en masspektrometer, innehållande en jonkälla, massanalysator och detektor [1-2]. Denna teknik har kommit starkt de senaste 20 åren och används idag bland annat för analys av läkemedel. För HPLC-delen används reversed-phase kromatografi, vilket innebär att mer polära ämnen elueras ut före de mindre polära och det är här den första separationen sker för analysen. Efter detta når analyterna jonkällan, vilken här utgörs av elektrosprayjonisation (ESI) under atmosfäriskt tryck [1]. Här sker en omvandling av ämnena till gasform; genom en kapillär från HPLC trycks vätskan ut under närvaro av ett starkt elektriskt fält på ungefär 3000 V vilket leder till en bildning av ytterst små laddade droppar. Denna elektrospray som bildats med hjälp av varm kvävgas inflödandes tillsammans med vätska i jonkällan möts därefter av en motflödande ström av torr kvävgas, varpå all vätska evaporerar och en förångning sker [1-2]. Jonerna leds sedan in i vakuumet i masspektrometerns första del, kvadrupol 1 (Q1), och det är här som den första selektionen av joner av intresse sker. En kvadrupol utgörs av fyra elektroder, två med en spänning över sig och två med en radiofrekvens. Vid analys alternerar elektrodernas spänning och radiofrekvens med en hög hastighet, vilket leder till att jonerna passerar genom kvadrupolen i en vågrörelse och de sållas ut enligt deras massa-till-laddning-ratio (m/z) i stigande ordning. Denna alternation tillåter endast joner med en viss typ av m/z att passera hela vägen genom kvadrupolen och de joner som faller utanför dessa parametrar stöter emot elektroderna och kan därmed inte heller detekteras [2]. I den nästföljande intermediära delen av masspektrometern (q2) fragmenteras jonerna av en kollisionsgas, för att på nytt selekteras i tredje kvadrupolen (Q3) på samma sätt som i Q1 [1]. Jonerna når till slut en dynod som emitterar elektroner utefter jonernas respektive intensitet och antal. För en kraftigare signal vid detektionen används en elektronmultiplikator [3]. Matriseffekter Vid analys med LC-MS/MS-teknik är det vanligt att så kallade matriseffekter uppkommer. Dessa är orsakade av någon form av störning i signalen från jonkällan och faktorer som kan ge upphov till detta är sameluerande föreningar från matrisen [4] som till exempel salter, proteiner, fosfolipider och andra organiska molekyler [5-6]. Om analyten når jonkällan samtidigt som andra matriskomponenter kommer en förändring av analytens jonisationseffektivitet och reproducerbarhet att ske, vilket i signalsvaret kan yttras som jonsuppression eller ökning (enhancement) [4-5,7]. Omfattningen av matriseffekt för en analys beror dock på vilken typ av matris som används, det vill säga plasma, serum, urin, helblod och liknande, samt hur upparbetningen av proverna sker och vilka analyter det faktiskt handlar om [5]. Det är viktigt att kontrollera analysen för matriseffekter eftersom metoden annars kan få betydande konsekvenser vad gäller linjäritet, noggrannhet och sensitivitet, vilket i så fall kan påverka kvantifieringen negativt i slutändan. För att hantera matriseffekter på bästa sätt finns det två huvudsakliga moment att utnyttja, dels användandet av en intern standard (IS) där denna kompenserar för 5

eventuella matriseffekter och dels användandet av rätt typ av provupparbetning genom vilken dessa kan minskas eller undvikas. Vad gäller IS är det att föredra en deutererad homolog till analyten av intresse då denna har en nästan identisk struktur som analyten och de kommer därmed ha en retentionstid nära varandra vid eluering [5,7]. Skulle det uppstå jonsuppression vid analyten i fråga kommer även IS bli påverkad och ratiot för topparnas areor i kromatogrammet kommer då bli detsamma och jonsuppression blir därmed kompenserad för. Dessvärre är marknadsutbytet av deutererade homologa IS bristfälligt och många gånger får därför andra strukturellt analoga ämnen användas som IS istället, vilket inte ger ett lika pålitligt resultat [4-5]. Provupparbetningen måste dessutom vara så ren som möjligt. En av de vanligaste metoderna är proteinutfällning (PPT), där man tillsätter till exempel acetonitril för att fälla ut proteiner från matrisen som annars kan orsaka till exempel jonsuppression vid analys. PPT är en enkel och snabb metod, men det är inte den bästa då den brister i borttagandet av bland annat fosfolipider som också ger upphov till en del matriseffekt [5]. Vid undersökning av matriseffekter används främst postkolonn-infusion, vilket innebär att en infusionspump kopplas till ett T-kors som i sin tur är kopplat till masspektrometern från ena hållet och HPLC-delen från andra. Via injektionspumpen tillförs en lösning med alla analyter av intresse med ett konstant flöde överensstämmande med provinjektionen från HPLC och båda lösningarna möts i jonkällan. Finns det något avvikande i matrisproverna som injiceras på vanligt vis kommer detta att ge en dämpning av signalen för analyten och yttra sig som jonsuppression [7-8]. Det är även möjligt att göra en standardkurva för varje analyt genom att spika matriserna i fråga och därefter få en uppfattning ifall det föreligger skillnader matriserna emellan. Detta är dock ingen kvantitativ undersökning på samma sätt som postkolonn-infusionstestet [7]. Provmatriserna Vid nuvarande framställning av kontroller och kalibratorer för läkemedelsanalys med LC-MS/MS-teknik på Specialkemi (Labmedicin Skåne) i Lund används idag serum där fibrinogenet har fällts ut med kalciumklorid. Detta tillvägagångssätt är smidigt då en tydlig fibrinbildning sker och det är enkelt att separera denna från övriga plasman. Dessvärre kan detta eventuellt leda till en ökad jonsuppression vid analys med LC-MS/MS-instrument eftersom kalcium- och kloridjonerna då kan konkurrera ut de övriga jonerna efter jonisering, och det finns även en ökad risk för kontaminering av masspektrometern. För att undvika detta kan det istället behövas en metod där plasma renas från fibrinogen utan tillsats av någon annan substans. Enligt tidigare utförda försök skulle frysning kunna vara en lämplig metod att prova eftersom det vid tining av färskfryst plasma (FFP) vid låga temperaturer som 1-6 C bildas ett kryoprecipitat med bland annat fibrinogen [9-11]. Om plasman sedan centrifugeras i kyla är det möjligt att separera denna utfällning från resterande plasma [9]. FFP fås då plasma avskiljs och fryses inom åtta timmar efter tappning på Blodcentralen. Plasman förvaras därefter vid en temperatur på -30 C eller lägre. Det antikoagulantia som används här är natriumcitrat, vilket binder kalcium som då förhindrar koagulation [12]. I ett försök innefattande citratplasma från hundar tinades plasman i 4 C vattenbad från -70 C och centrifugerades därefter med 3500g i 4 C under 10 minuter [11]. Här drogs slutsatsen att centrifugeringen skulle ha utförts med ett högre varvtal eftersom det inte blev någon tillräckligt tydlig pellet annars och fibrinogentrådar var då synliga även i supernatanten. Undersökningar har även gjorts då plasman 6

tinats i vattenbad vid högre temperaturer, däribland 22 C, 37 C, 45 C och 60 C [13]. Fibrinogennivåerna var antingen väldigt låga eller obefintliga vid 60 C och denna temperatur ansågs därför inte vara lämplig för tining, medan nivåerna vid 22-45 C hamnade inom referensintervallet. Detta tyder på att det vid 60 C skett en denaturering av fibrinogenet och då kanske även av andra plasmaproteiner, och att temperaturer mellan 22 C och 45 C lämpar sig bäst för tining vad gäller proteinbevarande. För att eventuellt utesluta bildning av kryoprecipitat vid så här höga temperaturer kommer detta projekt även innefatta upptining i rumstemperatur, det vill säga omkring 20 C. Detta då merparten av annan litteratur tyder på utfällning vid betydligt lägre temperaturer [9-11]. Syfte Studiens syfte är att undersöka om plasma kan ersätta serum i kontroller och kalibratorer vid läkemedelsanalys med LC-MS/MS-teknik. Studien kommer därför att innefatta en jämförelse mellan matriseffekterna hos plasma samt serum som blivit framtaget på två olika sätt för ett antal specifikt utvalda analyser med LC-MS/MS. Frågeställning Kan man med frysning och tining få fram ett serum likvärdigt det serum som idag tas fram genom utfällning med kalciumklorid? Är det möjligt att använda plasma istället för serum i kontroller och kalibratorer vid läkemedelsanalys med LC- MS/MS-teknik? MATERIAL & METOD Det grundläggande materialet för detta projekt var 2 avidentifierade påsar utgången citratplasma à 240-320 ml (märkta med nummer 067 respektive 068) från Klinisk immunologi och transfusionsmedicin i Lund, QTRAP 5500 LC- MS/MS System från AB SCIEX (Framingham, MA, USA) och ACQUITY UPLC från Waters (Milford, MA, USA). I tabell 1 återges specifikationer för Mobilfas A och B, medan tabell 2 och 3 visar en lista över substanserna som ingår i de två olika analysgrupper som har undersökts i denna studie, det vill säga Neuroleptika 1 och LCMSMS 6, där LCMSMS 6 är en analysgrupp som huvudsakligen utgörs av bensodiazepiner. Tabell 2 och 3 återger dessutom de interna standarder och fällningsreagens som använts för respektive analysgrupp. Tabell 1. Innehåll för mobilfas A respektive B. Mobilfas A Mobilfas B Milliporevatten Acetonitril Acetonitril (2 %) Milliporevatten (2 %) Myrsyra (28 mmol/l)) Myrsyra (0,1 %) Ammoniumhydroxidlösning (2 mmol/l) 7

Tabell 2. Substanser, IS och fällningsreagens för Neuroleptika 1. Substans IS Fällningsreagens Desmetylsertralin Perfenazin-d4 IS-stam Flufenazin Trimipramin-d3 Acetonitril Flupentixol Perfenazin Sertralin Zuklopentixol 8 Etanol Tabell 3. Substanser, IS, fällningsreagens och spädningslösning för LCMSMS 6. Substans IS Fällningsreagens Spädningslösning Alprazolam Diazepam-d5 IS-stam Mobilfas A Dextropropoxifen Klonazepam-d4 Acetonitril Acetonitril Diazepam Nitrazepam-d5 Etanol Flunitrazepam Klonazepam Lorazepam Nitrazepam Nordazepam Norpropoxifen Oxazepam Triazolam Zolpidem Zopiklon Nordiazepam-d5 Norpropoxifen-d5 Oxazepam-d5 Propoxifen-d11 Triazolam-d4 Zolpidem-d6 Matrisframtagning Citratplasman, befintlig i två påsar, tinades i 37 C vattenbad och portionerades därefter upp i varsin bägare för att blandas på magnetomrörare under en halvtimme. Plasman sattes sedan till fyra stycken 15 ml centrifugrör per påse, det vill säga totalt åtta rör. Resterande plasma portionerades upp i 50 ml rör och frystes ner vid -20 C för eventuell senare användning. Fyra av 15 ml rören placerades i en -20 C frys och de resterande fyra rören i en -80 C frys. Dagen efter togs de frysta plasmaproverna ut; två av rören från varje frys sattes i en 4 C kyl för tining medan de övriga proverna tinades i rumstemperatur vid ca 20 C. När plasman såg relativt klar ut och fri från iskristaller, vilket tog plasman i rumstemperatur drygt 1-1½ h och plasman i kylen 3-3½ h, centrifugerades rören vid respektive upptiningstemperatur under 10 minuter. Två olika centrifuger användes för de olika temperaturerna med inställning motsvarande 4000g. Nivån av respektive kryoprecipitat noterades utefter volym i µl, varpå plasman i supernatanten överfördes till ett nytt 15 ml centrifugrör. Detta placerades på nytt i en frys med samma temperatur som föregående nedfrysning, togs upp nästföljande dag och hela denna process upprepades under totalt fyra frysning/tinings-cykler. Därefter ansågs nivån av kryoprecipitatet vara tillräckligt låg för att matrisen skulle kunna användas i försöket. 40 ml överbliven plasma från påsen märkt med nummer 067 användes för serumframställning enligt nuvarande tillvägagångssätt. Röret togs ut från frysen och tinades i 37 C vattenbad och tömdes därefter i en bägare. 430 µl 2 mol/l kalciumklorid tillsattes och bägaren placerades sedan på en magnetomrörare under två timmar. Efter denna tid hade ett tydligt fibrinprecipitat bildats och

kunde lätt avlägsnas från det framtagna serumet. Ytterligare ett rör med 40 ml plasma från påse nummer 067 tinades och centrifugerades därefter vid 2150g i 20 C under 10 minuter. Centrifugeringen utfördes här då denna plasma var betydligt mer grumlig än de två andra framtagna matriserna. Dessa två matriser tillsammans med det framrenade serumet från frysning/tinings-försöket, även detta från påse nummer 067, användes sedan för försökets övriga moment. Infusionstest För att kunna kontrollera matriserna för matriseffekter förbereddes lösningar innehållande analyterna i fråga. En huvudstamlösning gjordes för varje analysgrupp, med koncentrationen 10 µmol/l för Neuroleptika 1 och 5 µmol/l för LCMSMS 6. Etanol användes som spädningslösning. En buffert tillverkades med 90 % mobilfas A och 10 % mobilfas B och användes sedan för att preparera injektionslösningarna för infusionstestet tillsammans med analytstamlösningarna. För varje analysgrupp gjordes injektionslösning i tre koncentrationer: 10, 25 och 100 nmol/l. De tre matriserna som tagits fram, det vill säga serum som fällts ut med kalciumklorid, serum som tagits fram genom frysning/tining samt centrifugerad plasma, preparerades därefter som tre olika prov för varje analysgrupp. För Neuroleptika 1-beredningen överfördes 100 µl matris till ett 1,5 ml eppendorfrör och 200 µl fällningsreagens sattes till. Provet mixades med hjälp av vortex och centrifugerades därefter i 4 minuter på 20000g. 200 µl supernatant överfördes sedan till en glasvial och proverna placerades i instrumentet. LCMSMS 6-beredningen utfördes likadant, med undantag i stegen efter centrifugering då 20 µl av spädningslösning sattes till vial och därefter mixades med 150 µl supernatant. Instrumentet kopplades om genom att T-korsningen kopplades på och infusionspumpen tillhörande postkolonn-infusionen placerades i pumpläget. Innan infusionstestet påbörjades gjordes en kontroll över vilken intensitet analyterna hamnade vid, vilket utfördes genom manual tuning-läget hos instrumentet. För denna kontroll användes lösningen med koncentrationen 25 nmol/l och denna koncentration visade sig hamna på en lagom intensitetsnivå och användes därför för infusionstestet för respektive analysgrupp. Därefter förbereddes instrumentet för postkolonn-infusion genom att instrumentet ställdes om till vanligt provanalysläge, med undantag från att infusionspumpen tillförde ett konstant flöde på 10 µl/min av infusionslösningen med analyterna i fråga. I tabell 4 och 5 syns ett schema över gradienterna som användes för respektive analysmetod. Tabell 4. Gradientschema för Neuroleptika 1. Tid (min) Flöde (ml/min) Mobilfas A (%) Mobilfas B (%) Från början 0.6 90.0 10.0 0.30 0.6 90.0 10.0 0.35 0.6 75.0 25.0 1.30 0.6 65.0 35.0 1.40 0.6 0.0 100.0 1.90 0.6 0.0 100.0 1.95 0.6 90.0 10.0 2.30 0.6 90.0 10.0 9

Tabell 5. Gradientschema för LCMSMS 6. Tid (min) Flöde (ml/min) Mobilfas A (%) Mobilfas B (%) Från början 0.45 95.0 5.0 0.30 0.45 95.0 5.0 1.00 0.45 80.0 20.0 4.40 0.45 70.0 30.0 4.60 0.45 0.0 100.0 5.20 0.45 0.0 100.0 5.25 0.45 95.0 5.0 5.40 0.45 95.0 5.0 Kalibreringskurvor Utifrån de huvudstamlösningar som gjordes för respektive analysgrupp i föregående steg preparerades sedan en spädningsserie, en för varje matris i varje grupp. Koncentrationsnivåerna bestämdes baserat på den lägsta och högsta befintliga kalibratorn som används för respektive metod i dagsläget. För Neuroleptika 1 användes en spädning på 1:2,5 och för LCMSMS 6 en spädning på 1:2. Tabell 6 återger de olika koncentrationerna som togs fram för de båda grupperna. Efter att alla spädningar genomförts, preparerades alla som varsitt prov enligt de befintliga provförberedelser som användes även i föregående steg för respektive analysgrupp. Totalt blev det 54 prover, inklusive ett blankprov för varje matris. Proverna analyserades på vanligt vis och kalibreringskurvorna togs fram och betraktades därefter via mjukvaran Analyst Software från AB SCIEX (Framingham, MA, USA). Tabell 6. Spädningsserierna som användes för kalibreringskurvorna för respektive analysgrupp. Neuroleptika 1 (nmol/l) 1,6384 23,4375 4,096 46,875 10,24 93,75 25,6 187,5 64 375 160 750 400 1500 1000 3000 LCMSMS 6 (nmol/l) RESULTAT Vad gäller framtagningen av serum genom frysning/tinings-cykler blev resultaten väldigt likvärdiga. Fyra frysning/tinings-cykler utfördes och att döma av diagrammen nedan fortsätter nivån kryoprecipitat att sjunka. I diagrammen har även den kumulativa procenten tagits med för att tydligt visa att den totala mängden kryoprecipitat faktiskt ökat för varje gång. Alla prover som tinats i 4 C visar samma tendens att fälla ut mindre och mindre kryoprecipitat vilket demonstreras i figur 1, med undantag för prov nummer 068 som varit fryst i - 10

20 C. Av någon anledning har det skett en kraftigare utfällning vid frysning/tining nummer 3, men den kumulativa procenten visar ändå på en likadan ökning som de övriga proverna. Figur 2 visar denna händelse. Samma frysning/tining men av prov nummer 067 visar en tendens till att fälla ut mer även här jämfört med proverna som varit frysta i -80 C, men den överstiger inte föregående utfällning som nummer 068. Figur 1. Diagram för prov 067 som varit fryst i -80 C och tinats i 4 C. Liknande resultat visades för prov 068 vid samma frysning-/tiningstemperaturer. Figur 2. Diagram för prov 067 som varit fryst i -20 C och tinats i 4 C. Delvis liknande resultat visades för prov 068 vid samma frysning-/tiningstemperaturer. Alla prover som tinats i rumstemperatur visade samma utfällningsmönster, vilket var att mängden kryoprecipitat bara fortsatte att öka för varje frysning/tining. Detta försök avslutades därför redan efter bara tre frysning/tinings-cykler. I figur 3 syns ett exempel på detta resultat, vilket yttrade sig likadant i diagrammen för de tre andra proverna. I de fortsatta försöken för denna studie användes serum och plasma från påse 067. 11

Figur 3. Diagram för prov 067 som varit fryst i -80 C och tinats i 20 C. Infusionstest Varje kromatogram som togs fram för respektive substans i varje analysgrupp överlappades med ett kromatogram för varje matris. På så sätt är det möjligt att se hur varje matris har agerat jämfört med mobilfasen och jämfört med varandra. I varje kromatogram nedan är mobilfasen representerad av blå linje, plasma röd, serum framställt med kalciumkloridutfällning grön och det serum som tagits fram genom frysning/tining representeras av grå linje. Efter noggrann observation av alla substansers överlappande kromatogram konstaterades att ingen betydande jonsuppression eller enhancement är närvarande omkring någon substans retentionstid (RT). Därför tas endast ett exempel med från varje analysgrupp här. Däremot kunde en nämnvärd jonsuppression iakttas mot metodens slut, efter att alla substanser av intresse eluerats ut. Enligt gradientschemat för Neuroleptika 1 sker en omkoppling till 100 % mobilfas B efter 1.40 till 1.95 minuter och det är också omkring dessa tider som jonsuppressionen börjar. Här kommer de mer opolära matriskomponenterna ut, däribland lipoproteiner, vilket kan vara en förklaring till kromatogrammets utseende. XIC of +MRM (8 pairs): 401.200/221.400 Da ID: Zuklopentixol from Sample 7 (Mobilfas inj 3) of Jonsupp_Neur1_120328.wiff (Turbo Spray) Max. 6.6e5 cps. 6.5e5 6.0e5 5.5e5 Blå = Mobilfas Röd = Plasma Grön = CaCl 2-serum Grå = frysning-/tinings-serum 1.96 2.14 5.0e5 4.5e5 In te n s ity, c p s 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 1.68 2.0e5 1.5e5 1.0e5 0.17 0.76 1.40 0.95 0.98 1.01 1.15 1.34 1.10 1.28 1.42 1.49 5.0e4 0.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 Time, min Figur 4. Kromatogram för Zuklopentixol i Neuroleptika 1 (RT = 1,28). I figur 4 visas hela kromatogrammet för Zuklopentixol i Neuroleptika 1. Dess RT är 1,28 minuter och dess elueringsområde är markerat i bilden. Zuklopentixols IS 12

är deutererad och elueras därmed kring samma tid. För denna syntes inte heller någon jonsuppression. Figur 5 visar den senare delen av samma kromatogram, från 1,60 minuter. Här syns en mer påtaglig jonsuppression i form av de nedsänkta partierna under mobila fasens linje. Dock beter sig alla tre matriser nästan identiskt. I figur 6 återges kromatogrammet för Nitrazepam i LCMSMS 6 som har en retentionstid på 2,68 minuter, även denna med en deutererad IS för vilken suppression ej kunde observeras. XIC of +MRM (8 pairs): 401.200/221.400 Da ID: Zuklopentixol from Sample 7 (Mobilfas inj 3)... Max. 6.6e5 cps. 6.6e5 6.4e5 6.2e5 6.0e5 5.8e5 5.6e5 5.4e5 5.2e5 5.0e5 4.8e5 4.6e5 4.4e5 4.2e5 4.0e5 3.8e5 3.6e5 Blå = Mobilfas Röd = Plasma Grön = CaCl 2-serum Grå = frysning-/tinings-serum 1.96 Intensity, cps 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 1.68 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 Jonsuppression 4.0e4 2.0e4 0.0 1.60 1.65 1.70 1.75 1.80 1.85 1.90 1.95 2.00 2.05 Time, min Figur 5. Exempel på jonsuppression i ett kromatogram tillhörande Zuklopentixol i Neuroleptika 1, dock i ett icke-påverkande elueringsområde. XIC of +MRM (24 pairs): 282.300/236.200 Da ID: Nitrazepam from Sample 6 (Mobilfas inj 3) of Jonsupp_LCMSMS6_120330.wiff (Turbo Spray) Max. 1.6e6 cps. 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 Blå = Mobilfas Röd = Plasma Grön = CaCl 2-serum Grå = frysning-/tinings-serum 1.1e5 In te n s ity, c p s 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 0.94 1.16 4.89 1.33 1.85 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 Time, min Figur 6. Kromatogram för Nitrazepam i LCMSMS 6 (RT = 2,68). Kalibreringskurvor Många av substanserna uppvisade samma typ av mönster vad gäller skillnader mellan de tre olika matriserna och därför tas det i resultatredovisningen endast med exempel på de mest typiska mönstren för substanserna. I Neuroleptika 1 syntes tydligast matrisskillnad i kalibreringskurvorna för perfenazin och sertralin. 13

Hos sertralin, tillsammans med desmetylsertralin och zuklopentixol, tenderade serumet som framställts genom kalciumkloridutfällning att ha en högre signal jämfört med de två andra matriserna, vilket syns i figur 7. Den obehandlade plasman och serumet som tagits fram genom frysning/tining visade inte samma konsekventa mönster utan deras linje var något mer avvikande. Tabell 7 återger koncentrationsnivåerna för sertralin under de gränser inom vilken linjäritet fanns, vilket var upp till 160 nmol/l. Untitled 1 (S-Sertr): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 0.0183 x + -0.000562 (r = 0.9997) 1.0e1 A n a ly te A re a / IS A re a 1.0e0 1.0e-1 1.0e1 1.0e2 1.0e3 Analyte Conc. / IS Conc. Figur 7. Standardkurva för kalciumklorid-serum för sertralin (Neuroleptika 1). Tabell 7. Koncentrationsnivåer för varje matris för Sertralin. Verklig koncentration (nmol/l) CaCl 2 -serum (nmol/l) Plasma (nmol/l) Frysning- /tiningsserum (nmol/l) 1,6384 1,74 1,19 1,04 4,096 4,05 3,34 2,95 10,24 9,43 7,05 8,37 25,6 25,6 18,8 21,8 64 66 55 49,5 160 159 152 136 För perfenazin, tillsammans med flupentixol och flufenazin, uppvisar den obehandlade plasman tydligast mönster genom att återge något lägre signal än de övriga matriserna. Detta visas i figur 8. Dock tenderar kalciumklorid-serumet att hålla en högre nivå även här, precis som för bland annat sertralin, men inte lika tydligt i jämförelse till frysning-/tiningsserumet för perfenazin. I tabell 8 återges koncentrationsnivåerna för matriserna hos perfenazin, linjäritet upp till 64 nmol/l. 14

Untitled 1 (Perfe-S): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 0.0636 x + -0.00715 (r = 0.9999) 1.0e1 A n a ly te A re a / IS A re a 1.0e0 1.0e-1 1.0e1 1.0e2 1.0e3 Analyte Conc. / IS Conc. Figur 8. Standardkurva för plasma för perfenazin (Neuroleptika 1). Tabell 8. Koncentrationsnivåer för varje matris för perfenazin. Verklig koncentration (nmol/l) CaCl 2 -serum (nmol/l) Plasma (nmol/l) Frysning- /tiningsserum (nmol/l) 1,6384 1,46 1,15 1,14 4,096 4,41 3,47 3,68 10,24 10,4 8,8 9,43 25,6 26,4 22,4 25,8 64 62,9 58,4 61,2 För substanserna i LCMSMS 6 var en lägre koncentrationsnivå för den obehandlade plasman som mest påtaglig. Detta gäller för alla substanser i LCMSMS 6 utom lorazepam, alprazolam och dextropropoxifen, där inga specifika betydande skillnader kunde observeras. Diazepam har valts som exempel då dess standardkurva visade tydligast hur plasman förhöll sig till de två andra matriserna, vilket återges i figur 9. Tabell 9 visar de olika koncentrationerna som varje matris kunde återge i förhållande till den verkliga. Med undantag från frysning-/tiningsserumet var både CaCl 2 -serumet och plasma linjära upp till full koncentration. Tabell 10 och 11 återger högsta och lägsta värdet i procent för noggrannhet (benämns som acc för accuracy i tabellerna) tillsammans med r 2 - värdet för sertralin och perfenazin i Neuroleptika 1, respektive lorazepam och diazepam i LCMSMS 6. Therese_LCMSMS6_120426.rdb (S-Diaze): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 0.00309 x + -0.019 (r = 0.9999) 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 A n a ly te A re a / IS A re a 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 Analyte Conc. / IS Conc. Figur 9. Standardkurva för plasma för diazepam (LCMSMS 6). 15

Tabell 9. Koncentrationsnivåer för varje matris för diazepam. Verklig koncentration (nmol/l) CaCl 2 -serum (nmol/l) Plasma (nmol/l) Frysning- /tiningsserum (nmol/l) 23,4375 23,9 18,7 22,4 46,875 45,9 37,8 44,7 93,75 93 81,4 90,9 187,5 182 164 185 375 379 342 368 750 767 715 755 1500 1530 1410-3000 2950 2770 - Tabell 10. Värden för noggrannhet i procent och r 2 för respektive kalibreringskurva. CaCl 2 -serum Plasma Frysning-/tiningsserum Högsta acc, Sertralin 101,6 117,6 107,9 Högsta acc, Perfenazin 107,6 102,3 104,5 Lägsta acc, Sertralin 95,7 90,7 92,6 Lägsta acc, Perfenazin 88,8 97,9 96,7 r 2 -värden, Sertralin 0,9997 0,9990 0,9998 r 2 -värden, Perfenazin 0,9994 0,9999 0,9995 Tabell 11. Värden för noggrannhet i procent och r 2 för respektive kalibreringskurva. CaCl 2 -serum Plasma Frysning-/tiningsserum Högsta acc, Lorazepam 106,0 112,6 105,2 Högsta acc, Diazepam 102,3 106,4 103,2 Lägsta acc, Lorazepam 94,1 94,6 96,4 Lägsta acc, Diazepam 96,8 96,3 98,7 r 2 -värden, Lorazepam 0,9996 0,9996 0,9995 r 2 -värden, Diazepam 0,9998 0,9999 0,9999 DISKUSSION Detta försök har innefattat ett antal tester för att undersöka matriseffekter hos prepareringsmatrisen som idag används på Specialkemi, Labmedicin Skåne i Lund. Syftet var att kontrollera dels ifall dagens matris ger någon form av påverkan vid läkemedelsanalys, men även huruvida två andra typer av matriser skulle kunna användas istället. En av dessa matriser var ett serum som tagits fram genom frysning/tining för att få bort fibrinogenet som finns i ett kryoprecipitat som bildas på detta sätt. Förhoppningen var att denna matris skulle vara renare och ge mindre påverkan vid analyserna än det serum som bildats via tillsats av kalciumklorid. Denna del av försöket innefattade fyra frysning/tinings-cykler då det ansågs vara tillräckligt liten mängd fibrinogen kvar vid det laget. Detta utfördes dock endast för alla prover som tinats i kyl i 4 C eftersom de prover som tinats i rumstemperatur visade en tendens till att fälla ut mer och mer fibrinogen per cykel. Dock var nivåerna för dessa prover cirka tio gånger lägre än för de som tinats i 4 C, vilket tyder på att det troligtvis skulle krävas många fler cykler för att få allt fibrinogen att fälla ut, i förhållanden till mängden per gång. Utifrån de 16

beräkningar som gjordes och de diagram som togs fram visar det sig att 4 C är den mest lämpliga upptiningstemperaturen. Vad gäller frystemperaturen torde det inte vara av någon avgörande roll för vilken temperatur som är mest lämplig då både -20 C och -80 C har gett likvärdiga resultat. Däremot visade båda proverna som varit frysta i -20 C och tinats i 4 C något mer avvikande resultat, nämligen att fälla ut mer vid tredje cykeln. Eftersom att alla prover har behandlats lika så är detta helt klart en påtaglig skillnad gentemot de prover som varit frysta i -80 C och därför skulle -80 C kunna ses som en mer lämplig frysningstemperatur för eventuella framtida försök. Utifrån ett tidigare försök [11] rekommenderades en högre centrifugeringshastighet än 3500g då det vid denna hastighet blev en mindre tydlig pellet och synliga fibrinogentrådar i supernatanten. Därför användes istället 4000g för detta försök och andelen fibrinogentrådar i supernatanten blev relativt liten. Olika centrifuger användes för de olika upptiningstemperaturerna då den ena centrifugen lämpade sig bättre för lägre temperaturer och tvärtom. Baserat på de andra tester som gjorts i detta försök visar det sig dock att detta nya serum framtaget via frysning/tining inte nödvändigtvis är den bästa matris att använda för detta syfte. Genom postkolonn-infusionen kunde ingen påtaglig jonsuppression observeras för någon av de tre matriserna vad gäller någon substans i de olika analysmetoderna. Jonsuppression var endast synlig under analysens början eller senare del, där gradienterna för analysgrupperna varierar, och ingen av analyterna eller deras IS påverkas inom dessa områden. Under de tidigare områdena tros det istället vara mer polära oorganiska föreningar som elueras ut [8], medan det mot slutet är mer opolära ämnen som till exempel fosfolipider [5]. Fosfolipider finns i riklig mängd i plasma och det är därför extra viktigt med en bra upparbetning av proverna innan analys. För de båda analysgrupperna används nu proteinutfällning (PPT) som upparbetning, vilken har både för- och nackdelar. Fördelen är att det är en snabb metod för att få bort proteiner med, men den brister vad gäller andra endogena kompontenter i matriser, såsom fosfolipider [14]. Däremot är mängden fosfolipider åtminstone mindre ifall acetonitril används för denna upparbetningen, vilket är det som används för metoderna idag [5]. Om det hade visat sig att fosfolipider eller andra matriskomponenter hade gett jonsuppression inom samma elueringsområden som analyterna hade man behövt överväga huruvida en annan upparbetsningsmetod skulle användas istället. Ett lämpligt val hade då varit solid phase extraction (SPE), då denna tar bort både proteiner och fosfolipider, men det är en väldigt tidskrävande metod [5,14]. Även supported liquid extraction (SLE) sägs vara en väldigt effektiv och bra metod, men det är ett relativt nytt tillvägagångssätt som är på uppgång [5]. Utifrån varje kalibreringskurva som togs fram för respektive substans kunde en del skillnader observeras. De olika matriserna gav olika signalsvar för olika substanser, men dessa olikheter är väldigt marginella i det stora hela. Eftersom kalciumklorid-serumet är den matris som används idag lämpar sig en jämförelse utifrån denna bäst och därigenom ses att de två andra matriserna knappt avviker. Alla har en förmåga att återge en tillräckligt kraftig signal för att vara lämpliga att använda för analysmetoderna. För LCMSMS 6 fick dock frysning-/tiningsserumet räknas bort i de två högsta kalibreringspunkterna. Av okänd anledning hade något blivit fel vid själva injektionen och det fanns därför inga värden att utgå ifrån. Bortsett från detta stämmer dock alla substansers linjäritet utifrån deras 17

ursprungliga koncentrationer. Noggrannheten för kurvorna, det vill säga det värde som anger hur kvantitativt nära matriserna är det riktiga koncentrationsvärdet, varierade för varje substans. Värdet låg som högst på 117 för Neuroleptika 1, 112 för LCMSMS 6 och som lägst på 88 för Neuroleptika 1 och 94 för LCMSMS 6, vilket inte är alltför avvikande värden då acceptabla värden bör vara så nära 100 som möjligt. Denna typ av test säger dock inte särskilt mycket om den kromatografiska profilen, utan ger mer en bedömning huruvida de olika matriserna skiljer sig från varandra [7] Kalciumklorid-serumet tenderar att återge koncentrationerna något bättre än de två övriga matriserna, men skillnaderna är fortfarande inte tillräckligt avvikande från varandra och det är därför ingen anledning som talar för att just detta serum är att föredra i slutändan. Baserat på alla resultat som uppnåtts skulle alla tre matriserna vara godkända att använda för analysmetoderna som försöket har utförts för. Ingen jonsuppression kunde detekteras inom de elueringsområden där analyterna och dess IS förekommer och skillnaderna matriserna emellan är så pass marginella att det inte är något som påverkar provresultatet i större omfattning. Plasma hade varit att föredra eftersom det endast krävs en centrifugering innan denna matris går att använda, till skillnad från de två andra matriserna som kräver en mer omfattande provupparbetning. Genom att använda plasma blir processen både mindre tidskrävande samt mer ekonomiskt fördelaktig och laboratoriet behöver då inte strukturera om lika mycket bland personalen och andra arbetssysslor. Däremot skulle olika typer av plasma kunna ge olika typer av resultat; lipemisk plasma eller olika typer av antikoagulantia skulle kanske kunna ge upphov till jonsuppression inom analyternas områden [14], men det är inget som denna studie har fokuserat på. 18

REFERENSER 1. Gross H J (2004) Mass Spectrometry A textbook. Berlin: Springer-Verlag. 2. Lavagnini I et al (2006) Quantitative Applications of Mass Spectrometry. Chichester: John Wiley & Sons Ltd. 3. Aitken A (2005) Mass spectrometric techniques. Walker J & Wilson K (red.) Principles and techniques of biochemistry and molecular biology (6e uppl.). New York: Cambridge University Press, s. 405-448. 4. Van De Steene J C et al (2006) Tackling matrix effects during development of a liquid chromatographic-electrospray ionisation tandem mass spectrometric analysis of nine basic pharmaceuticals in aqueous environmental samples. Journal of Chromatography A, 1123, 71-81. 5. Jiang H et al (2012) Systematic evaluation of supported liquid extraction in reducing matrix effect and improving extraction efficiency in LC- MS/MS based bioanalysis for 10 model pharmaceutical compounds. Journal of Chromatography B, 891-892, 71-80. 6. Yadav M et al (2012) Comparison of extraction procedures for assessment of matrix effect for selective and reliable determination of atazanavir in human plasma by LC-ESI-MS/MS. Journal of Chromatography B, 885-886, 138-149. 7. Bonfiglio et al (1999) The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 13, 1175-1185. 8. Vethe N T et al (2010) Determination of cyclosporine, tacrolimus, sirolimus and everolimus by liquid chromatography coupled to electrospray ionization and tandem mass spectrometry: assessment of matrix effects and assay performance. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 70, 583-591. 9. Berséus O & Högman C (1997) Blodkomponentbehandling & hemaferes. Gahrton G & Lundh B (red.) Blodsjukdomar: lärobok i hematologi (3e uppl.). Stockholm: Natur och kultur, s 404-439. 10. Sparrow R et al (2011) A protocol for the preparation of cryoprecipitate and cryodepleted plasma. Methods in molecular biology, 728(4), 259-265. 11. Parry B W & Stokol T (1995) Stability of von Willebrand factor and factor VIII in canine cryoprecipitate under various conditions of storage. Research in Veterinary Science, 59(2), 152-155. 19

12. Labmedicin Skåne: Klinisk immunologi & transfusionsmedicin (2011) Kompendium i Transfusionsmedicin 2011. 13. Isaacs MS et al (2004) In vitro effects of thawing fresh-frozen plasma at various temperatures. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis, 10(2), 143-148. 14. Van Eeckhaut A et al (2009) Validation of bioanalytical LC-MS/MS assays: Evaluation of matrix effects. Journal of Chromatography B, 877, 2198-2207. 20