Framtida tekniker MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) med tillämpning inom Talassemi. Dick Nelson Klinisk kemi, Labmedicin Skåne
α-talassemi 4 genotyper Wild type αα / αα - - α + -talassemi α 0 -talassemi αα / α - αα / - - α - / α - - - / α - - - / - - eller Ingen anemi mild anemi anemi neonatal död (tyst) α + -talassemi α + -talassemi HbH HbBart
Deletionsanalys för α-globin (α-talassemi), många varianter! α-globin cluster : kromosom 16 och sträcker sig över ~30kb ~128 olika DNA defekter kända för α-talassemi. α-talassemi karakteriseras till ~80% deletioner. Kr. 16 α-locus
Deletionsanalys för α-globin (α-talassemi), många varianter! α-globin cluster : kromosom 16 och sträcker sig över ~30kb ~128 olika DNA defekter kända för α-talassemi. α-talassemi karakteriseras till ~80% deletioner. Kr. 16 α-lokus
Finns flera tekniker för deletionsanalys, dock med tekniska, resursmässiga, etc begränsningar vilket gör att intressantare alternativ vore önskvärt. Gap-PCR Southern blot FISH m.fl Ett alternativ till ovan är MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification)
Vad krävs på laboratoriet för en MLPA analys? Utföra hybridisering resp ligeringsexperiment PCR Kapillärelektrofores Ingen speciell DNA preparering Alltså kända moment resp instrument som finns på många molekylärgenetiska lab.
MLPA kemisk princip (steg 1) Denaturering & Hybridisering Probe-par med: a) identiska sekvenser i 3 (Y-prober) samt 5 (X-prober) för alla probe-par. b) ena proben (X-proben) med olika stuffer seq. längd
MLPA kemisk princip (steg 2) Ligering Proberna är placerade direkt i anslutning till varann. Saknas target (deletion) ingen ligering!
MLPA kemisk princip (steg 3) PCR PCR görs på ligerade proberna! Multiplex PCR Ett primer-par till alla amplifieringarna Forward primer (fluoroscenseinmärkt, FAM) PCR produkter skiljer som minst 3-4 baspar
MLPA kemisk princip (steg 4) Fragmentanalys av PCR produkterna Fluoroscenseinmärkta primers kapillär el.fores Differensen i relativ mängd (patient/kontroll prober) ger resultatet. Beräkning med GeneMarker (mjukvara)
Beräkning: relativ beräkning för varje probe mot ref.proberna ratio 1.0 (= två kopier)
MLPA stort användningsområde. Erhåller kvantitativa skillnader för homozygota resp heterozygota deletioner, duplikationer eller kromosomer skillnader(ex. trisomi). Kan användas för punkt mutationer
Exempel: En patient med α 3.7 deletion skulle i en genomförd MLPA analys sakna följande sekvenser. α 3.7
Utförande (sammanfattning) Tämligen straight forward enligt vedertagen labpraxis när det gäller hybridisering, ligering resp PCR följa protokollet. Nästföljande steg kapillärelektrofores enligt leverantörs anvisningar. Slutlig analys görs med mjukvara GeneMarker Intresserade kontaka: Agneta Östensson (040-336447) Rebecca Rappner (040-333261)
Leverantör: MRC-Holland Finns stort antal MLPA applikationer till hands. SUS, Malmö (klin.kem) utvärderat α-talassemi kit. 28 prober täcker undersökta områden på α-locus
Slutlig analys - 1 Constant Spring SNP heterozygot SEA
Slutlig analys - 2 Wild type
Slutlig analys - 3 α - / α - homozygot α 3.7
Slutlig analys - 4 ~50%? SNP störning? αα / α - heterozygot α 3.7
Slutlig analys - 5 α-triplett, αα/ααα anti3.7
Resultaten är inte alltid klockrena!!! Diagnostiken baseras inte enbart på MLPA! Läs bipacksedeln noga detaljer där hjälper till i tolkningen! Dock för sammanhängande deletionspartier bör tolkning med tillräcklig säkerhet kunna göras. Enstaka deletioner ska tas till stort övervägande.
Validering (α-talassemi med MLPA) har inkluderat: Detektionsgräns Riktighet (mot:sekvensanalys, gap-pcr) Repeterbarhet Totala intrycket tillfredställande, samt inga avvikelser kopplade till kemi, instrumentering etc. har observerats som kan leda till felaktigt svar.
Fördelar & nackdelar Rubust och hög reproducerbarhet [ ] Känsligheten hög [ ] Upp till 40 targets kan studeras i varje prov [ ] Ej dyra och invecklade analysinstrument [ ] Utvecklingsbar [ ] Brett användningsområde (deletioner, SNP, kvant.) [ ] Finns kontaminationsrisk [ ] Tolkningsproblematik att ta ställning till. [ ] Ekonomisk [ ]
fortsättningen. På samma sätt som för α-talassemi har β- talassemi MLPA satts upp. MODY Utveckla egna prober för fördjupa oss i tekniken.
Litteratur 1. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Schouten J.P. et al, Nuclleic Acids Research, 2002;30:e20 2. Nine unknown rearrangements in 16p13.3 and 11p15.4 causing α- and β-thalassaemia characterised by high resolution multiplex ligation-dependent probe amplification. Harteveld C.L. et al, J Med Genet 2005;42:922-931
Medarbetare Agneta Östensson Rebecca Rappner Camilla Valtonen-Andre