Utveckling av en LC-MS/MS metod för analys av 12 antipsykotiska läkemedel och 9 metaboliter i humanplasma

Examensarbete Utveckling av en LC-MS/MS metod för analys av 12 antipsykotiska läkemedel och 9 metaboliter i humanplasma Författare: Malin Nilsson Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå:: Grundnivå 1

Utveckling av en LC-MS/MS metod för analys av 12 antipsykotiska läkemedel och 9 metaboliter i humanplasma Malin Nilsson Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp Filosofie kandidatexamen Biomedicinska analytikerprogrammet 180 hp Linnéuniversitetet, Kalmar Intern handledare Sven Tågerud, Professor Extern handledare Björn Carlsson, Med Dr. Examinator Maria Bergström, Universitetslektor Inst. För Kemi och Biomedicin Linnéuniversitet i Kalmar Avd. Klinisk farmakologi Linköpings universitetssjukhus Inst. För Kemi och Biomedicin Linnéuniversitetet i Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 hp Sammanfattning Antipsykotika är läkemedel som används för behandling av psykotiska symtom hos patienter som lider av t.ex. schizofreni eller bipolär sjukdom. Att hitta rätt behandling kan vara svårt och kräver att man noga övervakar koncentrationen i blodet. Med upprepade blodprov och så kallat terapeutiskt intervall (TDM) går det att optimera behandlingen, övervaka patientens respons på behandlingen samt eventuella interaktioner med andra läkemedel. Det går även att följa hur noga patienten är med att ta sina mediciner så kallat följsamhet eller compliance. Syftet med detta projekt har varit att utveckla en ny metod för att mäta 12 antipsykotiska läkemedel och 9 metaboliter i plasma med UHPLC-MS/MS. Det experimentella arbetet i detta projekt delades in i sex olika steg: (1) Beredning av stamlösningar och infusionslösningar av eftersökta substanser och deras internstandarder till rätt koncentration (2) Beräkning av molekylmassan för monoisotopen av varje substans. (3) Optimering av konvolt och kollisionsenergi (4) Optimering av kromatografin med val av lämplig mobilfas och kolonn (5) Beredning av kalibreringslösningar (6) Extraktion av substanser i plasma. Extraktionsmetoden som användes var proteinutfällning och analysen utfördes på Acquity I Class kopplat till Xevo TQ-XS MS. Separation gjordes med Cortects UPLC C18 (1,6 µm 2,1x50 mm) och gradienteluering med ett flöde på 0,5 ml/min och tiden för analys 5,20 min. Detektionen gjordes med MRM och två transitioner per substans. Isotop-inmärkt internstandard användes för 9 av substanserna. För att metoden ska kunna användas vid rutinanalys återstår en del arbete när det kommer till validering, optimering av masspektrometerns inställningar, test av extraktionsutbyte, matriseffekter och analys av patientprov. Nyckelord: Terapeutiskt intervall, LC-MS/MS, Neuroleptika, Antipsykotika

ABSTRACT Antipsychotics (AP) are used to treat psychotic symptoms in patients with e.g. schizophrenia or bipolar disorder. To find the right treatment may be difficult and demands carefully monitoring of the concentration in blood tests. In psychopharmacology therapeutic drug monitoring (TDM) of antipsychotics is an important tool for optimizing the treatment. With repeated blood tests it is possible to monitor the patient response, interactions and compliance. The aim of this project was to develop a method for sample preparation and analysis by UHPLC-MS/MS suitable for 12 antipsychotic drugs and 9 major metabolites in human plasma samples. The project was divided in to six different steps (1) Preparation of stock solutions and infusions of the analytes and internal standards. (2) Calculation of the monoisotopic molecular weight. (3) Optimization of the cone voltage and collision energy (4) Optimization of the chromatography by selecting the ideal mobile phase and column (5) Preparation of the calibration curve (5) Extraction with protein precipitation (6) Analysis on an Acquity I Class coupled to an Xevo TQ-XS MS and separation on a Cortects UPLC C18 (1.6 µm 2.1x50 mm) with gradient elution at 0.5 ml/min and a 5.20-min run-time. Detection was made with MRM, monitoring 2 ion transitions per compound. Isotope labeled internal standards were used for 9 of the compounds. In order for the method to be used in routine analysis, some work remains to be done regarding validating, optimizing the mass spectrometer's settings, testing for extraction yield, matrix effects and analysis of patient samples.

FÖRKORTNINGAR UHPLC LC-MS/MS MeOH ACN AmAc DMSO TDM ESI TIC IS m/z RP MRM Ultra high performance liquid chromatography Liquid chromatography tandem mass spectrometry Metanol Acetonitril Ammoniumacetat Dimetylsulfoxid Therapeutic drug monitoring Electrospray ionization Total ion current Internstandard Massa/laddning Reversed phase Multiple reaction monitoring

INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1. INTRODUKTION... 1 1.1 Psykisk sjukdom... 1 1.2 Psykos... 2 1.3 Schizofreni... 2 1.3.1 Behandling vid schizofreni... 3 1.4 Bipolär sjukdom... 3 1.4.1 Bipolär typ I... 4 1.4.2 Bipolär typ II... 4 1.4.3 Behandling vid bipolär sjukdom... 5 1.5 Dopaminhypotesen... 5 1.6 Neuroleptika... 5 1.6.1 Typiska antipsykotiska läkemedel... 6 1.6.2 Atypiska antipsykotiska läkemedel... 6 1.6.3 Dosering... 7 1.7 Instrumentet UHPLC... 8 1.7.1 Mobilfas... 9 1.7.2 Pump... 9 1.7.3 Injektor... 9 1.7.4 Kolonn... 9 1.7.5 Jonkälla... 10 1.7.6 Massanalysator... 11 1.7.7 Internstandard... 12 1.7.8 Detektor... 12 1.7.9 Databehandling... 13 1.7.10 Analys av antipsykotika... 13 2 SYFTE... 14 3 MATERIAL OCH METOD... 14 3.1 Kemikalier och material... 14 3.2 Instrument... 15 3.3 Beredning av lösningar... 15 3.3.1 Stamlösningar med koncentrationen 1,0 mg/ml från pulverform... 15 3.3.2 Stamlösningar med koncentrationen 1,0 mg/ml från färdig lösning... 15 3.3.3 Beredning av stamlösning för internstandard... 16 3.3.4 Kontrollösning för alla analyter, 50 ng/ml 2% MeOH... 16 3.4 Beräkning av molekylmassan... 17 3.5 Optimering av konvolt och kollisionsenergi... 17 3.6 Optimering av kromatografin... 18 3.6.1 Test av mobilfaser... 18

3.6.2 Test av kolonner... 19 3.7 Beredning av kalibreringslösningar... 20 3.7.1 Kalibreringslösning i 90:10 H 2O:MeOH... 20 3.7.2 Kalibreringslösning i plasma... 21 3.7.3 Beredning av IS-lösning... 22 3.7.4 Optimering av MS-fil... 22 3.8 Extraktionsmetod... 23 3.8.1 Metod 1... 23 3.8.2 Metod 2... 24 3.9 Renhetskontroll internstandarder... 24 3.10 Statistik... 25 3.11 Etik... 25 4 RESULTAT... 25 4.1 Analys med Cortecs UPLC C18... 28 4.2 Analys med Kintex Biphenyl.... 29 4.3 Analys med UPLC BEH Phenyl... 29 4.4 Analys med UPLC BEH C18... 29 4.5 Extraktionsmetod... 30 4.6 Renhetskontroll internstandarder... 30 5 DISKUSSION... 30 5.1 Beredning av lösningar... 30 5.2 Beredning av kontrollösning... 31 5.3 Optimering av metoden... 32 5.4 Beredning av kalibreringslösning och internstandard... 34 5.5 Renhetskontroll av internstandard... 34 5.6 Ekonomiska aspekter och klinisk relevans... 35 6 SLUTSATS... 35 TACK... 35 7 REFERENSER... 37 BILAGA I - LÄKEMEDELSTATISTIK BILAGA II - SUBSTANSERS URSPRUNG BILAGA III - ANTIPSYKOTISKA LÄKEMEDELS MOLEKYLVIKTER BILAGA IV - TILLVERKNING AV MOBILA FASER BILAGA V - SPÄDNINGSSERIE BILAGA VI - KALIBRERINGSKURVA BILAGA VII - KROMATOGRAM

1. INTRODUKTION 1.1 Psykisk sjukdom Allvarliga tecken på psykisk sjukdom visar sig ofta i form av mycket plågsamma upplevelser och beteendeavvikelser hos individen. Tillståndet drabbar personligheten, känslolivet och den kognitiva förmågan. Symtom av detta slag kan även vara en normal del av den mänskliga tillvaron vilket gör gränsen mellan friskt och sjukt inom psykiatrin något komplicerat. För att diagnostisera psykiska sjukdomar används två system; Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-V) utgivet av American Psychiatric Association (APA) samt International Classification of Diseases (ICD-10) utgivet av världshälsoorganisationen (WHO). Det som skiljer dessa åt är att ICD-10 kategoriserar alla diagnoser och DSM innehåller enbart psykiatriska sjukdomar. Systemen använder sig av uttrycket mental disorder där ordet disorder troligtvis kommer från franskans desordre som betyder oordning. Sedan 1700-talet har uttrycket använts i betydelsen av krämpa eller sjukdom. Motsvarande begrepp på svenska finns inte och benämns därför inom svenskan som psykisk störning eller psykisk sjukdom beroende på sammanhanget. De psykiska begreppen kan överlappa varandra (se figur 1). Till gruppen svår psykisk störning hör psykossjukdomar och diagnoser som bipolär sjukdom (1). Figur 1. Illustration av hur de psykiska begreppen överlappar varandra och att psykisk hälsa och psykisk ohälsa kan förekomma samtidigt (2). i

1.2 Psykos Psykos är ett tillstånd som innefattar en blandning av olika symtom och kan associeras med flertalet psykiska sjukdomar (3). Tillståndet är oftast sammanlänkat med schizofreni men kan även förekomma vid bipolär sjukdom eller drogmissbruk. Det händer även att patienter som har Alzheimers demens, Parkinsons sjukdom, andra demenssjukdomar eller någon form av hjärnskada kan genomgå en psykos. Vanliga symtom på en psykos är hallucinationer och vanföreställningar som i allvarliga fall kan kombineras med osammanhängande tal, ovanligt beteende och en förvrängd bild av verkligheten. Psykoser kan vara paranoida vilket gör att patienten känner sig förföljd och uppfattar det som att omgivningen konspirerar mot denne (3, 4). Vid schizofren psykos är rösthallucinationer och förvrängda sinnesintryck karakteristiska drag som påverkar den sociala funktionen (4). Psykoser kan även komma plötsligt och utan förvarning. Dessa så kallade akuta psykoser går ofta över och har en bra prognos. Vid bipolär sjukdom förekommer också psykoser som nämnts ovan. Personen kan känna sig glad och upprymd och sedan kan humöret svänga till att personen känner det motsatta, deprimerad och inåtvänd (1). 1.3 Schizofreni Schizofreni är en välkänd, allvarlig och mycket svår psykisk sjukdom som kan orsaka återkommande psykotiska skov med en bristande verklighetsuppfattning. Termen schizofreni betyder ungefär kluvet sinne och beskrevs första gången i början av 1900- talet. Symtomen hos en patient med schizofreni kan delas in i positiva och negativa symtom. Med positiva symtom menas att symtomen tillkommer och med negativa symtom att funktioner bortfaller. Till de positiva symtomen hör vanföreställningar, hallucinationer och desorganisation av tankar och beteende. Hallucinationerna är ofta i form av hörselhallucinationer och kan vara mycket skrämmande (1). En del personer med schizofreni kan få vanföreställningar angående identiteten, vilket ofta blandas ihop med multipel personlighetsstörning (dissociative identity disorder, DID). Till de negativa symtomen hör dämpade känslor, sämre talförmåga och bristande motivation. Sjukdomen påverkar beteendet såväl som känslolivet hos de drabbade personerna (1). Orsaken till varför en del personen utvecklar schizofreni är hittills okänd. Men en stor riskfaktor har visats vara genetisk. En person med en förälder eller ett syskon som har 2

schizofreni löper ungefär 10% risk att själv få sjukdomen, tillskillnad från normal befolkning med en risk på 0,7% (1). Schizofreni och bipolär sjukdom har visat sig ha en delvis gemensam genetisk bakgrund enligt bl.a. forskning där cerebrospinal vätska hos individer med dessa sjukdomar analyserats (5). Detta innebär att anlag för den ena sjukdomen ger en ökad risk för att patienten även drabbas av den andra sjukdomen. En del gener som kodar för proteiner kopplade till hjärnans signaleringssystem t.ex dopamin, GABA och glutamat tros vara bakomliggande orsak. Sjukdomen utbryter ofta mellan 25-30 årsåldern och hos en del kvinnor kan det även ske efter klimakteriet. Diagnosen kan ställas baserat på sex stycken uppfyllda kriterier enligt DSM-V: Vanföreställningar, hallucinationer, desorganiserat tal, desorganiserat beteende och negativa symtom som pågått minst sex månader (1). 1.3.1 Behandling vid schizofreni Behandling mot schizofreni sker i första hand med antidopaminerga läkemedel. Behandlingen sker kontinuerligt hela livet då en avbruten behandling har visat sig leda till att i stort sett alla drabbade återinsjuknar efter 2 år. Ofta behandlas patienterna med en titrerad läkemedelsdos, dvs att en stor mängd läkemedelsdos ges för att behandla ett aktivt skov och trappas sedan ned till en lägre dosering. Detta kan dock skilja sig åt mellan olika psykoser och valet av dosering görs efter biverkningsprofil (1). Vanliga läkemedel för behandling är: olanzapin, klozapin, zuklopentixol, flupentixol, perfenazin, kariprazin, haloperidol, risperidon, quetiapin, aripiprazol och brexpiprazol (6). 1.4 Bipolär sjukdom Primärt innebär bipolär sjukdom att personen pendlar mellan ett normalt stämningsläge och nedstämdhet eller mani vilket påverkar energin och aktivitetsnivån. Sjukdomen kallas även för manodepressiv sjukdom. Förskjutning av stämningsläget kan vara i dagar upp till veckor vid maniskt tillstånd och i veckor till månader vid depressiva tillstånd. En person med bipolär sjukdom är oftare deprimerad än manisk men hur länge de olika stämningslägena varar kan skilja sig åt mellan olika individer. De depressiva episoderna gör att personen känner sig nedstämd, ledsen eller apatisk och har svårt att känna glädje. De maniska episoderna gör istället att personen blir hyperaktiv vilket resulterar i symtom 3

som t.ex. minskat sömnbegär, tankar som går på högvarv och personen kan vara mycket lättirriterad. En lindrigare form av mani kallas för hypomani och kräver inte samma vård som en mani. Både manierna och depressionerna kan utlösas utan någon tydlig orsak (3, 7). Risken för självmord bland patienter med bipolär sjukdom är 17-20 gånger högre än vanlig befolkning enligt en studie med data från kvalitetsregistret BipoläR (8). Sjukdomen debuterar vanligtvis i tonåren och har visat sig ha en ärftlig komponent vilket är den vanligaste riskfaktorn. Oftast indelas bipolär sjukdom i typ I och typ II men det finns även ett stort bipolärt spektrum föreslaget av psykiatrikern Hagop Akiskal som innehåller flera olika typer beroende på symtom. Exempel på ytterligare kategorier är typ II ½, III, III ½, IV och V (3). Diagnostisering av bipolär sjukdom sker med klassifikationssystemen ICD- 10 och DSM-V. Omvårdnadsmässigt är det viktigt med stödjande samtal för att undvika negativa tankar, fysisk aktivitet (gärna i grupp) och upprätthållande av rutiner för tillexempel mat och sömn för att undvika att hamna i skov (7). 1.4.1 Bipolär typ I Personer som är bipolära typ I har maniska episoder i kombination med depressioner vid sina skov. För att diagnostiseras med bipolär typ I krävs det att personen drabbats av en manisk period minst 1 gång. Detta ska ske under en tydligt avgränsad period av minst 1 vecka eller kortare om sjukhusvård är nödvändig enligt DSM-V. Under den maniska perioden ska minst tre av dessa symtom uppfyllas: Överdriven självkänsla, minskat sömnbehov, mer pratsam än vanligt, upplevelse av rusande tankar i huvudet, lättdistraherad, ökad målinriktad aktivitet samt ett överdrivet engagemang i aktiviteter med dåliga konsekvenser t.ex. köpgalenskap (9). Vid såkallad rapid cycling kan personerna pendla snabbt mellan manier och depressioner. Minst fyra bipolära skov kan uppkomma under ett år och även mer frekvent kan förekomma (7). 1.4.2 Bipolär typ II Personer som är bipolära typ II har istället depressioner och hypomanier vid sina skov. Enligt DSM-V ska depressionerna uppfylla kriterierna för egentlig depression och perioder med en förhöjd sinnesstämning är enbart hypomani. ICD-10 skiljer inte på typ I och typ II. Troligtvis finns det flertalet personer som lider av typ II men som inte har blivit 4

diagnostiserade. Patienter med många depressiva perioder kan ha svårt att minnas perioder med hypomani och dessa kan då felaktigt upplevas som en normal sinnesstämning (1, 9). 1.4.3 Behandling vid bipolär sjukdom Bipolär sjukdom behandlas med stämningsstabiliserande läkemedel där litium ofta är förstahandsval. Litium har använts sedan 1949 då John Cade påvisade dess effekter mot mani. En symtomfrihet av behandling med litium uppnås i ca en tredjedel av fallen. En ytterligare tredjedel behandlas med farmakologiska tillägg. En sista tredjedel som lider av ett mer snabbsvängade förlopp (s.k. rapid cycling) kan behöva behandlas med valproat. Vid bipolär typ II är depression det kliniska symtomet och ofta behandlas dessa patienter med läkemedlet lamotrigin i monoterapi. Om monoterapi inte räcker för behandling av bipolär sjukdom kan en kombinationsbehandling av psykologisk intervention och tilläggsbehandling förekomma (7). Exempel på tilläggsbehandling för återkommande depressioner är: quietapin, lurasidon och lamotrigin och för återkommande manier: quietapin, olanzapin, risperidon, haloperidol, kariprazin och aripiprazol (6, 7). 1.5 Dopaminhypotesen På 1950-talet upptäckte den svenska farmakologen Arvid Carlsson att dopamin var en signalsubstans i hjärnan med en betydande roll för människans rörelseförmåga. Detta gav upphov till stora framsteg inom forskning gällande Parkinsons sjukdom som orsakas av en brist på dopamin, vilket sedan kom att spela en avgörande roll för forskning gällande schizofreni. Förutom detta var han även med och utvecklade den s.k. dopaminhypotesen. Han upptäckte att läkemedel som lindrar symtomen vid schizofreni och psykoser verkar genom att minska signalsubstansen dopamins inflytande i hjärnan. Arvid Carlsson fick nobelpriset i medicin år 2000 för sina banbrytande upptäckter (10). 1.6 Neuroleptika Ordet neuroleptika har alltmer ersatts av begreppet antipsykotiska läkemedel som tillhör gruppen psykofarmaka. Antipsykotika verkar genom att påverka receptorer för signalsubstanser i hjärnan och påverkar därmed hjärnans signalering. Framför allt psykossjukdomar men även bipolär sjukdom och ibland andra psykiska sjukdomstillstånd 5

behandlas med antipsykotika. Idag finns det inga läkemedel som kan bota psykossjukdomar men med behandling av antipsykotika kan man minska många av symtomen (11). Antipsykotika delas in i två olika grupper: 1.6.1 Typiska antipsykotiska läkemedel Typiska antipsykotiska läkemedel kallas även första generationens antipsykotiska läkemedel där verkningsmekanismen hos dessa typer av läkemedel är en blockering av signalsubstansen dopamins inbindning till dopamin-2-receptorer. Detta ger upphov till en minskad effekt av dopamin vars överaktivitet har visat sig vara en trolig anledning till psykossymtom. Teorin stöds av att dopaminagonister samt höga doser av amfetamin, som orsakar en ökad frisättning av dopamin, kan ge upphov till psykossymtom. Biverkningar av denna typen av antipsykotiska läkemedel är flera, både motoriska och endokrina. De motoriska biverkningarna som kan ske är: akut dystoni, akatisi, parkinsonism och tardiv dyskinesi. Endokrina biverkningar är: förhöjd prolaktinhalt vilket påverkar brösttillväxt, menstruation, mjölkavsöndring och antas leda till benskörhet (11). Exempel på substanser som tillhör denna grupp är haloperidol, perfenazin, flupentixol och zuklopentixol (6). 1.6.2 Atypiska antipsykotiska läkemedel Atypiska antipsykotiska läkemedel kallas även för andra generationens antipsykotika och är modernare typer av läkemedel som ger andra biverkningar. Verkningsmekanismen är en kombination av blockad av vissa serotoninreceptorer, 5-HT-2A-receptorer och viss blockad av dopaminreceptorer, D2-receptorer. Denna gruppering har en lägre affinitet till D2-receptorer än första generationens antipsykotiska (11). Undantag är aripiprazol, brexpiprazol och kariprazin som fungerar som partiella agonister på D2-receptorer (6). Genom inbindning till D2-receptorn kommer en blockering ske och hindra andra substanser att binda in men samtidigt så stimulerar dessa en viss respons från receptorn. Behandling med vissa atypiska läkemedel (klozapin, olanzapin) kan orsaka metabola biverkningar dvs, övervikt, förhöjda blodfetter och en nedsatt glukostolerans. Klozapin kan även ge upphov till agranulocytos (11). Exempel på substanser som tillhör gruppen atypiska antipsykotiska är: klozapin, olanzapin, quetiapin, aripiprazol, brexpiprazol, kariprazin, lurasidon och risperidon (6). 6

1.6.3 Dosering Antipsykotiska läkemedel kan delas in i högdosneuroleptika och i lågdosneuroleptika baserat på den nödvändiga dosen för behandling av psykos, vilket återspeglas av koncentrationen läkemedel i blodet (se tabell I). Tabellen visar de föreslagna referensintervallen via Therapeutic Drug Monitoring (TDM) vars riktlinjer är hämtade från Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Neuropsychopharmacology (12). Inom TDM anger referensintervallet den koncentrationen i plasma/serum som läkemedel bör ligga inom. Referensintervallet är framtaget för att ge en effekt på sjukdomstillståndet samtidigt som det inte är farligt för patienten. Med upprepade blodprov och patientens respons går det att optimera behandlingen även vid förekomst av eventuella interaktioner med andra läkemedel. Det går även att följa hur noga patienten är med att ta sina mediciner så kallad följsamhet eller compliance. Har patienten mycket metaboliter men inte läkemedel i blodet så vet man att patienten inte skött doseringen då mycket nedbrytningsprodukter syns. Har istället patienten ätit läkemedel precis innan besöket så kommer en stor mängd av läkemedlet att synas i blodet. Patienter som behandlas med antipsykotiska läkemedel tar därför upprepade blodprov för att dosering ska kunna följas (13). Tabell I. Översikt över aktuella substanser och metaboliter indelade i högdos- och lågdosneuroleptika baserat på TDM (12). Högdos TDM-intervall (ng/ml) Lågdos TDM-intervall (ng/ml) Klozapin 350-600 Risperidon 20-60 Norklozapin 350-600 9-hydroxyrisperidon 20-60 Klozapin-N-oxid 350-600 Perfenazin 0,6-2,4 Olanzapin 20-80 Zuklopentixol 4-50 Desmetylolanzapin 20-80 Flupentixol 0,5-5 Aripiprazol 100-350 Haloperidol 1,0-10 Dehydroaripiprazol 150-500 Kariprazin 10-20 Quetiapin 100-500 Desmetylkariprazin 10-20 Norquetiapin 100-250 Didesmetylkariprazin 10-20 7-hydroxyquetiapin 100-250 Lurasidon 15-40 Brexpiprazol 40-140 Baserat på data från Socialstyrelsen är det ca 15 patienter/1000 invånare som behandlades med någon av de antipsykotika som analyserats i denna rapport under året 2018 (se bilaga 7

I, figur 2). Av dessa är quetiapin (4,49 behandlade patienter/1000 invånare) och olanzapin (4,01 behandlade patienter/1000 invånare) de vanligaste förekommande läkemedlen. Brexpiprazol och kariprazin är mindre vanliga läkemedel i Sverige. Vid analys av trendlinjen för hur vanligt förekommande dessa antipsykotika varit det senaste 12 åren (2006-2018) syns en ökning av användandet från 2014 (se bilaga I, figur 3). I Sverige går quetiapin under namnet kvetiapin (6, 14). 1.7 Instrumentet UHPLC Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) och är en vätskekromatografisk analysteknik som ofta används inom analytisk kemi och läkemedelsindustri. Metoden används för att separera olika ämnen från varandra så att de kan detekteras individuellt. Tillskillnad från High Performance Liquid Chromatography (HPLC) så använder UHPLC sig av analyskolonner med en mindre partikelstorlek (1,7-1,8µm) vilket leder till en bättre separation och kortare analystider. Detta leder även till att man vid UHPLC använder högre tryck (maximalt 1241 bar) pga. mindre partikelstorlek (15). Systemet består av ett flertal olika komponenter (se figur 4). Figur 4. Schematisk bild över uppbyggnaden av ett LC-system (15). 8

1.7.1 Mobilfas Den rörliga fasen eller mobila fasen som används måste vara ren och inte innehålla spår av ämnen som kan registreras av detektorn då det kan interfera med substansen som ska detekteras. Som mobila faser är det vanligt att använda MeOH eller ACN blandat med vatten vid reversed phase kromatografi (RP) (se avsnitt 1.7.4). Detta gör att man kan justera hur den eftersökta substansen kommer retarderas i den stationära fasen eller mobila fasen beroende på polaritet och därmed när analyten kommer att elueras ut. Tillsats av buffertar, olika svaga syror och ph-justering kan påverka substansens opolära/polära egenskaper (16). 1.7.2 Pump Separationsmetoden går ut på att en högtryckspump pumpar den mobila fasen genom kolonnen, substanserna som separerats genom att de interagerar med stationära och mobilafasen, detta kallas eluering. Det finns två olika elueringsmetoder inom vätskekromatografi: isokratiskt eluering och gradienteluering. Vid isokratisk eluering används samma sammansättning av mobilfas genom hela analysen och är bra när man vill separera likartade substanser. Gradienteluering innebär att mobilfasens sammanstättningen förändras under analysens gång, dvs vid reversed phase är en ökad andel opolär mobilfas pådrivande för att eluera ut provets komponenter (16). 1.7.3 Injektor Provet injiceras via en injektorport. I load-läge är loopen vid atmosfärstryck för att sedan vridas till inject läge. Det finns både manuella och automatiska injektorer. Loopen har en liten fix volym som kan fyllas med den injektionsvolym man vill ha av provet. Den mobila fasen kommer passera genom loopen och genom att ändra från load till inject kommer provet färdas med den mobila fasen vidare till kolonnen (17). 1.7.4 Kolonn Kolonnen består av ett cylinderformat rör med filter och kopplingar och innehåller den stationära fasen där separationen sker. Innan kolonnen sitter en förkolonn, med samma stationära fas vars syfte är att skydda analyskolonnen (17). Den stationära fasen består av små tätt packade kulor, oftast utgörs dessa av totalporösa silikakorn till vilket C18 eller C8 kolkedjor är inbundna till ytan på partiklarna och i porerna. UHPLC använder sig av 9

partiklar med en mindre partikelstorlek vilket resulterar i en större yta, en bättre separation och smalare toppar i kromatogramet. Detta gör det möjligt att använda sig av snabbare gradienter och kortare kolonner med fler toppar i kromatogramet. En konsekvens av de små partiklarna är ett högre mottryck, detta kan minskas genom att använda en högre temperatur som minskar viskositeten hos mobilfasen. Den nya UHPLC teknologin har lett till bättre upplösning, kortare retentionstider och snabbare analys (15). I denna rapport användes reveresed phase (RP) kromatografi vilket innebär att den stationära fasen är opolär och den mobila fasen polär. Det leder till att opolära ämnen kommer dröja sig kvar längre i kolonnen vilket ger en längre elueringstid. Polära ämnen kommer istället fördelas mera i den polära mobila fasen och elueras ut snabbare. Detta är en vanlig form av kromatografi vid analys av läkemedel och dess metaboliter men även proteiner, aminosyror och peptider (16, 17). 1.7.5 Jonkälla En masspektrometer består huvudsakligen av en jonkälla, massanalysator och en detektor (se figur 5). För att bilda joner av de eftersökta analyterna används Electrospray ionization (ESI) som jonkälla. När analyterna lämnar kolonnen kommer de att vara upplösta i den mobila fasen och pumpas sedan igenom en kapillär av rostfritt stål, en s.k. nebulizer som har en spänning på 2000-4000 V tillsammans med varm kvävgas. Detta resulterar i en spray där dropparna får en ökad laddningstäthet på grund av en spänningsskillnad mellan nebulizern och sample cone (18). För att få positivt laddade analyter tillsätts en syra eller bas i den mobila fasen beroende på vilken substans som ska detekteras och ph-värdet justeras efter substansens pka värde så att den blir mer positivt eller negativt laddad. Den varma kvävgasen gör att den mobila fasen evaporeras och lämnar kvar en proton på analyten. Detta gör att analyten får en positiv laddning och en högre massa än vad den hade från början. De molekylerna som är laddade leds vidare in till hexapolen där jonstrålen koncentreras. Genom att reglera spänningen på nebulizern går det att ställa in om postivt- eller negativt laddade analyter som ska detekteras i masspektrometern, vanligast är positiv jonisering (17). 10

1.7.6 Massanalysator Tandem masspektrometri (MS/MS) Till skillnad från en vanlig masspektrometer består tandem masspektrometri av två stycken kvadrupoler (MS1 och MS2) samt en kollisionscell (se figur 5). En kvadrupol består av fyra stycken parallella metallstavar där 2 stycken har en positiv laddning och två stycken har en negativ laddning. Över stavarna ligger en växelspänning som kan regleras. När jonstrålen når den första kvadrupolen, MS1 kommer jonerna sorteras baserat på förhållandet mellan massa och laddning (m/z). Genom reglering av spänningen över kvadrupolen kan man ställa in vilka joner som kommer att ta sig igenom kvadrupolen och MS1 fungerar således som ett massfilter innan de når kollisionscellen. I kollisonscellen sker fragmenteringen med collision-induced dissociation (CID) (17, 18). Fragmentering Kollisionscellen arbetar under vaccum (lågt tryck) såväl före som efter fragmentering. Vid fragmenteringen släpps en kollisonsgas in t.ex. argon som får kollidera med de eftersökta jonerna under ett mycket lågt tryck. Accelerering av den elektriska potentialen till en hög kinetisk energi gör att det sker en kollison med gasmolekylerna. En del av den kinetiska energin överförs vid kollisionen vilket leder till att de kemiska bindningarna bryts och molekyljonen reduceras till mindre fragment. Övergången från molekyljonen till fragment kallas för transition (18). Till exempel är molekyljonen för Olanzapin m/z 313 som ofta bildar fragmenten m/z 198 och m/z 256 Detta ger följande transitioner: 313 198 och 313 256 (13). Fragmenten går vidare in i den andra kvadrupolen, MS2 som också fungerar som ett massfilter där de valda fragmenten sorteras ut på liknande sätt som MS1 innan de når detektorn (17). Den masspektrometriska analysen görs med s.k. Multiple Reaction Monitoring (MRM) vilket innebär att molekyljonen fragmenteras. En molekyljon väljs ut för filtrering i MS1 och en kollision sker därefter mellan molekyljonen och t.ex. argongas i kollisionscellen. Det leder till att detektion av specifika joner som bildas vid kollisonen kan göras i MS2. Detta gör det möjligt att endast se spektra som visar utvalda fragment av molekyljonen och är en väl använd metod vid kvantitiva analyser inom läkemedelsindustrin. Det går även att 11

summera jonernas intensitet som en funktion av tiden så att en plot visas som kallas total ion chromatogram (TIC) där alla fragment från analyten visas i samma kromatogram (18). 1.7.7 Internstandard För att kunna kontrollera hur väl metoden fungerar samt för att ge en säkrare kvantifiering, så används internstandard i metoden. Internstandard (IS) används för att kompensera för eventuella volymsförluster vid extraktion och ger en bättre precision. IS tillsätts i lika stor mängd till standardlösningar, kontroller och prover. Det är mycket viktigt med IS under provupparbetningen för att kompensera för variation i utbyte och eventuella volymsförluster. Substansen som fungerar som internstandard ska vara lik den eftersökta substansen och är ofta någon form av isotop till ämnet. För läkemedel är det vanligt att väte i molekylen byts ut till en isotop av väte även kallat deuterium eller tungt väte och betecknas 2 H eller D. Skillnaden är att i atomkärnan finns en extra neutron vilket kommer göra molekylen tyngre. IS och analyten kommer att elueras ut vid samma tidpunkt. Instrumentet kommer sedan beräkna en area för dessa baserat på summan av de två MRMfragmenten som detekterades för respektive substans. Därefter beräknas en kvot mellan analyten och dess internstandard för respektive substans. Standardpunkterna avsätts mot deras kända koncentrationer och en kalibreringskurva skapas genom att avsätta kvoten mot kända koncentrationer (15). Denna används sedan för att beräkna koncentrationerna för respektive analyt i de okända proverna/kontrollerna med hjälp av beräknade kvoter. Detektion med en MS-detektor är en förutsättning för att man ska kunna använda isotopmärkta standarder. I detta projekt användes följande internstandarder: brexpiprazol-d8, kariprazin-d8, 9- hydroxyrisperidon-d4, aripiprazol-d8, klozapin-d4, haloperidol-d4, lurasidon-d8, olanzapin-d8, quetiapin-d8, risperidon-d4, perfenazin-d8. 1.7.8 Detektor Det finns olika typer av detektorer för att mäta signalen från analyten och multi-dynod detektorn är mest använd. Jonerna från massanalysatorn når en dynod där elektroner slås loss. Elektronströmmen är direkt proportionell till jonernas intensitet och antal. Elektronerna omvandlas sedan till fotoner via en fosforplatta. Mängden ljus som avges i 12

form av fotoner förstärks med en fotomultiplikator och den signal som avges mäts av detektorn (17). 1.7.9 Databehandling Signalen visas i form av toppar i ett kromatogram. Arean under respektive topp för kalibreringskurva, standardpunkter (koncentrationsreferenser), analyt och internstandard är proportionell mot mängden substans i provet och omvandlas till koncentrationer med hjälp av instrumentets mjukvara (18). Figur 5. Schematiskt bild från Waters över uppbyggnaden av jonkällan ESI och tandem masspektrometri (MS/MS). 1.7.10 Analys av antipsykotika Många av de analysmetoder som rapporterats användbara för analys av antipsykotiska läkemedel (AP) bygger på LC-MS/MS. Sådana analyser finns beskrivna för analys av AP i torkade blodfläckar på filterpapper (DBS), plasma från råtta, hund samt human plasma och serum (13, 19-25). Samtliga metoder bygger på att substansen först isoleras från matrisen med en extraktionsmetod där både vätske-vätskeextraktion (LLE) (13, 21-23, 25) och proteinutfällning använts (19, 20, 24). Samtliga artiklar har använt sig av ESI med positiv jonisering. Den vanligaste typen av kolonner för analys av AP är C18-kolonner men även andra typer av kolonner har förekommit vid detektion av antipsykotika (24). Olika typer av mobila faser har använts där ammoniumacetat, myrsyra, ammoniumhydroxid, ättiksyra, MeOH och ACN har använts i olika sammansättningar. Valet kring vilken mobil fas som 13

ska användas verkar vara en bedömningsfråga kring vilka lösningar som redan finns på laboratoriet. Olika typer av gradienter har använts vid elueringen och tiden för en analys har varierat mellan 4-11 min, mycket beroende på antalet substanser i samma analys 2 SYFTE Syftet med detta projekt har varit att utveckla en ny metod för att mäta några antipsykotiska läkemedel och dess metaboliter i plasma med UHPLC-MS/MS. Metoden är ämnad att ingå i rutinarbetet på avdelningen för Klinisk farmakologi vid Linköpings universitetssjukhus där ingen metod för dessa substanser tidigare funnits. 3 MATERIAL OCH METOD Experimentet i detta projekt delades in i sex olika steg: (1) Beredning av stamlösningar och infusionslösningar av eftersökta substanser och deras internstandarder till rätt koncentration. (2) Beräkning av molekylmassan för monoisotopen av varje substans. (3) Optimering av konvolt och kollisionsenergi. (4) Optimering av kromatografin (5) Beredning av kalibreringslösningar (6) Extraktion av substanser i plasma. 3.1 Kemikalier och material Metanol (LiChrosolv LCMS 99,9%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), Acetonitril (LiChrosolv LCMS 99,9%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), Ammoniumacetat (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), Dimetyl sulfoxid (99,5%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), Myrsyra (98%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland ), ammoniaklösning (25%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Ättiksyra (100%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) och Saltsyra (37%, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Kolonner som använts var UPLC BEH Phenyl (1,7 µm 2,1x50 mm) (Waters, Milford, USA), Cortects UPLC C18 14

(1,6 µm 2,1x50 mm) (Waters, Milford, USA), Kinetex Bifenyl (1,7 µm 2,1x100 mm) (Phenomenex, Kalifornien, USA), UPLC BEH C18 (1,7 µm 2,1x50 mm) (Waters, Milford, USA). Ultrarent vatten från Milli-Q Advantage A10 (Millipore). Läkemedelsfri plasma beställdes från blodcentralen, Linköpings universitetssjukhus. Substanser och internstandard beställdes från olika leverantörer (se bilaga II, tabell II och tabell III). 3.2 Instrument Analysen av substanserna i detta arbete gjordes med Acquity I Class kopplad till en Xevo TQ-XS masspektrometer (Waters, Milford, USA). 3.3 Beredning av lösningar 3.3.1 Stamlösningar med koncentrationen 1,0 mg/ml från pulverform Kariprazin 10,054 mg, desmetylkariprazin trifluoracetat 10,075 mg, N-desmetylkariprazin hydroklorid 10,016 mg, brexpiprazol 10,044 mg och klozapin N-oxid ca 5 mg beställdes i pulverform (se tabell II). Kariprazin späddes till koncentrationen 1,0054 mg/ml i en 10 ml mätkolv med DMSO. Didesmetylkariprazin trifluoracetat späddes i en 10 ml e-kolv till koncentrationen 1,0075 mg/ml med 50:50 MeOH:0,01 M HCl. N-Desmetylkariprazin hydroklorid späddes i en 10 ml mätkolv till en koncentration på 1,0016 mg/ml med 50:50 MeOH:0,01M HCl. Lösningarna placerades i ultraljudsbad tills klar lösning erhållits. Brexpiprazol löste sig inte i 50:50 ACN:H2O. Då tillsattes droppvis 200 µl 0,01 M HCl vilket inte gjorde någon skillnad innan 40 ml av 50:50 1% HCl:MeOH (5x spädning) tillsattes och lösningen blev klar. Den nya koncentrationen av brexpiprazol blev då 0,2088 mg/ml. Klozapin N-oxid vägdes upp till 2,75 mg på en analyvåg och späddes i en 5 ml mätkolv med milli-q vatten till en koncentration på 0,55 mg/ml. Alla lösningar späddes med lösningsmedel enligt rekommendationer från leverantör. Ovanstående lösningar överfördes till var sin 10 ml cylinder för infrysning och till var sin en 2 ml vial för förvaring i kyl. 3.3.2 Stamlösningar med koncentrationen 1,0 mg/ml från färdig lösning Perfenazin, klozapin 7-hydroxyquetiapin, lurasidon, risperidon, N-desmetylklozapin, N- desmetylolanzapin dihydroklorid, dehydro aripiprazol, norquetapin HCl, quetiapin fumarat, 9-hydroxyrisperidon, haloperidol, aripiprazol, olanzapin, flupentixol och 15

zuklopentixol köptes som färdig lösning där majoriteten var upplösta i MeOH eller ACN (se tabell II) som inkom i glasvialer och överfördes till varsin 2 ml vial. Injektionslösningar till instrumentet LC-MS/MS späddes i två steg från ovanstående stamlösningar till en koncentration på 1,0 µg/ml med MeOH och späddes sedan vidare (10x) till nya lösningar med en slutkoncentration på 0,1 µg/ml. Lösningarna överfördes till vialer anpassade för instrumentets autosampler. 3.3.3 Beredning av stamlösning för internstandard Lurasidon-D8 HCl 100 µg/ml, risperidon-d4 100 µg/ml, klozapin-d4 100 µg/ml, haloperidol-d4 100 µg/ml, quetiapin-d8 hemifumarat 100 µg/ml, aripiprazol-d8 100 µg/ml, 9-hydroxyrisperidon-D4 100 µg/ml, olanzapin-d8 samt perfenazin-d8 köptes som färdig lösning där majoriteten var upplösta i MeOH eller ACN (se tabell III) och inkom i glasvialer som överfördes till respektive 2 ml vial. Kariprazin-D8 1,071 mg beställdes i pulverform och späddes med MeOH till en koncentration på 1,071 mg/ml. Alla ovanstående internstandard-lösningar späddes med lösningsmedel enligt rekommendationer från leverantör. Brexipiprazol-D8 beställdes i pulverform och löstes inte enligt rekommendationen från leverantör utan späddes istället i MeOH till en koncentration på 0,1075 mg/ml eftersom substansen tidigare visat sig vara svårlöslig. Alla lösningar späddes sedan vidare med MeOH till nya vialer med en slutkoncentration på 1,0 µg/ml. Till infusion i LC-MS/MS instrumentet späddes lösningarna vidare till en ny lösning med koncentrationen på 0,1 µg/ml på samma sätt som stamlösningarna för substanserna. 3.3.4 Kontrollösning för alla analyter, 50 ng/ml 2% MeOH En kontrollösning innehållande samtliga analyter och deras internstandard tillverkades. Lösningen bestod av 90:10 H2O:MeOH och med en koncentration för alla analyter på 50 ng/ml. Detta gav en lösning med en slutvolym på 10 ml då innehållande ca 2% MeOH. Kontrollösningen förvarades i en 10 ml vial och 1 ml av lösningen överfördes till en vial anpassad för instrumentets autosampler. 16

3.4 Beräkning av molekylmassan En beräkning av molekylmassan för monoisotopen av varje substans gjordes i programmet Masslynx med hjälp av en inbyggd modul för beräkning av molekylvikt innan optimering av masspektrometern (se bilaga III). Detta görs för att veta vilken inställning som ska göras på den första kvadrupolen, MS1 vid optimering av masspektrometern. 3.5 Optimering av konvolt och kollisionsenergi En optimering av spänningen över konerna där jonströmmen viker av i 90 graders vinkel gjordes, detta resulterar i en mer koncentrerad jonstråle som sedan går vidare till den första kvadrupolen (se figur 5). Grundinställningar för masspektrometern var ESI positiv mode med kapillärspänning på 1,00 kw, temperatur på desolveringsgasen (kvävgas) var 500 C med ett flöde på 1000 l/h, sourcetemperatur 150 C och kollisonsgasflöde av 0,15 ml/min. Stamlösningarna med koncentrationen 1,0 mg/ml späddes till optimering av instrumentet med MeOH till en koncentration på 0,1 µg/ml. Detta gjordes för både analyter och internstandard. En vial anslöts till masspektrometern för manuell optimering av respektive analyt med en infusionshastighet på 10 µl/min. Därefter ställdes MS1 in på den eftersökta substansens molekyljon och MS2 ställdes in på att söka efter bildade fragment som är mindre än molekyljonen. Ett intervall ställdes in från molekyljonens vikt till en massa på ca 50. Därefter ökades kollisonsenergin och detekterade fragment noterades (se figur 6). Även kapillärspänning och konspänning reglerades under optimeringsprocessen genom att öka eller sänka denna valdes den optimala spänningen baserat på respons. Sedan analyserades samma prov med programvaran IntelliStart som ställdes in för att automatiskt identifiera de 4 mest framträdande fragmenten och resultatet jämfördes med den manuella optimeringen. Manuell optimering gjordes på ca 5 substanser och därefter gjordes resterande optimering med programvaran. Totalt detekterades 4 fragment per substans och 2 stycken av dessa valdes ut att ingå i den slutliga metoden. För internstandard användes endast ett fragment per substans. 17

Figur 6. Ett spektrum som visar fragmenten som fångats upp i MS2 av substansen 9- Hydroxyquetapin där molekyljonen är längst till höger och övriga toppar visar fragment från molekyljonen. Detektion gjordes med konvolt 3V, kapillärspänning 1,01 kv och med ett kollisionsgasflöde på 0,15 ml/min. 3.6 Optimering av kromatografin Optimeringen av kromatografin baserades på hur väl symmetriska toppar det var i kromatogramet samt hur väl separerade dessa var ifrån varandra. 3.6.1 Test av mobilfaser Följande mobila faser valdes ut för optimering av kromatografin. För tillverkning av mobila faser (se bilaga IV). Mobilfas A: 2mM ammoniumacetat + 0,1% ättiksyra 10 mm ammoniumacetat i H2O 2 mm ammoniumacetat + 0,1% Myrsyra i H2O 0,2% Myrsyra i H2O 10 mm ammoniumformiat i H2O 18

10 mm ammoniumformiat + 0,1% ammoniak i H2O 10 mm ammoniumacetat + 0,1% ammoniak i H2O 2 mm ammoniumformiat i H2O 5 mm ammoniumformiat i H2O Mobilfas B: Acetonitril Metanol 2 mm ammoniumacetat + 0,1% myrsyra i metanol 0,2% myrsyra i acetonitril 2 mm ammoniumformiat i metanol 5 mm ammoniumformiat i metanol 3.6.2 Test av kolonner Efter att lämpliga mobilfaser valts utvärderades vilka kolonner som var mest lämpade för separation av de kemiska föreningarna. Följande kolonner testades: UPLC BEH Phenyl (1,7 µm 2,1x50 mm) (Waters) Cortects UPLC C18 (1,6 µm 2,1x50 mm) (Waters) Kinetex Biphenyl (1,7 µm 2,1x100 mm) (Phenomenex) UPLC BEH C18 (1,7 µm 2,1x50 mm) (Waters) Först testades de två C18 kolonnerna: Cortects UPLC C18 och UPLC BEH C18 från Waters med olika kombinationer av de utvalda mobilfaserna för optimeringen av kromatografin. Optimeringen utgick från injektioner av kontrollösningen innehållande alla analyter och internstandard (se avsnitt 3.3.4). Beslutet att först testa C18 kolonnerna för optimering gjordes baserat på majoriteten av vetenskapliga artiklar där denna kolonntyp använts. Elueringstiden samt gradienten justerades tills att alla substanser kommit ut i ett kromatogram. Vid de inledande testerna var mobilfasflödet 0,5 ml/min, injektionsvolymen 2 µl och temperaturen i kolonnen 55 o C. Elueringstiden justerades under optimeringens gång. Två olika linjära gradienter testades med 10% B, 90% B, 10% B (se tabell IV och tabell VI) och 20% B, 80% B, 20% B (se tabell V). Därefter testades UPLC BEH Phenyl och Kinetex Bifenyl med samma inställningar som ovan. De aromatiska ringarnas struktur 19

hos substanserna och hos fenylkolonnerna som består av en (BEH Phenyl) respektive två (Kinetex Biphenyl) bensenringar bundna till den stationära fasen. Detta ger en annan typ av selektivitet med dipol-dipol vätebindningar och π- π bindning mellan substanserna och den stationära fasen utöver polära/opolära interaktioner. Tabell IV. Gradient under analysens gång med en sluttid på 5,2 min. Tid (min) Flöde (ml/min) %A %B 1 Initial 0,5 90 10 2 4,20 0,5 10 90 3 5,20 0,5 90 10 Tabell V. Gradient under analysens gång med sluttid 6 min. Tid (min) Flöde (ml/min) %A %B 1 Initial 0,5 80 20 2 5,20 0,5 10 90 3 6,00 0,5 80 20 Tabell VI. Gradient under analysens gång med analystid 5 min. Tid (min) Flöde (ml/min) %A %B 1 Initial 0,5 90 10 2 4,20 0,5 10 90 3 5,00 0,5 90 10 3.7 Beredning av kalibreringslösningar 3.7.1 Kalibreringslösning i 90:10 H2O:MeOH När valet av kolonn och mobilfas hade gjorts tillverkades en spädningsserie för att utvärdera linjäriteten (se bilaga V, tabell VII). Spädningsserien tillverkades i 6 nivåer i 90:10 H2O:MeOH på liknande vis som kontrollösningen. Den högsta nivån baserades på de terapeutiska intervallen (se tabell I, tabell VIII). Den lösning som tillverkades innehållande de högsta nivåerna späddes sedan vidare till övriga nivåer genom att halvera koncentrationen. Det som bildades då var en spädningsserie där substanserna delades in i grupp 1-7 baserat på högsta nivå, t.ex för olanzapin i grupp 3 med koncentrationerna 250 20

ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,6 ng/ml, 7,81 ng/ml (se tabell IX). Kalibreringslösningarna på respektive nivå innehöll samtliga substanser. Tabell VIII. Högsta uppskattade nivå av kalibratorer baserat på de terapeutiska intervallen för substanserna. Substans Högsta nivå (ng/ml) Klozapin 1000 N-desmetylklozapin 1000 Klozapin-N-oxid 1000 Aripiprazol 1000 Dehydroaripiprazol 1000 Quetiapin 1000 Norquetiapin 1000 7-OH-quetiapin 1000 Brexpiprazol 500 Olanzapin 250 Desmetylolanzapin 250 Risperidon 100 Zuklopentixol 100 Lurasidon 100 9-OH-risperidon 100 Kariprazin 50 Desmetylkariprazin 50 Haloperidol 20 Perfenazin 10 Flupentixol 10 Tabell IX. Koncentration på kaliberingslösningar där substanserna är indelade i grupper efter högsta nivå. Kalibrator Grupp 1 Grupp 2 Grupp 3 Grupp 4 Grupp 5 Grupp 6 Grupp 7 0 0 0 0 0 0 0 0 1 31,3 15,6 7,81 3,13 1,56 0,625 0,313 2 62,5 31,3 15,6 6,3 3,13 1,25 0,625 3 125 62,5 31,3 12,5 6,3 2,5 1,25 4 250 125 62,5 25 12,5 5 2,5 5 500 250 125 50 25 10 5 6 1000 500 250 100 50 20 10 3.7.2 Kalibreringslösning i plasma Spädningsserien av kalibratorerna gjordes i plasma enligt spädningsschemat (se bilaga V, tabell VII). Skillnaden från kalibreringslösningarna i 90:10 H2O:MeOH var att det första spädningssteget för respektive substans gjordes i vatten och det sista steget till högsta nivån gjordes med plasma. Därefter späddes lösningen 50:50 med plasma 5 gånger tills att sex stycken kalibratorer tillverkats. Dessa förvarades i uppmärkta eppendorfrör i kyl. 21

Kalibreringen gjordes först utan plasma för att se linjäriteten och därefter återupprepades försöket med plasma för användning i den slutliga metodens kalibreringslösning. 3.7.3 Beredning av IS-lösning Lösningar tillverkas innehållande alla internstandarder. Denna IS-lösning tillverkades i två varianter där en tillverkades i MeOH (till metod 1, se avsnitt 3.8) och en tillverkades i ACN (till metod 2, se avsnitt 3.8). Koncentrationen på alla IS i denna lösning ska vara samma som någon av de mittersta standardpunkterna och koncentrationen bestämdes att vara samma som standardpunkt 4. Exempel på uträkning: högsta nivå på standardpunkt är 1000 ng/ml 500 ng/ml 250 ng/ml 125 ng/ml. Den fjärde standardpunkten är således 125 ng/ml. En dubbel mängd av IS-lösningarna för kariprazin, klozapin, haloperidol och brexpiprazol tillsattes på grund av att de har en låg känslighet i instrumentet. Förutom aspekten med att substanserna ska tillverkas i olika koncentrationer beroende på terapeutisk nivå så behövdes även en kompensation göras då volymen IS som tillsätts i provupparbetningen är 4 gånger så stor som mängden prov (25 µl prov/100 µl IS) och därför dividerades standardpunkt med 4 för att få ut den korrekta koncentrationen av substansen i lösningen, i detta fallet 125/4=31,25 ng/ml. Samma uträkning gjordes för alla internstandarder och därefter även vilken koncentration på internstandarder som spädningen behövde göras ifrån. I detta fallet användes 100 µg/ml som ursprungskoncentration för lösningarna med standardpunkt 125 ng/ml och för övriga användes ursprungskoncentrationen 1,0 µg/ml. IS-lösningen tillverkades i en 10 ml kolv med MeOH respektive ACN. Lösningen blandades om och överfördes sedan till en 12 ml vial och placerades i kylskåp. 3.7.4 Optimering av MS-fil Som sista steg vid optimeringen av kromatografin för vald kolonn och mobilfas ändrades tiden för när instrumentet ska börja och sluta att mäta för respektive analyt. Detta gjordes baserat på analyternas retentionstider (se tabell X) och leder till att fler mätpunkter erhålls då färre antal toppar mäts samtidigt. Ett intervall ställdes in på 30 sek där instrumentet mäter under en begränsad tid när toppen kommer ur analyskolonnen för varje MRM-kanal (se figur 7). 22

Figur 7. Optimerad MS-fil med inställda tidsspann som instrumentet mäter för varje analyt baserat på retentionstider. 3.8 Extraktionsmetod Extraktionen valdes att göras med plasma och med proteinutfällning. Utfällningen skedde genom att IS tillsattes med 4X provvolymen där IS var löst i MeOH respektive ACN som proteinfällningsmedel. Plasma från A+ läkemedelsfri blodgivare användes. Plasman överfördes till två rör för jämnvikt vid centrifugering. Sedan centrifugerades röret 10 min 1230 g och överfasen överfördes till ett nytt rör. 3.8.1 Metod 1 Följande extraktionsmetod används vid upparbetning för antiepileptika (26): 1. Sju stycken mikrocentrifugrör märktes upp för blankprov och standardpunkter. 2. 25 µl av blankserum respektive kalibreringslösningar i plasma (se avsnitt 3.7.2) pipetterades till varje mikrocentrifugrör. 3. 100 µl iskall internstandard-lösning i MeOH tillsattes till respektive rör. 4. Mix med vortex. 5. Centrifugering vid 15000 g 6. 25 µl av överfasen pipetterades till en uppmärkt 2 ml 96-hålsplatta. 23

7. 475 µl ultrarent vatten tillsattes till varje brunn. 8. Plattan mixades på en plattskak i 10 min. 9. Plattan placerades i instrumentets sample manager och 2 µl injicerades. Denna metod testades även genom att halva mängden ultrarent vatten tillsattes varvid en högre koncentration av analyterna erhölls innan injektion. 3.8.2 Metod 2 Följande extraktionsmetod används vid upparbetning för antidepressiva (27): 1. Sju stycken mikrocentrifug rör märktes upp för blankprov och kalibratorer. 2. 50 µl blank plasma och kalibreringslösningar i plasma (se avsnitt 3.7.2) tillsattes till respektive rör. 3. 100 µl internstandard (ACN) tillsattes till varje rör. 4. Mix med vortex 5. Centrifugering 15000 g 6. 75 µl av överfasen pipetterades till 150 µl glasvial 7. 75 µl av mobilfas A (10 mm AmAc) tillsattes till varje vial. 8. Mix med vortex 9. Vialerna placerades i instrumentets sample manager och 2 µl injicerades. Efter att ha testat båda metoderna valdes metod 2 som extraktionsmetod. 3.9 Renhetskontroll internstandarder En kontrollösning endast innehållande IS tillverkades med koncentrationen 1,0 µg/ml i 90:10 H2O:ACN från stamlösningarna till en slutvolym på 5 ml. Lösningen placerades sedan i en 150 µl vial för analys i instrumentet. Detta gjordes för att avgöra renheten på IS i instrumentet och se om den innehåller bara den deuterade formen eller att analyten kan påvisas. Därefter räknades procenten ut för mängden analyt/internstandards area (se tabell XI). Därefter gjordes en upparbetning med H2O istället för plasma som en renhetskontroll. Det sista spädningssteget för de nya kalibratorerna gjordes i ACN. Upparbetningsmetoden gjordes enligt metod 2 i mikrocentrifugrör. Därefter gjordes en 50:50 spädning 5 gånger till 24

kalibrator 1-6. Denna spädning gjordes med en tillverkad lösning på 90:10 H2O:ACN. Anledningen till detta är för att se renheten i ett prov utan plasma. 3.10 Statistik Beräkning av spädningsserier och kalibratorer har gjorts i Excel, beräkning av monisotopiska molekylvikter i Masslynx och detektion av fragment gjordes med programvaran Xevo TQ-XS MS Detector IntelliStart. 3.11 Etik Under utvecklingen av metoden har inga prover med patientinformation använts. Plasman som användes vid test av extraktionsmetod inkom från blodcentralen på US utan patientinformation uppmärkt A+ plasma från läkemedelsfri blodgivare. Som anställd är det viktigt att tänka på de etiska aspekterna och att varje prov kommer från en patient och ska respekteras. 4 RESULTAT Syftet med detta projekt har varit att utveckla en kromatografi och extraktionsmetod med LC-MS/MS för att detektera utvalda antipsykotiska läkemedel och deras metaboliter i humanplasma. Efter optimeringen av masspektrometern för respektive analyt där molekyljoner som fångats upp i MS1, och de två mest framträdande fragmenten som fångats upp i MS2 sammanställdes resultatet (se tabell X). För att komma fram till det bästa alternativet av mobilfas så experimenterades det med sura och basiska mobilfaser där de som var mer basiska, dvs ett högre ph visade sig ge en bättre separation. Efter att ha testat flertalet kombinationer och kolonner valdes det att gå vidare med Cortecs UPLC C18 (1,6 µm 2,1x50 mm) och mobilfas A: 10 mm ammoniumacetat i H2O mobilfas B: Acetonitril (se vidare nedan). När valet av kolonn och mobilfas hade gjorts tillverkades en spädningsserie för att utvärdera linjäriteten (se bilaga V, tabell VII). Vid analys utformades en standardkurva per analyt med ett R värde nära 0,99 vilket tyder på en bra korrelation mellan punkterna (se bilaga VI, figur 8). Standardkurvan är gjord med seriespädning baserat på enkelprov. Liknande standardkurva bildades med och utan plasma med ett R- värde nära 1. Vid optimeringen av kromatografin användes en injektionsvolym på 2 µl, 25

kolonntemperatur på 55 C och ESI inställd i positiv mode för respektive analysförsök. Problem med att hitta rätt massor vid optimeringen skedde vid t.ex. uträkning av molekylvikten som gav upphov till felaktig fragmentering för substansen perfenazin men korrigerades med hjälp av vetenskaplig litteratur. För inställningar på masspektrometern för respektive analyt (se tabell X). 26

Tabell X. Inställningar för masspektrometern med MRM transitioner, kollisionsenergi, konspänning och retentionstid (RT) för samtliga analyter. Analyt Molekyljon (m/z) Fragment (m/z) Kollisionsenergi (ev) Konspänning (V) RT (min) Quetiapin 384.1 253.038 22 4 2.20 177.87 56 4 Quetiapin-D8 392.2 257.793 22 40 2.16 Norquetiapin 296.0 209.94 26 5 1.67 253.05 26 5 7-Hydroxyquetiapin 400.1 269.043 22 2 1.48 236.86 38 2 Klozapin 327.1 270.017 24 46 2.22 191.986 46 46 Klozapin-D4 331.1 272.184 24 18 2.21 N-Desmetylklozapin 313.0 192.009 40 54 1.57 270.052 24 54 Klozapin N-oxid 343.0 191.99 42 2 1.51 243.29 42 2 Olanzapin 313.1 256.099 22 28 1.71 197.98 40 28 Olanzapin-D8 321.2 260.89 24 30 1.66 N-Desmetylolanzapin 299.1 256.083 22 36 1.57 212.93 26 36 Risperidon 411.2 191.076 26 12 1.62 110.036 46 12 Risperidon-D4 415.2 195.096 30 12 1.59 9-Hydroxyrisperidon 427.2 207.083 26 16 1.44 110.037 40 16 Aripiprazol 448.1 285.043 26 2 2.96 175.993 32 2 Aripiprazol-D8 456.2 293.112 28 8 2.90 Dehydroaripiprazol 446.1 285.079 22 4 2.79 97.996 36 4 Perfenazin 404.0 171.115 24 54 2.42 143.015 28 54 Zuklopentixol 401.1 220.997 54 42 2.53 230.947 34 42 Flupentixol 435.1 100.018 26 20 2.71 305.008 28 20 Haloperidol 376.1 122.975 38 20 1.85 164.99 24 20 Haloperidol-D4 380.1 127.01 36 4 1.84 Brexpriprazol 434.1 273.133 24 8 2.52 98.063 40 8 Brexpiprazol-D8 442.2 106.127 42 10 2.46 Kariprazin 427.1 382.114 26 2 2.61 187.956 38 2 Kariprazin-D8 435.2 192.181 42 48 2.51 Desmetylkariprazin 399.1 382.067 26 68 2.33 187.966 38 68 N-Desmetylkariprazin 413.1 382.092 26 42 2.33 339.059 26 42 Lurasidon 493.2 120.044 60 24 3.84 166.026 42 24 Lurasidon-D8 501.3 166.025 40 10 3.79 27

Följande kombinationer av mobilfaser gav bäst separation per kolonn: 4.1 Analys med Cortecs UPLC C18 (1,6 µm 2,1x50 mm) och 50 mm AmAc och ACN Detta var den kombination som gav bäst resultat av alla försök under projektets gång och är den kombination som kommer ingå i den slutliga metoden. Alla analyters topparna blev smala och utan tendens till dubbeltoppar (se figur 9). Tiden för analys var 5,2 min med en linjär gradient till 4,2 min (se tabell IV). Minimum tryck under analysen var 219,7 bar, maxtryck 379,7 bar och medeltryck 332,4 bar. I figur 10 presenteras analyterna och gradienten i en overlay-plot (se bilaga VII). Figur 9. Kromatogram med kolonn Cortects UPLC C18 och mobilfas 50 mm ammoniumacetat och acetontril. Sluttiden för analysen är 5,20 min. Maxtryck under analysen var 379 bar. 28

4.2 Analys med Kintex Biphenyl (1,7 µm 2,1x100 mm) och 10 mm AmAc + 0,1% Myrsyra och 0,1% Myrsyra i MeOH. Denna kombination gav upphov till att topparna kommer ut senare i kromatogramet t.ex. för lurasidon med retentionstid 4,6 min jämfört med 3,83 min för den valda metoden. Anledningen till att analyterna kommer ut senare beror dels på att kolonnen är längre (100 mm) och att mobilfas B är metanol som är mindre pådrivande. Även att π-π intraktion mellan substanserna och stationära fasen kan ha bidragit till de längre retentionstiderna. Tiden för analys var 6 min med en gradient till 5,20 min med initialt en högre andel mobilfas B (se tabell V). Minimumtryck under analysen var 648,6 bar, maxtryck 884,1 bar och medeltryck 801,0 bar. Förutom detta är det mer släpande toppar och en tydlig dubbeltopp för substansen flupentixol. Analysen med Kintex (se bilaga VII, figur 11) Biphenyl (1,7 µm 2,1x100 mm) valdes bort. 4.3 Analys med UPLC BEH Phenyl (1,7 µm 2,1x50 mm) och 10 mm AmAc och ACN Analys med denna kolonn och kombination av mobilfas gav relativt symmetriska toppar men med en del interferenser i kanalen för dehydroaripirazol. Tiden för analys var 6 min och en linjär gradient till 5,20 användes (se tabell IV). Minimumtryck under analysen var 228,9 bar, maxtryck var 412,6 bar och medeltryck 345,0 bar. Försöket gav en något svansande topp för aripiprazol och en dubbeltopp för zuklopentixol. Förutom detta ligger även retentionstiden för olanzapin och n-desmtylklozapin väldigt nära varandra och överlag är separationen mellan substanserna sämre (se bilaga VII, figur 12). UPLC BEH Phenyl (1,7 µm 2,1x50 mm) valdes bort. 4.4 Analys med UPLC BEH C18 (1,7 µm 2,1x50 mm) och 10 mm AmAc + 0,1% myrsyra i H2O och 10 mm AmAc + 0,1% myrsyra i MeOH Analys med denna kolonn och mobilfas gav en sämre separation mellan analyterna, en dubbeltopp för zuklopentixol och interferenser i kanalen för brexpiprazol (se bilaga VII, figur 13) Tiden för analys var 5 min och en gradient till 4,20 användes (se tabell VI). Minimum tryck var 544,4 bar, maximum tryck 757,6 bar och medeltryck på 662,7 bar. UPLC BEH C18 (1,7 µm 2,1x50 mm) valdes bort. 29

4.5 Extraktionsmetod Två stycken extraktionsmetoder testades med proteinutfällning där metod 2 valdes pga en högre uppmätt area för respektive analyt och internstandard än för metod 1. Proteinutfällningen skedde i MeOH för metod 1 och i ACN för metod 2. 4.6 Renhetskontroll internstandarder Renhetskontrollen visade att IS-lösningarna innehöll en väldigt låg halt av respektive analyt. Renhetskontrollen bör ligga på ca 1% för att konstatera att IS inte ger utslag för analyten (se tabell XI). Tabell XI. Renhetskontroll av IS. Renhetskoll av IS (1,0 µg/ml) Area IS Area Andel i % Brexpiprazol-D8 7021,766 6297642,5 0,1% Kariprazin-D8 18488,26 6814585,5 0,3% 9-Hydroxyrisperidon-D4 52215,117 72370648 0,1% Aripiprazol-D8 23922,74 6120843,5 0,4% Klozapin-D4 135390,734 49785168 0,3% Haloperidol-D4 52098,25 52565540 0,1% Lurasidon-D8 15086,763 37266372 0,0% Olanzapin-D8 43647,145 49774484 0,1% Quetiapin-D8 28303,742 4184684 0,7% Risperidon-D4 994461 72370648 1,4% 5 DISKUSSION 5.1 Beredning av lösningar Brexpiprazol löste sig inte i acetonitril och vatten som var de lösningsmedel som skulle användas enligt anvisningar på medföljande certifikat, trots att lösningen fick stå över natt. Därefter tillsattes 0,01 M HCl droppvis för att se om substansen skulle lösa sig och omblandning i ultraljudsbad. Efter tillsatts av 0,01 M HCl tillverkades en starkare lösning av HCl (1% från 37%). Därefter gjordes en lösning på 50 ml 50:50 1% HCl:MeOH och 40 ml av denna tillsattes till lösningen. Detta gjorde att lösningen fick en koncentration på 0,2088 mg/ml istället för den förväntade koncentrationen 1,044 mg/ml. Efter omblandning i ultraljudsbad blev lösningen slutligen klar och kunde användas. Eftersom 30

koncentrationen var lägre än planerat tillsattes även en större mängd av denna substans till kontrollösningen för att kunna detekteras. Eftersom substansen var svårlöslig enligt rekommendationen från leverantören gjordes bedömningen att lösa dess internstandard brexpiprazol-d8 1,075 mg/ml i MeOH till en koncentration på 0,1075 mg/ml enligt en liknande studie med brexpripraxzol (23). Detta gjordes för att vara säker på att all substans skulle gå i lösning. Klozapin N-oxid beställdes i både lösning och pulverform då lösningen inte hann fram i tid. Burken med pulver var inte invägd till ett exakt värde och innehållet fick därför vägas in på en analysvåg. Den invägda vikten blev 2,75 mg och den angivna mängden på burken var ca 5 mg. En lägre invägd vikt kan bero på att en del av pulvret satt fast i botten och på kanterna i insatsen som inte lyckades skrapas ut. Det kan även bero på att en analysvåg kan ha svårt att visa ett exakt värde i små mängder, vilket t.ex. kan bero på statisk elektricitet. Vågens mätområde var dock från 1 mg till 10 g. Detta gjorde att lösningen fick en koncentration på 0,55 mg/ml. 5.2 Beredning av kontrollösning Kontrollösningen innehåller samtliga substanser med koncentrationen 50 ng/ml och tillverkades så att den innehöll 90% H2O och 10% MeOH. Anledningen till detta är för att en för stor mängd metanol vid gradientens start kan leda till ett brett startband som gör att topparna blir osymmetriska. Det man vill uppnå är att efterlikna gradientens startkomposition. En del substanser tillsattes till kontrollösningen i efterhand då substanserna inkom vid olika tillfällen eller tog längre tid att få i lösning, detta gav upphov till en hel del extra arbete. Klozapin N-oxid tillsattes i efterhand till den färdiga lösningen istället för att tillsättas i det första spädningssteget med de andra substanserna. Detta gjorde att ytterligare en spädning av denna substansen gjordes från 0,55 mg/ml som ursprungskoncentration till 100 µg/ml och sedan tillsattes 5 µl till den färdiga kontrollösningen på samma vis som internstandardlösningarna tillsattes. brexpiprazol tillsattes i en för svag koncentration i det första spädningssteget vilket syntes vid optimeringen av kromatografin. Eftersom brexpripraxol var svårlöslig fick den en slutkoncentration på 0,2088 mg/ml och var därför 5 gånger svagare än övriga substanser 31

med koncentrationen 1,0 mg/ml. Detta kompenserades genom ytterligare tillsatts av substansen till den färdiga lösningen för att få rätt koncentration på 50 ng/ml. Vid analys av kontrollösningen visade sig substanserna aripiprazol och dehydroaripiprazol ha en väldigt liten area. Efter att ha tillverkat en ny lösning endast innehållande aripiprazol och en innehållande bara dehydroaripiprazol konstaterades det att koncentrationen i kontrollösningen av dessa substanser var väldigt låg, lägre än 50 ng/ml. En anledning till detta kan vara att aripiprazol och dess metabolit dehydroaripiprazol lättare bryts ned än andra substanser. Beslutet togs att tillsätta en koncentration på 100 ng/ml av aripiprazol och dehydroaripiprazol till den färdiga lösningen. Även detta visade sig ha en väldigt låg area och därför tillsattes en slutkoncentration på 200 ng/ml till kontrollösningen. Dessutom var koncentrationen för brexpiprazol och perfenazin något låg i när man jämförde med lösningar endast innehållande substansen samt att kanalerna för dessa substanser innehöll dubbeltoppar vilket gjorde det osäkert vilken av topparna som var den eftersökta substansen. Därför spikades kontrollösningen till en slutkoncentration på 100 ng/ml av brexpiprazol och 100 ng/ml av perfenazin. 5.3 Optimering av metoden Vid jämförelse av kromatogramet av kontrollösningen och för en analys av bara injektion av mobilfas konstaterades att två fragment för aripiprazol och dehydroaripiprazol fanns i båda vilket tyder på att det troligtvis är något annat som detekterats än den eftersökta substansen. För att vara säker på att dessa ämnen är separerade (skiljer bara två väten, så en kontamination kan ha skett vid infusion) och att rätt fragment är detekterade så gjordes en manuell infusion av aripiprazol, dehydroaripiprazol och aripiprazol-d8 för optimering av masspektrometern. För att vara säker på detta användes referensfragment enligt en artikel som detekterat dessa substanser (13). Den manuella infusionen av aripiprazol och dehydroaripiprazol visade m/z för fyra stycken fragment samt kollisonsenergi som noterades. För aripiprazol-d8 noterades fem fragment och deras kollisonsenergi. De fragment som programvaran hade hittat byttes ut mot den manuella optimeringen som även kontrollerades mot vetenskaplig litteratur vilket gav ett bättre resultat för dessa substanser. Under optimeringen av kromatografin var det svårigheter med att erhålla symmetriska toppar för brexipiprazol, brexipiprazol-d8 och perfenazin i kromatogramet. Först valdes 32

därför att byta ut mobilfaserna till något surare ph än de mobilfaser som valdes ut till optimeringen (1). De mobilfaserna som valdes till detta var mobilfas A: 0,2% myrsyra i vatten och mobilfas B: 0,2% myrsyra i ACN. Substanserna injicerades på kolonnerna Kinetex Bifenyl (1,7 µm 100x2,1 mm) och UPLC BEH C18 (1,7 µm 2,1x50 mm) utan att märka någon förbättring i kromatogramet. Fragmenten för brexpiprazol som gjordes vid optimeringen av masspektrometern studerades. Det visade att 4st större fragment bildades av molekyljonen och gav en misstanke om felaktigt resultat då det inte överenstämde med bildade fragment i vetenskaplig litteratur. Beslutet att göra en manuell optimering i masspektrometern gjordes där molekyljonen var svår att detektera och mycket brus syntes. En starkare lösning av brexipiprazol från 0,1 µg/ml till 1,0 µg/ml tillverkades utan förbättring. Därefter utvärderades brexipiprazol både manuellt och därefter i datorns programvara. Internstandarden brexipiprazol-d8 analyserades också om med programvaran och gav ett bättre resultat än föregående. Perfenazin gav en osymmetrisk topp i kromatogramet vilket gav en osäkerhet om att det var just den substansen och en manuell optimering gjordes. Efter att ha studerat en artikel med analys av perfenazin noterades att fel molekylvikt angivits (507 istället för 403) (20). Förklaringen till detta var att vid uträkningen av molekylvikten och den monoisotopiska vikten hade klor (Cl) förväxlats med kol+jod (CI) och således hade en felaktig molekylvikt använts vid fragmenteringen. Efter att dessa frågetecken hade rätats ut injicerades kontrollösningen på nytt med ett bättre resultat. En felkälla är att mättiden inte förlängdes samtidigt som tiden för gradienten förlängdes vid optimeringen. Detta gjorde att instrumentet slutade att mäta efter en viss tid och ingen topp syntes då mättiden vart för kort. Samtliga kombinationer fick därför analyseras på nytt. En stor nackdel vid optimeringen är att skifta mellan mobilfaser och kolonner. Detta tar tid då man måste tvätta ur mellan byte av mobilfaser och ekvilibrera (jämvikta) kolonnerna. Det tar längre tid att ekvilibrera kolonnen när man växlar mellan ACN och MeOH. Förbättringsförslag vid framtida optimeringar är att göra alla experiment med metanolmobilfaser innan man byter till de med ACN. Om kolonnen inte ekvilibreras korrekt kan skiftande retentionstider och dålig reproducerbarhet uppstå. Några av de substanser som var svårast att få symmetriska toppar på under projektets gång var zuklopentixol och flupentixol. Dessa substanser bildade ofta dubbeltoppar i kromatogramet och var svåra att få ut i samma kromatogram. För att se om dubbeltopparna 33

bildades som en effekt av att halten ammoniumformiat ändrades under gradientelueringen så tillverkades nya mobilfaser med samma koncentration: mobilfaser A: 2mM ammoniumformiat + H2O och B: 2 mm ammoniumformiat + MeOH. Dessa lösningar tillverkades även i 5 mm och testades på respektive kolonn utan påverkan på substansernas dubbeltoppar. Internstandard för perfenazin inkom från leverantör i slutet av projektet och ingår därför inte i rapporten pga tidsbrist. 5.4 Beredning av kalibreringslösning och internstandard Kalibreringslösningen tillverkades i olika versioner. Först tillverkades den enligt ett spädningsschema i 6 nivåer i 90:10 H2O:MeOH på liknande vis som kontrollösningen. Den högsta nivån baserades på de terapeutiska intervallen (se tabell I, tabell VIII). Detta gav dock låg area och koncentrationerna överensstämde inte med förväntat resultat. Därefter gjordes en ny spädningsserie från kontrollösningen i fem halveringar med 90:10 H2O:MeOH till totalt 6 st kalibratorer men även detta gav en låg area efter analys i instrumentet. Bara injektion av mobilfas gav en väldigt hög area vilket innebar en risk för kontamination av kontrollösningen så vialen testades att bytas. Detta resulterade i en fortsatt hög area på solvent men låg area på kalibratorerna vid omanalys. För att testa om resultatet kunde bero på plastvialerna med konform som användes så analyserades en ny kalibrator 5 med hälften från kontrollösningen och hälften 90:10 H2O:MeOH i en glasvial istället vilket gav en större area. Förklaringen till detta kan vara att nålen suger upp provet i botten av röret vilket gör att i konform fås inte så mycket upp för injektion eller eventuellt statisk elektricitet. Spädningsserien gjordes om från början i glasvialer vilket gav ett betydligt bättre resultat. Kalibreringslösningarna med plasma gjordes därefter i glasvial på liknande vis. 5.5 Renhetskontroll av internstandard Renhetskontrollen av IS-lösningarna gav en låg area av de icke deuterade läkemedlen och dess metaboliter dvs. innehåller nästan enbart den deuterade formen av analyten, vilket gör att tillskottet av IS-lösningen är försumbar vid beräkningen av koncentrationerna i prover och kontroller. 34

5.6 Ekonomiska aspekter och klinisk relevans Det är väsentligt att patienter som lider av psykisk sjukdom får behandling så fort som möjligt för att minska bl.a. självmordsrisk (8). En snabbare vård när det kommer till medicinering av patienter kan även bidra till att färre patienter läggs in på psykiatrin, vilket är positivt ur ett ekonomiskt perspektiv. Med hjälp av detta examensarbete är en ny metod för att mäta antipsykotika på Linköpings universitetssjukhus under utveckling. Detta kommer att bidra till att behandlande läkaren kommer kunna få snabbare provsvar då dessa patientprover förut skickades till andra laboratorium för analys. På detta sätt ger det upphov till en effektivare vård. Förutom detta kommer även en sammanhållen journalföring med elektroniska remisser och svar att användas vilket bidrar till en säkrare vård för patienterna. 6 SLUTSATS I detta projekt har 12 antipsykotiska läkemedel och 9 metaboliter framgångsrikt detekterats i samma LC-MS/MS metod. En fungerande extraktionsmetod med proteinutfällning i humanplasma har även testats. Övriga målsättningar med projektet var att vidareutveckla metoden till en kvantitativ analysmetod och därefter validera metoden. Detta hade dock lägre prioritet och har inte hunnits med inom ramen för detta examensarbete på 10 veckor (15 hp). För att metoden ska kunna användas vid rutinanalys återstår en del arbete när det kommer till validering, optimering av masspektrometerns inställningar, test av extraktionsutbyte, matriseffekter, analys av patientprov och jämförelse med andra laboratorier som utför dessa analyser. 35

TACK Ett stort tack till klinisk farmakologi i Linköping för att jag fick lov att göra mitt examensarbete där. Ett särskilt tack till min externa handledare Björn Carlsson för din rådgivning med arbetet och till Andreas Ärlemalm för att tålmodigt svarat på mina frågor och hjälpt mig reda ut frågetecken under dessa veckor. Jag vill även tacka min interna handledare Sven Tågerud för din feedback på min rapport. 36

7 REFERENSER 1. Herlofson J, Ekselius L, Lundin A, Mårtensson B, Åsberg M. Psykiatri. 2., [rev. och omarb.] uppl. ed. Studentlitteratur; 2016. 2. Folkhälsomyndigheten. Begrepp [Internet]. Folkhälsomyndigheten; 2017. Available from: https://www.folkhalsomyndigheten.se/livsvillkorlevnadsvanor/psykisk-halsa-och-suicidprevention/psykisk-halsa/begrepp-psykiskhalsa/. 3. Stahl SM, Muntner N. Stahl's essential psychopharmacology : neuroscientific basis and practical application. 4th ed. ed. Cambridge University Press; 2013. 4. Jarbin HM, Mussie. Psykoser: Läkemedelsverket; 2018. 5. Lavebratt C, Olsson S, Backlund L, Frisen L, Sellgren C, Priebe L, et al. The KMO allele encoding Arg452 is associated with psychotic features in bipolar disorder type 1, and with increased CSF KYNA level and reduced KMO expression. Mol Psychiatry. 2014 Mar;19(3):334-41. 6. AB LS. FASS [Internet]. Sverige: Läkemedelsindustriföreningens Service AB:; 2019 [cited 2019-05-08]. Available from: https://www.fass.se. 7. Sanai-Farid S, Backlund L. ABC om Bipolär sjukdom. Läkartidningen. 2019 (11). 8. Hansson C, Joas E, Palsson E, Hawton K, Runeson B, Landen M. Risk factors for suicide in bipolar disorder: a cohort study of 12 850 patients. Acta Psychiatr Scand. 2018 Nov;138(5):456-63. 9. Herlofson J. Mini-D 5 : diagnostiska kriterier enligt DSM-5. Pilgrim Press; 2014. 10. Yeragani VK, Tancer M, Chokka P, Baker GB. Arvid Carlsson, and the story of dopamine. Indian J Psychiatry. 2010 Jan;52(1):87-8. 11. Lindström E, Norlén P. Farmakologi. 3. uppl.. ed. Stockholm: Stockholm : Liber; 2014. 12. Hiemke C, Bergemann N, Clement HW, Conca A, Deckert J, Domschke K, et al. Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Neuropsychopharmacology: Update 2017. Pharmacopsychiatry. 2018 Jan;51(1-02):e1. 13. Patteet L, Maudens KE, Sabbe B, Morrens M, De Doncker M, Neels H. High throughput identification and quantification of 16 antipsychotics and 8 major metabolites in serum using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta. 2014 Feb 15;429:51-8. 14. Socialstyrelsen. Socialstyrelsens statistikdatabas [Internet]. Sverige: Socialstyrelsen; 2019 [cited 2019-05-08]. Available from: https://www.socialstyrelsen.se/statistik/statistikdatabas. 15. Corporation W. Beginners guide to UPLC. In: Corporation W, editor. Beginners guide to UPLC. Milford: Waters Corporation; 2012. p. 52. 16. Simonsen F. Analysteknik : instrument och metoder. Lindegren R, editor Lund: Lund : Studentlitteratur; 2005. 17. Wilson K, Walker JM. Principles and techniques of biochemistry and molecular biology. 7. ed.. ed. Cambridge: Cambridge : Cambridge University Press; 2010. 18. Balogh MP. The masspectrometry primer. Waters corporation; 2013. 19. Gradinaru J, Vullioud A, Eap CB, Ansermot N. Quantification of typical antipsychotics in human plasma by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for therapeutic drug monitoring. J Pharm Biomed Anal. 2014 Jan;88:36-44. 37

20. Kirchherr H, Kuhn-Velten WN. Quantitative determination of forty-eight antidepressants and antipsychotics in human serum by HPLC tandem mass spectrometry: a multi-level, single-sample approach. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2006 Oct 20;843(1):100-13. 21. Patteet L, Maudens KE, Stove CP, Lambert WE, Morrens M, Sabbe B, et al. The use of dried blood spots for quantification of 15 antipsychotics and 7 metabolites with ultra-high performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry. Drug Test Anal. 2015 Jun;7(6):502-11. 22. Tron C, Kloosterboer SM, van der Nagel BCH, Wijma RA, Dierckx B, Dieleman GC, et al. Dried Blood Spots Combined With Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Quantification of the Antipsychotics Risperidone, Aripiprazole, Pipamperone, and Their Major Metabolites. Ther Drug Monit. 2017 Aug;39(4):429-40. 23. Zou Q, Yan R, Liu W, Wei P. A Validated Quantification Method for Brexpiprazole in Dog Plasma. J Chromatogr Sci. 2018 Sep 1;56(8):702-8. 24. Wang J, Huang H, Yao Q, Lu Y, Zheng Q, Cheng Y, et al. Simple and Accurate Quantitative Analysis of 16 Antipsychotics and Antidepressants in Human Plasma by Ultrafast High-Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry. Ther Drug Monit. 2015 Oct;37(5):649-60. 25. Miroshnichenko, II, Baymeeva NV. Simultaneous Determination of Antipsychotic Drugs and Their Active Metabolites by LC-MS-MS and its Application to Therapeutic Drug Monitoring. J Chromatogr Sci. 2018 Jul 1;56(6):510-7. 26. Carlsson B. Antiepileptika med LCMSMS. 1 ed. Klinisk farmakologi, Linköping: Region Östergötland; 2017. 27. Carlsson B. Antidepressiva med LC MSMS. 2 ed. Klinisk farmakologi: Region Östergötland; 2017. 38

BILAGA I - LÄKEMEDELSTATISTIK Figur 2. Ett stapeldiagram över patienter/1000 invånare som behandlats med antipsykotika under året 2018 (14). i

Figur 3. En trendlinje som visar användandet av aktuella antipsykotika under de senaste 12 åren (14). ii

BILAGA II SUBSTANSERS URSPRUNG Tabell II. Tabellen nedan visar information om alla substansers ursprung. Substans CAS-nr Leverantör Lotnr 7-Hydroxyquetiapin 139079-39-3 SIGMA-ALDRICH FN02171701 9-Hydroxyrisperidon 144598-75-4 SIGMA-ALDRICH FN05061604 Aripiprazol 129722-12-9 SIGMA-ALDRICH FN05061604 Brexpiprazol 913611-97-9 ALSA-CHIM SVI-ALS-19-007 Kariprazin 839712-12-8 ALSA-CHIM ALG-ALS-16-053-P2 Klozapin 5786-21-0 SIGMA-ALDRICH FN05201602 Dehydroaripiprazol 129722-25-4 SIGMA-ALDRICH FN04221602 N-Desmetylolanzapin 161696-76-0 SIGMA-ALDRICH FN04061704 Desmetylkariprazin 839712-25-3 ALSA-CHIM JA-ALS-16-094-P5 Flupentixol 2413-38-9 CHIRON 10358.23-K-ME Lurasidon 367514-88-3 SIGMA-ALDRICH FN08071704 Haloperidol 52-86-8 SIGMA-ALDRICH FN06081602 N-Desmetylkariprazin 1312214-89-3 ALSA-CHIM JA-ALS-16-092-P2 N-Desmetylklozapin 6104-71-8 SIGMA-ALDRICH FN08241807 Norquetiapin 753475-15-9 SIGMA-ALDRICH FN03171701 Olanzapin 132539-06-1 SIGMA-ALDRICH FN12201602 Quetiapin 111974-72-2 SIGMA-ALDRICH FN08291602 Risperidon 106266-06-2 SIGMA-ALDRICH FN07071603 Zuklopentixol 982-24-1 CHIRON 10284.22-K-ME Klozapin N-oxid 34233-69-7 SIGMA-ALDRICH 068M4137V Perfenazin 58-39-9 SIGMA-ALDRICH FN01101802 Tabell III. Tabellen nedan visar information om IS-lösningars ursprung. Substans CAS-nr Leverantör Lotnr Brexpiprazol-D8 913611-97-9 ALSA-CHIM MV-ALS-19-047-P1 Kariprazin-D8 1308278-50-3 ALSA-CHIM ALG-ALS-16-057-P1 9-Hydroxyrisperidon-D4 1020719-55-4 SIGMA-ALDRICH FN01291602 Aripiprazol-D8 1089115-04-7 SIGMA-ALDRICH FN03241705 Klozapin-D4 204395-52-8 SIGMA-ALDRICH FN03161804 Haloperidol-D4 136765-35-0 SIGMA-ALDRICH FN04041702 Lurasidon-D8 367514-88-3 SIGMA-ALDRICH FN01141604 Olanzapin-D8 132539-06-1 SIGMA-ALDRICH FN04291602 Quetiapin-D8 1185247-12-4 SIGMA-ALDRICH FN12071601 Risperidon-D4 1020719-76-9 SIGMA-ALDRICH FN04191602 Perfenazin-D8 iii

BILAGA III ANTIPSYKOTISKA LÄKEMEDELS MOLEKYLVIKTER Antipsykotiska läkemedels molekylvikter beräknade i programmet Masslynx. Analyt Summaformel m/z Molekylvikt (monoisotopisk) 7-Hydroxyquetiapin C 21H 25N 3O 3S 400.1695 (1+) 399.1617 9-Hydroxyrisperidon C 23H 27FN 4O 3 427.2145 (1+) 426.2067 Aripiprazol C 23H 27Cl 2N 3O 2 448.1559 (1+) 447.1480 Brexpiprazol C 25H 27N 3O 2S 434.1902 (1+) 433.1824 Kariprazin C 21H 32Cl 2N 4O 427.2031 (1+) 426.1953 Klozapin C 18H 19ClN 4 327.1376 (1+) 326.1298 Dehydroaripiprazol C 23H 25Cl 2N 3O 2 446.1402 (1+) 445.1324 N-Desmetylolanzapin C 16H 18N 4S 299.1330 (1+) 298.1252 Desmetylkariprazin C 19H 28Cl 2N 4O 399.1718 (1+) 398.1640 Flupentixol C 23H 25F 3N 2OS 435.1718 (1+) 434.1640 Lurasidon C 28H 36N 4O 2S 493.2637 (1+) 492.2559 Haloperidol C 21H 23ClFNO 2 376.1480 (1+) 375.1401 N-Desmetylkariprazin C 20H 30Cl 2N 4O 413.1875 (1+) 412.1797 N-Desmetylklozapin C 17H 17ClN 4 313.1220 (1+) 312.1142 Norquetiapin C 17H 17N 3S 296.1221 (1+) 295.1143 Olanzapin C 17H 20N 4S 313.1487 (1+) 312.1409 Quetiapin C 21H 25N 3O 2S 384.1746 (1+) 383.1667 Risperidon C 23H 27FN 4O 2 411.2196 (1+) 410.2118 Zuklopentixol C 22H 25ClN 2OS 401.1454 (1+) 400.1376 Klozapin N-oxid C 18H 19ClN 4O 343.1326 (1+) 342.1247 Perfenazin C 21H 26ClN 3OS 404.1563 (1+) 403.1485 Brexpiprazol-D8 C 25H 19D 8N 3O 2S 442.2404 (1+) 441.2326 Kariprazin-D8 C 21H 24D 8Cl 2N 4O 435.2534 (1+) 434.2455 9-Hydroxyrisperidon C 23H 23D 4FN 4O 2 415.2447 (1+) 414.2369 Aripiprazol-D8 C 23H 19D 8Cl 2N 3O 2 456.2061 (1+) 455.1982 Klozapin-D4 C 18H 15D 4ClN 4 331.1628 (1+) 330.1549 Haloperidol-D4 C 21H 19D 4ClFNO 2 380.1731 (1+) 379.1652 Lurasidon-D8 C 28H 28D 8N 4O 2S 501.3139 (1+) 500.3061 Olanzapin-D8 C 17H 12D 8N 4S 321.1989 (1+) 320.1911 Quetiapin-D8 C 21H 17D 8N 3O 2S 392.2248 (1+) 391.2170 Risperidon-D4 C 23H 23D 4FN 4O 2 415.2447 (1+) 414.2369 Perfenazin-D8 C 21H 18CID 8N 3OS 516.1422 (1+) 515.1343 iv

BILAGA IV TILLVERKNING AV MOBILA FASER Följande mobila faser tillverkades under optimeringens gång: Mobilfas A, 2mM Ammoniumacetat + 0,1% ättiksyra i vatten Ammoniumacetat vägdes upp på en analysvåg till 38,5 mg (OptiCal precisa instruments, modell XR125SM-FR) och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml MilliQ-vatten tillsattes och 250 µl ättiksyra. Mobilfas A, 10 mm Ammoniumacetat. 192,5 mg Ammoniumacetat vägdes in på en analysvåg och tillsattes till 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml MilliQ-vatten. Mobilfas A, 0,2% Myrsyra i ACN (250 ml) 250 ml av acetonitril blandades med 0,5 ml myrsyra. Mobilfas A, 0,2% Myrsyra i Vatten (250 ml) 250 ml av MilliQ-vatten blandades med 0,5 ml myrsyra Mobilfas A, 2mM Ammoniumformiat i vatten (250 ml) 31,53 mg ammoniumformiat vägdes upp på en analysvåg och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml av MilliQ-vatten. Mobilfas B, 2mM ammoniumformiat i metanol (250 ml) 31,53 mg ammoniumformiat vägdes upp på en analysvåg och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml av MeOH. Mobilfas A, 5mM Ammoniumformiat i vatten (250 ml) 63,06 mg av ammoniumformiat vägdes upp på en analysvåg och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml av MeOH. Mobilfas B, 5mM ammoniumformiat i metanol (200 ml) 63,06 mg av ammoniumformiat vägdes upp på en analysvåg och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml av MeOH. v

Mobilfas A, 10 mm ammoniumformiat i vatten (250 ml) 157,65 mg ammoniumformiat vägdes upp på en analysvåg och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml MilliQ-vatten. Mobilfas A, 10 mm ammoniumformiat i vatten + 0,1% ammoniak (250 ml) 157,65 mg ammoniumformiat vägdes upp på en analysvåg och tillsattes till en 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml MilliQ-vatten och 0,25 ml ammoniak. Mobilfas A, 10 mm ammoniumacetat + 0,1% ammoniak i H2O (250 ml) 192,5 mg Ammoniumacetat vägdes in på en analysvåg och tillsattes till 250 ml flaska. Därefter tillsattes 250 ml MilliQ-vatten och 0,25 ml ammoniak. vi

BILAGA V- SPÄDNINGSSERIE Tabell VII. Spädningsserie för kalibreringslösningar innehållande 90:10 H2O:MeOH C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH Mängd MeOH Alla utom Klozapin-N-Oxid 1000 10 50 200 30 H2O 85% Klozapin-N-Oxid 100 100 50 200 17 50 20 1 1000 C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH 1000 25 25 1000 975 H2O 3% 25 20 0,5 1000 0,5 C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH 1000 12,5 12,5 1000 975 H2O 3% 12,5 20 0,25 1000 0,5 C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH 1000 12,5 5 2500 2450 2% 5 20 0,1 1000 0,4 C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH 1000 10 2,5 4000 3970 1% 2,5 20 0,05 1000 0,15 C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH 1000 25 5 5000 4975 1% 5 200 1 1000 800 0,20% 1 20 0,02 1000 0,04 C1 (µg/ml)v1 (µl) V1 (µl) C2 (µg/ml) V2 (µl) Spädningsvolym (µl) Spädningsmatris % MeOH 1000 25 5 5000 4950 1% 5 100 0,5 1000 900 0,10% 0,5 20 0,01 1000 0,02 18,61 µl MeOH i slutlösning 2% procent MeOH i slutlösning 81,39 µl MeOH att tillsätta till slutlösning 778,61 µl H2O att tillsätta till slutlösning vii

BILAGA VII - KALIBRERINGSKURVA Figur 8. Exempel på kalibreringskurva för substansen Olanzapin. R-värdet är nära 0,99 vilket tyder på en bra korrelation mellan punkterna. Kurvan gjordes på enkelprov. viii

BILAGA VII KROMATOGRAM Figur 10. Kromatogram som tydligt visar separationen av substanserna och gradienten för Cortects UPLC C18 och mobilfas 50 mm ammoniumacetat och acetontril. Gradienten går till 4,20 min. Dubbeltoppen som syns vid ca 3,70 är troligtvis från inteferens i kanalen för lurasidon. ix

Figur 11. Kromatogram med kolonn Kintex Biphenyl (1,7 µm 2,1x100 mm) och mobilfas 10 mm ammoniumacetat och 0,1% Myrsyra och 0,1% Myrsyra i Metanol. Sluttiden för analysen är 6 minuter med en gradient till 5,20 min. x

Figur 12. Kromatogram med UPLC BEH Phenyl (1,7 µm 2,1x50 mm) och mobilfas 10 mm Ammoniumacetat och acetonitril. Sluttiden för analys 6 min med en gradient till 5,20 min. xi

Figur 13. Kromatogram med UPLC BEH C18 (1,7 µm 2,1x50 mm) och 10 mm AmAc + 0,1% myrsyra i H2O och 10 mm AmAc + 0,1% myrsyra i MeOH. Sluttiden för analysen var 5 min med en gradient till 4,20 min. xii