Optimering av kolorimetrisk mätmetod i ordinarie verksamhet för analys av litium En jämförelse mellan Cobas 6000 och AVL 9180

Optimering av kolorimetrisk mätmetod i ordinarie verksamhet för analys av litium En jämförelse mellan Cobas 6000 och AVL 9180 Jessica Myrberg Examensarbete, 15 hp Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2017

Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinsk analytikerprogrammet Examensarbete, 15 hp Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson ylva.hedberg.fransson@umu.se Examensarbetets engelska titel An Optimizing of a Colorimetric Measurement Method in Standard Operation for Lithium analysis. -A Comparison between Cobas 6000 and AVL 9180. Handledare Eva Sörstam, Laboratoriemedicin, Örnsköldsviks sjukhus Ylva Hedberg Fransson, Klinisk mikrobiologi, Umeå universitet. Läraropponent: Examinator: Maria Brohlin Mari Norgren Datum för godkännande: 2017 06 15

Abstrakt Bipolär sjukdom delas in i typ I och II, vilka yttrar sig i maniska tillstånd och depressiva perioder. Vid typ II kan dessa förekomma samtidigt. Sjukdomen förekommer hos 1-2 % av Sveriges befolkning och kan innebära en grav funktionsnedsättning med avseende på patientens sociala liv och psykiska hälsa. Förstahandsvalet vid behandling av bipolär sjukdom är litium, vilket administreras peroralt. Dosen bestäms genom att litiumkoncentrationen i serum analyseras. Syftet var att etablera en kolorimetrisk analysmetod för att mäta litium på Cobas 6000, dessutom undersöktes det om instrumentet kunde ersätta AVL 9180 med avseende på precision vid analys av patientprover. Resultatet indikerade att bias förelåg hos AVL 9180 när medeldifferensen befann sig 0,04 enheter ovanför nolldifferensen. Samband fanns mellan intervallet för kalibrering och kontrollernas förmåga att förhålla sig inom ±2SD. Cobas 6000 gav lägre medelvärden än AVL 9180 gällande patientproverna, vilket innebar att spridningen av medeldifferenserna blev högre för AVL 9180. Detta talade för att avvikelsen från nolldifferensen inte var slumpmässig utan orsakad av ett systematiskt mätfel. Konklusionen var att med förutsättningen att kalibrering genomförs varje dag, vore Cobas 6000 en lämplig ersättare till AVL 9180. Nyckelord Litium, Cobas 6000, AVL 9180, kolorimetri, ISE, bipolär 3

Introduktion Bipolär sjukdom, tidigare kallad manodepressiv sjukdom, förekommer hos 1-2 % av Sveriges befolkning och kan innebära en grav problematik gällande patientens sociala så väl som fysiska och psykiska hälsa. Sjukdomen karakteriseras av maniska perioder, där patienten kan uppvisa stor omdömeslöshet gällande sin ekonomi, överdriven kreativitet, minskat sömnbehov och lättretlighet. Bipolär sjukdom indelas i typ I och typ II. Vid typ I är de maniska skoven av allvarligare art än vid typ II. Typ I kräver i vissa fall inneliggande vård eftersom risk för psykotiska tillstånd föreligger. Sjukdomen innebär även depressiva perioder, antingen mellan eller integrerat med de maniska skoven. Många patienter kan i långa perioder leva ett normalt liv, men det är av största vikt med kontinuerlig uppföljning av patientens psykiska tillstånd eftersom den suicidala risken är förhöjd för denna patientgrupp. Sjukdomen har hög ärftlighet, och utlöses ofta av ett psykiskt trauma eller långvarig stress (1). Förstahandsvalet vid behandling av bipolär sjukdom är litium som verkar stämningsstabiliserande och har en preventiv effekt för de maniska skoven. Vid behov kan antidepressiva läkemedel användas som komplement till behandlingen. Litium administreras peroralt, dosen bestäms och justeras genom att mäta koncentrationen i serum före och under behandlingen. Terapiintervallet är snävt, vilket innebär att en felaktig analys av provet kan ge upphov till en overksam behandling eller i värsta fall ett akut toxiskt tillstånd (2). Serumkoncentrationen mäts 12 tim efter senaste intag av läkemedlet. Det rekommenderade terapiintervallet är 0,5 0,8 mmol/l, men doser upp till 1,2 mmol/l kan behövas. Ett potentiellt toxiskt tillstånd föreligger vid litiumkoncentrationer mellan 1,2 1,6 mmol/l, däröver är risken mycket förhöjd för intoxikation (3). Cobas 6000 är ett kombinationsinstrument bestående av flera olika moduler. Varje modul hanterar olika typer av analyser som mäter halter av hormoner, tumör- och hjärtmarkörer, proteiner och läkemedel. De metodprinciper som instrumentet använder sig av är till exempel kolorimetriska, immunokemiska och jonselektiva analyser (ISE) (4). Litium analyseras med hjälp av kolorimetri., och i Cobas 6000 blandas provet med R1-reagenset (Roche Diagnostics), som innehåller porfyrinsubstrat, med hjälp av ultraljud. Detta leder till att substratet reagerar med litiumjonerna i serumprovet under ett alkaliskt ph-tillstånd, vilket kommer att resultera i en absorbansförändring. Mätutförandet för kolorimetri består i att en volfram-lampa skickar ut ljus som fångas upp av en konkav spegel. Ljuset förs vidare till en gitterplatta, vilken delar upp ljuset i olika våglängder och isolerar önskad arbetsvåglängd. Våglängder som inte är relevanta för analysen filtreras bort av ett filter. Arbetsvåglängden som valts passerar genom provkyvetten och mängden absorberat ljus registreras av en detektor. Utifrån Nernst-ekvationen kan koncentrationen beräknas, eftersom absorbansen och koncentrationen förhåller sig lika till varandra. Informationen skickas vidare till en dator som omvandlar absorptionsvärdet till koncentrationen av litium (11). Den kalibrator och de kontroller som används till metoden är i lyofiliserat tillstånd innan de späds inför användning. Lyofiliserat innebär att humant serum konserverats genom frystorkning (5). 4

AVL 9180 använder sig av ISE och i instrumentet finns en elektrod för varje elektrolyt som ska analyseras, samt en referenselektrod som kopplar samman elektroderna med varandra. De elektrolyter som analyseras på AVL 9180 i Örnsköldsvik är kalium, natrium och litium. Principen för ISE är att ett känt mätvärde på en jonaktivitet i en intern lösning jämförs mot en okänd jonaktivitet i provet. En membranpotentialskillnad i litiumelektrodens jonselektiva membran uppstår om det finns en skillnad i jonaktivitet och styrka mellan prov och elektrodens inre elektrolyt. En galvaniserad mätkedja inuti elektroden bestämmer skillnaden, som mäts i mv via en voltmätare, vilken kopplar samman litiumelektroden med referenselektroden. Membranpotentialskillnaden jämförs mot en två-punkts kalibreringskurva och utifrån Nernst-ekvationen omvandlas volt till koncentrationen litium i provet (11). Natrium är den dominerande jonen i blodet, vilken styr litiumelektrodens reaktion på skillnader i jonaktivitet och styrka. På grund av detta krävs en natriumkoncentration av 95-180 mmol/l så att litium kan detekteras. Både natrium och litium tillhör gruppen alkalimetaller och har liknande kemiska egenskaper. Av denna anledning finns det även en natriumelektrod i instrumentet så att en justering av natriumhalten kan göras till förmån för beräknandet av halten litium i provet (6). Normalt innehåller ett helblodprov 92 % vätska innehållandes elektrolyter, resterande 8 % består av lipoproteiner. Vid lipemi motsvarar vätskedelen endast 75 %, vilket gör att lipoproteinerna orsakar störningar (turbiditet). Proteinerna bidrar till ökad densitet i serum vilket har betydelse vid spektrofotometri då lipoproteinerna konkurrerar ut den elektrolyt som ska analyseras. Detta medför att en stor del av det avgivande ljuset från spektrofotometern absorberas och kan ge ett lägre värde på de elektrolyter som ska analyseras (7). Hemolys tillsammans med ikterus och lipemi (HIL), kan interferera med provet, därför behöver även en HIL-analys läggas till vid analysbeställningen av litium på Cobas 6000 (5). Studiens syfte var att etablera den kolorimetriska mätmetoden för litium på Cobas 6000 genom att formatera instrumentet så att analysen kunde hanteras av instrumentet. Även en utredning angående om Cobas 6000 vore en lämplig ersättare för AVL 9180 utifrån en jämförelse av den precision de två olika metoderna uppvisade vid analys av patientprover skulle genomföras, samt att utvärdera imprecisionen hos Cobas 6000. 5

Material och metoder Serumprover Det undersökta materialet utgjordes av serumprover från 60 avidentifierade patienter, samtliga var över 18 år. Provtagningen utfördes av personal på den öppna samt den låsta psykiatriska avdelningen, Örnsköldsviks sjukhus, Örnsköldsvik. Analys av proverna gjordes vid Laboratoriemedicin, Örnsköldsviks sjukhus, Örnsköldsvik. Provförberedelser Blodproverna togs i serumrör utan tillsats och fick spontankoagulera under 30 min vid rumstemperatur (RT). Proverna centrifugerades vid 1298 g i 15 min och serumet pipetterades över till nya rör. Detta upprepades två gånger och rören frystes sedan ned vid -20 C. Inför analys tinades proverna vid RT under 60 min och vaggades därefter i tio min. För att undvika kontamination mellan Cobas 6000 (Roche/Hitachi High Technologies Corporation, Tokyo, Japan) och AVL 9180 (Advanced Instruments, INC. Norwood, MA, USA) togs 100 µl serum från centrifugrören till vardera Hitachikopp enligt instruktion innan analyserna påbörjades. Formatering av Cobas 6000 Programvaran för analysmetoden laddades ned till instrumentet och respektive referensvärden med avseende på kalibratorer samt kontroller lades in. Kalibrering Cobas 6000 Calibrator for automated systems (C.f.a.s) och destillerat vatten användes för kalibrering, tillredda enligt protokoll. C.f.a.s (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Kontroller Cobas 6000 Lyphochek Immunoassay Plus Control Level 1 och 3 (Bio-Rad Laboratory, Irvine, CA, USA) tillreddes genom att 5 ml destillerat vatten tillsattes till det lyofiliserade kontrollserumet. Därefter pipetterades 600 µl till vardera Hitachi-kopp som sedan förvarades i -20 C. Level 1 och Level 3 kallades därefter L1 och L3. Referensområde L1 0,356-0,611 mmol/l, L3 1,65-2,08 mmol/l (8). HIL Tilläggsbeställning HIL på Cobas 6000 gjordes för samtliga patientprover. Kalibrering AVL 9180 SnapPak (Roche Diagnostics,). Färdig brukslösning. Kontroller AVL Liquid Unassayed Multiqual (BIO-RAD Laboratories), målvärde 2,3 mmol/l (9). Liquichek (BIO- RAD), målvärde 0,6 mmol/l (10). Färdiga brukslösningar. 6

Kolorimetri Hitachi-koppar innehållande serumprover monterades i rackar anpassade till Cobas 6000 och applicerades i instrumentet. Den arbetsvåglängd som användes vid den spektrofotometriska mätningen var 480 nm. ISE Proverna analyserades genom jonselektiv metod på AVL 9180. Aspiration skedde med instrumentets provnål, provet blandades med reagenslösningen i SnapPak (Roche Diagnostics) i instrumentet och leddes till elektrolytkammaren. Statistik Till samtliga statistiska beräkningar och resultatframställning har Excel 2013 använts. Variationskoefficienten (CV) beräknades för kontrollerna L1 och L3 med syfte att undersöka imprecisionen hos Cobas 6000 innan och efter kalibrering. Bland-Altman korrelationsanalys användes för att undersöka hur väl mätvärdena från de 60 patientproverna stämde överens mellan de två instrumenten de analyserats på. Signifikansnivån var p=0,05. SD-gränserna beräknades för att undersöka om kontrollerna höll sig inom ±2SD. 7

Etiska överväganden Projektet bedömdes inte behöva någon etisk granskning, eftersom patientproverna var avidentifierade och användes för klinisk metodutveckling. Det material som har använts i studien har samlats efter det att alla analyser för patientens behov var gjorda. Patienterna påverkades inte på något sätt av studiens genomförande och löpte inte någon risk vid deltagande i denna studie, det fanns inte heller någon risk för att kränka patientens personliga integritet då proverna var avidentifierade. 8

Resultat Imprecision för Cobas 6000 innan och efter kalibrering Betydelsen av att kalibrera instrumentet beräknades med hjälp av CV för kontrollerna L1 och L3. Detta visade en variation i spridning innan och efter kalibrering (Tab. 1). Kalibrering gjordes en gång per dag på Cobas 6000, på AVL 9180 var fjärde timme. Samband mellan kalibrering och drivande kontroller Det fanns ett samband mellan att kalibrera ofta och kontrollernas stabilitet. Vid analys av kontrollen L1 passerade vissa värden -2SD (Fig.1). Bland-Altman analys av Cobas 6000 och AVL 9180 Litiumkoncentrationen analyserades med Cobas 6000 och AVL 9180 i 60 patientprover. Koncentrationerna avvek från linjen för medelvärdet och skar heller inte genom origo. Några värden överskred ±2SD (Fig. 2). HIL gjordes på samtliga patientprover, inget prov indikerade för lipemi. 9

Diskussion I denna studie har litium analyserats på instrumenten Cobas 6000 och AVL 9180. Studiens syfte var att etablera metoden för litium på Cobas 6000 och undersöka om instrumentet vore en lämplig ersättare för AVL 9180, med avseende på imprecision hos Cobas 6000 och precision vid analys av patientprover för de olika instrumentens olika metoder. Litium har ett väldigt snävt terapiintervall, därav att det finns en risk för intoxikation vid administration till patient. En hög spädning, det vill säga en mindre vätskedel mot en ökad proteindel, kan orsaka turbiditet i provet vilket kan påverka analysresultatet (7). Cobas 6000 svarar dock inte ut lipemiska prover som fått ett HIL-värde av >2000 mg/dl. Gränsvärden för H (>1000 mg/dl), I (>43 mmol/l) och L (>2000 mmol/l) (5). Detta är inget som AVL 9180 varnar om, och det finns en risk för att lipidmolekyler fastnar på elektrodernas membran. Detta kan leda till att ett felaktigt lågt svar ges ut, dels på grund av att Nernst-ekvationen inte kommer att beräknas på ett korrekt sätt, dels därför att resultat från AVL 9180 läggs in manuellt av laboratoriepersonalen i systemet för remissvar och därför kanske inte uppmärksammas (12). Vid utvärdering av imprecisionen för Cobas 6000 framkom det att det var av stor vikt att kalibrera metoden med tätare intervall än var sjunde dag som Roche rekommenderat. En skillnad i CV kunde ses mellan mätserierna innan och efter kalibrering för kontrollerna L1 och L3. Störst skillnad sågs för L1, där spridningen var mer än dubbelt så stor innan kalibrering gjordes. Båda kontrollerna, L1 och L3, avvek kraftigt från referensvärdet i förhållande till hur ofta kalibrering skedde. L1 avvek kraftigare än L3 och gick till och med utanför 2SD. Detta innebar att ju längre intervall mellan kalibrering, desto mindre pålitliga blev analysresultaten. Kontrollen L1 analyserades en dag mindre än kontroll L3 vilket berodde på att R1-reagenset av misstag inaktiverats. Detta moment utförs för att reagenset inte ska förbrukas när dessa kalibreringslösningar som används till litium även används till övriga analyser. Denna skillnad sågs dock som ringa och påverkade inte tolkningen av resultaten. Den statistiska analysen Bland-Altman utgår ifrån att två metoder där samma mätserier mäts bör visa samma resultat (13). De uppmätta litium-koncentrationerna för de 60 patientproverna stämde inte överens mellan de två olika instrumenten. Litiumkoncentrationerna avvek från medelvärdet och linjen skar inte genom origo, vissa värden överskred ±2SD. En perfekt korrelation hade inneburit att medelvärdet för differenserna vore noll, men i detta fall var värdet 2,5 % (0,04 enheter). Det indikerade på bias för en av metoderna. Kalibrering gjordes en gång per dag på Cobas 6000, på AVL 9180 automatiskt var fjärde timme. Detta kan vara en anledning till variationen för mätserierna mellan de olika instrumenten, men ett tätare kalibreringsintervall på AVL 9180 bör ge en mer noggrann mätning än Cobas 6000. Samtidigt får det även tas i beaktning att instrumenten arbetar utifrån olika metoder. Vid utvärderingen av hur Cobas 6000 och AVL9180 stod sig mot varandra upptäcktes ett flertal intressanta olikheter. Till skillnad mot Cobas 6000 använder AVL 9180 elektroder vilket medför extra 10

kostnader för de analyserna. Avseende reagenserna är R1 bara hållbar i instrumentet i 28 dagar, men AVL 9180 kalibrerar automatiskt samtliga analyser som instrumentet kan användas till var fjärde timme, varav en viss mängd reagens i SnapPak kontinuerligt förbrukas vid varje kalibrering. Cobas 6000 är ett mer mångsidigt instrument, eftersom det går att utföra så många fler analyser utöver litium på detta instrument än för AVL 9180. Cobas behöver en separat kalibrator och reagens medan AVL har SnapPack som redan innehåller de båda. Däremot är R1-reagenskassetten som används till Cobas 6000 ett slutet system, vilket är ytterligare en fördel vad gäller laboratoriepersonalens säkerhet vid handhavande. Även tidsaspekten är av värde. På Cobas 6000 tar det tio min att få resultat för fem prover samtidigt, för AVL 9180 tar varje prov cirka fem min att analysera. Det tar också mindre tid att sätta in en rack med plats för fem prover i Cobas 6000, än att vid AVL 9180 stå och hålla rör för rör mot provnålen till att aspirationen är klar. Förslag på förändringar för att avhjälpa problemet med lipemiska prover är att få patienterna att förstå vikten av att följa fastereglerna. Detta kan göra att prover som annars skulle underkännas på grund av lipemi kan minskas. Det är även viktigt att inte genomföra en provtagning för tidigt inpå intag av näringslösningar (14). Konklusionen var att Cobas 6000 gav lägre medelvärden och spridning för de uppmätta patientproverna, ett resultat som talar för att Cobas 6000 har högre precision och vore en lämplig ersättare till AVL 9180, förutsatt att kalibrering sker varje dag. 11

Tack tillägnas Ett tack riktas till Eva Sörstam, Laboratoriemedicin Örnsköldsviks sjukhus, för att hon ställt de instrument jag behövt i min studie till mitt förfogande samt givit mig en pedagogisk och kunskapsfördjupande handledning. Jag vill även tacka Ylva Hedberg Fransson för en mycket bra handledning vid skrivprocessen av denna rapport. 12

Referenser 1. Socialstyrelsen. Hälso- och sjukvård vid kroniska sjukdomar. https://www.socialstyrelsen.se/lists/artikelkatalog/attachments/19930/2015-12-1.pdf. (2017-04-01) 2. Haussmann R, Bauer M, Bonin von S, Grof P, Lewitzka U. Treatment of lithium intoxication: Facing the need for evidence. Int J Bipolar Disord. 2015;3(23). doi: 10.1186/s40345-0-15-0040-2. 3. FASS Vårdpersonal. Lithionit.http://www.fass.se/LIF/product?userType=0&nplId=19971114000058 (2017-05- 04) 4. Gammeren van J. A, Gool van N, de Groot J.M M, Cobbaert M. C. Analytical performance evaluation of the Cobas 6000 analyzer Special emphasis on trueness verification. Clin Chem Lab Med. 2008;46(6):863-871. doi: 10.1515/CCLM.2008.159. 5. Roche Kit Insert R1. Produktdatablad 04679598190. 2015-10. 6. Roche användarmanual AVL 9180. https://www.scribd.com/doc/154371204/avl-9180-oper- Manual-pdf (2017-04-28) 7. Nivea Nara N A, Marcio V. O, Claudio L. S. Procedures to minimize interference of hypertriglyceridemia in laboratory exams of lipemic samples in acute pancreatitits: a Case report. J Bras Patol Med Lab 2016;52(2):103-106. doi: 10.5935/1676-2444. 8. BIO-RAD Lyphochek immunoassay plus control level 1 and 3. Produktdatablad 1536-00. (2015-08) 9. BIO-RAD Liquid Unassayed Multiqual Level 3. Produktdatablad 699. (2015-08) 10. BIO-RAD Liquichek Level 1. Produktdatablad 691. (2016-03) 11. Simonsen F. (2005). Analysteknik instrument och metoder. ISBN 91-44-03613-2. Sid. 133-174. 12. Giavarina D. Understanding Bland Altman analysis. Biochem Med. 2015;25(2):141-151. doi: 10.11613/BM.2015015. 13. Dimeski G, Badrick T, St John A. Ion Selective Electrodes (ISEs) and interferences A Review. Clin Chim Acta. 2010;411(5-6):309-317. doi: 10.1016/j.cca.2009.12.005. 14. Calmarza P, Cordero J. Lipemia interferences in routine clinical biochemical tests. Biochemia Medica. 2011;21(2): 160-166. doi: 10.11613/BM.2011.025. 13

Tabell 1. Jämförelse av imprecision av kontroll L1 och L3 på Cobas 6000. Innan kalibrering CV (%) a Efter kalibrering Kontroll L1 17,6 5,9 L3 4,9 2,1 a) Varje kontroll analyserades 27 gånger per serie 14

A Litiumkoncentration (mmol/l) 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 Drivande L1-kontroll 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 Dag för analys B 2,10 Drivande L3-kontroll Litiumkoncentration (mmol/l) 2,00 1,90 1,80 1,70 1,60 1,50 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 Dag för analys Figur 1. Jämförelse mellan kontroll L1 och L3 med avseende på hur kontrollerna driver mellan kalibreringstillfällena för Cobas 6000. (A) Kontroll L1 analyserades en gång per dag i 22 dagar. (B) Kontroll L3 analyserades en gång per dag i 23 dagar. Från och med dag 17 följdes Roche rekommendation om att endast kalibrera var sjunde dag. Grön stjärna markerar de tillfällen då kalibrering gjorts. 15

Bland-Altman analys 0,80 Differenser Cobas 6000 - AVL 9180 0,60 0,40 0,20 0,00 0,00 0,50 1,00 1,50-0,20-0,40-0,60 Medelvärden Cobas 6000 - AVL 9180 Figur 2. Bland-Altman utförd på patientdata som analyserats på Cobas 6000 och AVL 9180. Medelvärde för de båda mätserierna och differensen mellan dem jämfördes. Totalt ingick 60 patientprover, varje prov analyserades en gång med de olika instrumenten. p=0,05. 16