Molekylärgenetiskt verktyg för diagnos av T- resp. B-cellslymfom i vävnad/paraffin
Diagnostik av Lymfom. Olika ingångar för B-, resp. T-cellslymfom Metodiker: - Morfologi (Mikroskopi) - Immunohistokemi - Immunofenotyp (Flödescytometri) - Genotyp (PCR)
Genotyp (PCR) Gemensam nämnare för de olika typerna av lymfom är monoklonalitet. Finns möjlighet för genetisk analys
Polyklonala versus Monoklonala lymfatiska celler med mikroskopi (förenklat!). Benignt Malignt Benigna lymfatiska celler kan vara svåra att skilja från maligna med mikroskopi!
Polyklonala versus Monoklonala lymfatiska celler med genteknik. Benignt (miljontals) Alla olika m.a.p. IgH alt TCR genen Malignt Frågeställning: Hur analysmässigt undersöka samtliga färgade bollar och finna att en dominerande färg finns (=malign,monoklonalt) eller eller flera färgade bollar finns (=benignt, polyklonalt)?
Genom att studera IgH-genen kan monoklonalitet bekräftas vid B-cells lymfom. Komplicerat att designa markörer för analys!! IgH gen: 14q32.3 PCR produkter mellan 300-350bp kan förväntas vid monoklonalitet.
Genom att studera TCRγ-genen kan monoklonalitet bekräftas vid T- cells lymfom. PCR produkter mellan 80-255bp kan förväntas vid monoklonalitet. TCRγ gen: 7p14
Leukemia (2003) 17, 2257-2317
Generell arbetsgång för monoklonalitetsbestämning med PCR. Snittat provmaterial (5x10µm) för hudar företrädesvis paraffininbäddade biopsier DNA extraktion (modifierad kommersiell metod) 6-8 primer-par beroende på PCR applikation. Dessutom 2-4 primerpar för kontroll (-globin) PCR Elektrofores (agaros följt av heteroduplexanalys) Färgning/fotografering Tolkning
Provuppberabetningsrum - Klinisk Kemi Renrumsarbete (LAF) DNA extraktion Robot (Corbett) sätterpcr körningarna i Strips/96 hålsplattor NanoDrop konc. Bestämning av DNA
PCR resp Elforesrum Real Time PCR AB 7300 Syber Green II TaqMan EtBr Elektrofores GeneFlash Geldokumentation Digitaliserad
PCR / Polymeras Chain Reaction A. PCR är en analysteknik som bygger på en koncetrationsförstärkning av ett in vitro segment av DNA som ligger mellan två regioner med känd sekvens. Kary Mullis B. Till provrör (0,2mL) för analys sätts en mix av: 1. Nukleotider (dntp) A T G C 2. Primers ( 2 st) 3. DNA polymeras (AmpliTaq) 4. Buffert (anpassad: Mg, jonstyrka, ph) 5. DNA prov (10-200ng) Växelvis värmning (94-95 O C) och kylning (45-65 O C) av provet - 30 ggr Resultatet en miljonfall ökning av det eftersökta DNA området.
Analys av PCR körning. 1. Agaros elektrofores 2. Infärgning EtBr 3. Med bedömning av bandlängderna (A, B resp C) mot storleksmarkör (L) identifieras sökta gensekvenser. Bp 50 200 400 850 1500 Elforesriktning L A B C
Positiva band måste bekräftas med högupplösande teknik (Heteroduplex analys) Agaros Benign Page/Heteroduplexanalys ss hd ds Malign
Extraherat DNA från paraffininläggningar varierar i kvalite Faktorer som påverkar amplifieringen (PCR): Fixeringslösningen Längden av fixeringstid Förvaringstid i paraffin DNA extraktionsmetodik Medextraherade hämmare till PCR Snitt-tjockleken Vävnadstyp
DNA fragmenteras vid paraffininläggning = ett analytiskt problem! L DNA vävnad DNA-paraffin
Paraffin: finns en brytpunkt kring 300bp för lyckad PCR *) Biospi är i paritet med hud. **)Emellertid har förbättrad extraktionsmetodik nyligen utarbetats med bättre utbyte!!
Historiska paraffinmaterial Prov från 1995. L VH1 VH1 VH2 VH2 VH3 VH3 VH4 VH4 L VH3 VH3 VH4 VH4 MP MP -325 Follikulärt lymfom, grad 1 L VH5 VH5 VH6 VH6 MP MP -325-268 Körtel, B-cell, malign
Analysbeställning Skicka klots till Avd för Klin. Kemi, Helsingborgs Lasarett Ange provmaterial plus beställare. Svarstid: 14 dagar Svar: Analysrapport som pdf-fil
Erfarenheter PCR/paraffinvävnad Ej helt lätt är ingen vanlig PCR Optimering av PCR:n är nödvändig Pseudoklonalitet kan vara ett gissel Personal: inkörning krävs Svårt med tillräcklig mängd DNA (sp. hud)
Nästa steg Fortsatt samarbete med patologi avd. i RS Utvecklingsarbetet: förbättra känsligheten Ackreditering Forskningsaktiviteter. - Mats Ehinger - Christer Kjellström
Vi som arbetar med detta Lena Hjorthagen Dick Nelson