Erfarenheter från övergången till den nya typningsmetodiken MIRU-VNTR Ramona Groenheit PhD, Mikrobiolog 2012-12-05
Med molekylära typningsmetoder kan vi: Upptäcka och övervaka utbrott Övervaka behandlingen (reinfektion/reaktivering) Studera global epidemiologi (geografiskt ursprung) Upptäcka korskontaminationer på laboratorier
En idealisk typningsmetod borde: Vara billig Vara enkel att utföra Ha mycket hög upplösning Ge snabba resultat Ge resultat som enkelt kan jämföras mellan andra laboratorier
580 2996 802 960 1644 3192 424 577 2165 2401 3690 4156 2163b 1955 4052 154 2531 4348 2059 2687 3007 2347 2461 3171 Exempel på molekylära typningsmetoder RFLP spoligotypning MIRU-VNTR Triplex 1 2 3 4 5 6 7 8 MIRU-VNTR loci Prov X 2 5 2 2 3 3 0 5 5 2 2 0 3 1 5 2 4 2 2 2 3 2 5 3
IS6110 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) På 1990-talet enades man om att RFLP skulle vara golden standard metoden för typning. Metoden bases på polymorphism i IS6110 som finns i olika antal och på olika positioner på kromosomen. RFLP har en hög upplösning och är väldigt reproducerbar. Men metoden kräver stora mängder DNA, är väldigt arbets- och tidskrävande och därmed olämplig när man behöver snabba resultat.
IS6110 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) DNA-extraktion Klyvning med Pvu II Gelelektrofores Analys BioNumerics Hybridisering IS6110
Spoligotypning Metoden baseras på polymorphism i direct repeat regionen. Metoden detekterar och differencierar M. tuberculosis komplexet. Metoden är enkel, snabb och reproducerbar. Tyvärr har metoden en låg upplösning. Metoden ger dock information om vilket lineage stammen tillhör och är den metod som bestämmer om någon stam tillhör familjen Beijing.
Spoligotypning DNA-extraktion eller lysering PCR-amplifiering av direct repeat regionen Förekomst av spacers visualiseras efter inkubering med streptavidin-peroxidas och kemisk luminiscens Biotininmärkt PCRprodukt hybridiseras till immobiliserade oligonukleotider på ett membran
Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. Brudey, K. et al, (2006) BMC Microbiology.
The Guinea-Bissau Family of Mycobacterium tuberculosis Complex Revisited Groenheit R. et al, PLoS ONE (2011)
Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable Number of Tandem Repeats (MIRU-VNTR) Metoden analyserar olika loci som innehåller varierande antal repeats. Det finns ett kommersiellt typningskit för 24 loci (GenoScreen). Metoden är snabb, reproducerbar och har en ganska hög upplösning. MIRU-VNTR har på de flesta håll i världen ersatt RFLP och anses i dag vara ny golden standard.
580 2996 802 960 1644 3192 424 577 2165 2401 3690 4156 2163b 1955 4052 154 2531 4348 2059 2687 3007 2347 2461 3171 Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable Number of Tandem Repeats (MIRU-VNTR) DNA-extraktion eller lysering 24 loci PCR-amplifieras i åtta separata triplexmixer (sex separata quadruplexmixer) De PCR-amplifierade fragmenten separeras med kapillärelektrofores Triplex 1 2 3 4 5 6 7 8 MIRU- VNTR loci Prov X 2 5 2 2 3 3 0 5 5 2 2 0 3 1 5 2 4 2 2 2 3 2 5 3 Fragmenten analyseras i mjukvaran GeneMapper
Vilka typningsalgoritmer har använts? På SMI har RFLP använts sedan 1994. För isolat med få (>5) IS6110 kopior så anses RFLP ha för dålig upplösning och därför har dessa isolat även spoligotypats.
Vilka typningsalgoritmer används nu? På SMI utförs nu sedan mars 2012 spoligotypning och MIRU- VNTR istället. Klusterdefinition = identiskt mönster i spoligo och MIRU-VNTR. Spoligo definerar vilka stammar som tillhör familjen Beijing. Eftersom MIRU-VNTR har dålig upplösning för Beijing-stammar så typas dessa med RFLP.
Vad händer när man byter typningsalgoritm? Ny metod = nytt sätt att se på resultaten = ej direkt jämförbart Vilket material ska vi i fortsättningen jämföra mot? Vad göra med den befintliga RFLP-databasen (ca 5000 isolat)? Typa om isolat (alla isolat från 2011, 2010 samt utvalda kluster). Säg till om misstanke finns om samband med ett äldre fall så typar vi om det gamla isolatet med nya typningsalgoritmen!
Nationella typningsdatabasen på SMI innehåller i dagsläget RFLP resultat för 4978 svenska isolat Spoligo resultat för 3783 svenska isolat MIRU-VNTR resultat för 1673 svenska isolat
antal nya fall Hittas fortfarande kluster-049? 20 Antal fall tillhörande kluster-049 18 16 14 12 10 8 6 Svenskfödd Utlandsfödd 4 2 0 MIRU-VNTR kluster M-044 ankomstår till SMI
Typningsresultaten svaras ut: Till smittskyddsenheterna via SmiNet
Typningsresultaten svaras ut: Till insändande TB-lab i pappersformat via post
ERLN-TB European Reference Laboratory Network for Tuberculosis Extern kvalitetskontroll via två olika projekt: Molecular surveillance of MDR-TB in Europe TB-PAN-NET
Molecular surveillance of MDR- TB in Europe Deltar i pilotprojekt under 2013 där epidemiologiska data och typningsresultat (spoligo och MIRU-VNTR) för alla MDR-fall kontinuerligt ska rapporteras till ECDC via TESSy för att upptäcka pågående spridning över gränserna. Efter pilotprojektets slut är målet att typningsresultat ska rapporteras för samtliga fall.
Tack för att ni lyssnat!