COBAS TaqMan MTB Test

COBAS TaqMan MTB Test FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB 48 Tests P/N: 04803531 190 AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 AVSEDD ANVÄNDNING COBAS TaqMan MTB Test är ett in vitro-test för nukleinsyraamplifiering för kvalitativ detektion av Mycobacterium tuberculosis-komplexets (MTB) DNA i kondenserade, dekontaminerade och koncentrerade luftvägsprover från patienter, inklusive slem och BAL (bronchial alveolar lavages). I testet används AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit för manuell provextraktion och analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 för automatisk amplifiering och detektion. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Släktet Mycobacterium är syrefasta, icke-motila, stavformade, aerobiska bakterier som inte bildar sporer. Det finns flera arter som är patogena för människor. Många mykobakterier är land- och vattensaprofyter. De primära humana patogenerna är de arter som tillhör M. tuberculosis-komplexet (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum och M. microti) och M. leprae. M. tuberculosis är den viktigaste mykobakteriella patogenen och den förekommer endast hos människor. Tuberkulos (TB) är en smittsam sjukdom. Precis som den vanliga förkylningen sprids den via luft. Endast sjuka personer med TB i lungorna är smittsamma. När infekterade personer hostar, nyser, talar eller spottar sprider de TB-bakterier i luften. Det krävs endast att ett litet antal bakterier inhaleras för att en person ska bli infekterad. För närvarande är totalt en tredjedel av världens befolkning infekterad med TB-bakterien. Av de personer som är infekterade med TB-bakterier blir 5 10 % sjuka eller smittsamma någon gång under sin livstid. Det uppskattas att 1,7 miljoner dödsfall inträffade på grund av TB år 2004. Precis som när det gäller sjukdomar i allmänhet har Sydostasien den högsta uppskattade dödssiffran, men den högsta dödligheten per capita finns i Afrika, där HIV har lett till en snabb ökning av TB-förekomst och en ökad sannolikhet att dö i TB. Enligt de WHO-mål som fastställdes av Världshälsoförsamlingen (World Health Assembly) 1991 ska 70 % av de nya smittsamma TB-fallen detekteras, och av dessa ska 85 % botas fram till år 2005. Arton länder hade redan uppnått målet under 2002 1 5. På grund av smittorisken, risken att det uppstår läkemedelsresistenta stammar samt sjukdomens allvarlighetsgrad hos patienter som är infekterade med HIV-1, är det extremt viktigt med en snabb diagnos av M. tuberculosis-komplexet. Isolering av en organism från M. tuberculosis-komplexet är nödvändig för en definitiv diagnos av tuberkulos. Rutinodlingar är tidskrävande och kan ta upp till åtta veckor. Mikroskopisk undersökning av syrefasta utstrykningar är den snabbaste metoden för detektion av mykobakterier, men metoden är okänslig och ospecifik. Immunologiska och serologiska tekniker är generellt begränsade på grund av låg sensitivitet och/eller specificitet 6,7. Utvecklingen av PCR-baserade test specificerade för mykobakterier har visat sig förbättra den snabba tuberkulosdiagnosen ytterligare genom direkt detektion av mykobakterier i kliniska prover 8 14. ANVÄNDNINGSPRINCIPER COBAS TaqMan MTB Test baseras på två grundläggande principer: (1) manuell provextraktion för att erhålla MTB-DNA; (2) samtidig PCR-amplifiering av target-dna med hjälp av komplementära primers och detektion av target-dna genom klyvning av oligonukleotidprober märkta med två olika fluorokromer 15,16. Tillsammans möjliggör de här processerna detektion av den MTB target-amplifierade produkten (amplicon) och Mycobacterium-internkontroll-DNA, vilket amplifieras och detekteras samtidigt som provet. Master Mix-reagenset innehåller ett primerpar som används för att amplifiera en genusspecifik region av kromosomen, och genom en dubbelmärkt target-detektionsprob erhålls specificitet för M. tuberculosiskomplexet (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum och M. microti). Samma primerpar används för att amplifiera internkontroll-dna. Detektion av amplifierat DNA utförs med hjälp av target-specifika och internkontroll-specifika dubbelmärkta oligonukleotidprober som tillåter oberoende identifiering av MTBamplicon och Mycobacterium-internkontroll-amplicon. 1

Extraktion NALC/NaOH 17 -kondenserade, -dekontaminerade slem- och BAL-prover tvättas med tvättlösning för luftvägsprov. Organismer lyseras genom inkubation i lyseringsreagens för luftvägsprov och provet görs amplifieringsklart genom tillsats av neutraliseringsreagens för luftvägsprov. PCR-amplifiering Val av target Mycobacterium-genomet innehåller en maximalt konserverad region med ungefär 1 500 nukleotider som kodar genen för 16S rrna. COBAS TaqMan MTB Test använder Mycobacterium-genusspecifika primers för att definiera en sekvens inom regionen 18. Amplifiering av target PCR-amplifiering sker i K-tubes eller K-trays där extraherade prover tillsätts i amplifieringsblandningen. Reaktionsblandningen värms så att den dubbelsträngade DNA-kedjan denatureras och primer targetsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder primers till sina target-sekvenser. I närvaro av Mg 2+ och överskott av deoxinukleotidtrifosfater (dntps), förlänger Z05 DNA-polymeras bundna primers längs target-mallarna och producerar en dubbelsträngad DNA-molekyl som kallas ett amplicon. Proceduren upprepas automatiskt i analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 under ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Det erforderliga antalet cykler förprogrammeras i analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Amplifiering förekommer endast i regionen för MTB-genomet mellan primers; hela MTB-genomet amplifieras inte. Amplifiering av internkontroll I enzymbaserade amplifieringsprocesser, t.ex. PCR, kan effektiviteten minskas av hämmare som eventuellt förekommer i det kliniska provet. Internkontrollen möjliggör identifiering av extraherade prover innehållande ämnen som kan störa PCR-amplifieringen. Mycobacterium-internkontrollen är ett icke smittsamt rekombinant linjäriserat plasmid-dna med primerbindningsregioner identiska med M. tuberculosis target-sekvensensens, en randomiserad intern sekvens med samma längd- och baskomposition som M. tuberculosis targetsekvensen, och en unik probbindningsregion som särskiljer Mycobacterium-internkontroll-amplicon från target-amplicon. Dessa egenskaper valdes för att ge samma amplifiering för Mycobacterium-internkontrollen och M. tuberculosis-target-dna. Mycobacterium-internkontrollreagenset ingår i COBAS TaqMan MTB Test och tillsätts i varje amplifieringsreaktion för att amplifieras tillsammans med MTB-DNA från det kliniska provet. Mycobacterium-internkontrollen är utformad för att garantera att prover som innehåller hämmare som kan störa amplifiering och detektion av MTB target-sekvensen kan identifieras. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från provet kan göras med COBAS TaqMan MTB Test genom användning av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) 19 och deoxiuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet påvisar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin, men inte DNA som innehåller tymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA men finns däremot alltid i amplicon på grund av att deoxiuridintrifosfat används som en dntp i Master Mix-reagenset, varför endast amplicon innehåller deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzymet före amplifiering av target-dna. Varje icke-specifik produkt som är skapad efter en initial aktivering av Master Mix med magnesium förstörs av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som ingår i Master Mix-reagenset, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocyklersteget vid alkaliskt ph för Master Mix, bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpEraseenzym är inaktivt vid temperaturer över 55 C, dvs. genom alla termocyklersteg. Därför förstörs inte targetamplicon som har bildats under amplifieringen. Detektion av PCR-produkter i ett COBAS TaqMan Test I COBAS TaqMan MTB Test används PCR-teknik i realtid. Användning av prober märkta med två olika fluorokromer möjliggör realtidsdetektion av PCR-produktansamling genom övervakning av emissionsintensitet av reporterfluorokromer som frigörs under amplifieringen. Proberna består av MTB- och Mycobacteriuminternkontrollspecifika oligonukleotider märkta med en reporterfluorokrom och en quencherfluorokrom. I COBAS TaqMan MTB Test märks MTB- och Mycobacterium-internkontrollproberna med olika reporterfluorokromer. Om proberna som är märkta med två olika fluorokromer är intakta hämmas reporterfluorokromen av quencherfluorokromens närhet på grund av energiöverföringseffekter av Förster-typ. Medan PCR pågår hybridiseras proben till en target-sekvens och klyvs med 5' till 3' exonukleasaktivitet hos värmebeständigt Z05 DNA-polymeras. När reporterfluorokromen och quencherfluorokromen har frigjorts och separerats avstannar quenching och den fluorescerande aktiviteten hos reporterfluorokromen ökar. Amplifiering av MTB-DNA och Mycobacterium-internkontroll-DNA mäts oberoende vid olika våglängder. Proceduren upprepas för ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt ökar emissionsintensiteten hos de enskilda reporterfluorokromerna, vilket ger oberoende identifiering av MTB-DNA och internkontroll-dna. 2

REAGENS AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP AMPLICOR extraktionskit för luftvägsprov (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267) RW (tvättlösning för luftvägsprov) Tris-HCl-buffert < 1 % solubiliserande ämne EDTA 0,05 % natriumazid RL (lyseringsreagens för luftvägsprov) 0,2 % natriumhydroxid < 1 % solubiliserande ämne EDTA 0,05 % natriumazid RN (neutraliseringsreagens för luftvägsprov) Tris-HCl-buffert Magnesiumklorid 0,05 % natriumazid COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB (P/N: 04803531 190) Kontrollreagens MYCO IC (Mycobacterium-internkontroll) Tris-HCl-buffert < 0,001 % icke smittbärande plasmid-dna (mikrobiell) innehållande Mycobacterium-primerbindningsekvenser och en unik probbindningsregion < 0,005 % poly ra RNA (syntetiskt) EDTA Amarant-färgämne 0,05 % natriumazid MTB (+) C [M. tuberculosis positiv kontroll] Tris-HCl-buffert < 0,001 % icke smittsamt plasmid-dna (mikrobiellt) innehållande MTB-sekvenser < 0,005 % poly ra RNA (syntetiskt) EDTA 0,05 % natriumazid MYCO ( ) C [Mycobacterium negativ kontroll] Tris-HCl-buffert < 0,005 % poly ra RNA (syntetiskt) EDTA 0,05 % natriumazid 100 test 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml 48 test 4 x 0,1 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 3

Amplifierings- och detektionsreagens MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) 4 x 12 test Tricinbuffert 4 x 0,46 ml Kaliumacetat Kaliumhydroxid Dimetylsulfoxid Glycerol < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % MTB-primers < 0,001 % fluorescensmärkta oligonukleotidprober specifika för MTB och Mycobacterium-internkontroll < 0,001 % oligonukleotid-aptamer < 0,05 % Z05 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiellt) 0,09 % natriumazid MYCO Mg 2+ (Mycobacterium-magnesiumreagens) 4 x 12 test < 1,0 % magnesiumacetat 4 x 0,2 ml 0,09 % natriumazid VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Detta test är endast avsett att användas med slem- eller BAL-prover som har kondenserats, dekontaminerats och koncentrerats med hjälp av metoden NALC-NaOH 17. C. Pipettera inte med munnen. D. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och kitets reagens. E. Undvik mikrobiell kontaminering av reagensen när portioner tas från reagensflaskor. F. Användning av sterila engångspipetter och pipettspetsar rekommenderas. G. Sammanför inte reagens från olika loter eller från olika flaskor i samma lot. H. Blanda inte reagens från olika kit. I. Kassera oanvända reagens, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. J. Använd inte kit efter utgångsdatum. K. Kontakta närmaste Roche-kontor om du vill erhålla säkerhetsdatablad (MSDS). L. Prover och kontroller ska behandlas som smittbärande material i enlighet med exempelvis de laboratorierutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 och i CLSI-dokument M29-A3 21. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. OBS! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. M. RW, RL, RN, MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C och MYCO ( ) C innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. N. Rör med skruvkork ska användas vid prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prover. Rör med snäpplock får inte användas. O. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagens. Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagens ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. P. Om en K-tube eller K-tray öppnas efter amplifiering ska K-carrier, brunnar och den vätska som frisätts behandlas med blekmedel (effektiv koncentration är 5 000 ppm; 0,5 %) över natten, för att förstöra frisatt amplicon. 4

FÖRVARING OCH HANTERING Reagens och kontroller får inte frysas. A. Förvara RW, RL och RN i 2 25 C. I oöppnad förpackning är dessa reagens hållbara till angivet utgångsdatum. B. Förvara MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C och MYCO ( ) C i 2 8 C. I oöppnad förpackning är dessa reagens hållbara till angivet utgångsdatum. C. Förvara delvis använda MTB (+) C och MYCO ( ) C i 2 8 C mellan körningarna. Kontrollera utgångsdatumet på öppnade kontroller innan de används. MTB (+) C och MYCO ( ) C kan användas upp till fyra gånger. När förpackningen öppnats ska MTB (+) C och MYCO ( ) C användas inom 4 veckor, dock senast det angivna utgångsdatumet. D. MTB MMX, MYCO Mg 2+ och MYCO IC levereras i engångsflaskor i uppsättningar om 12 reaktioner. Eventuellt överblivet material ska kasseras. E. Working Master Mix (beredd genom tillsats av MYCO Mg 2+ och MYCO IC i MTB MMX) kan förvaras mörkt i 2 8 C i högst 2 timmar. F. Beredda prover och kontroller måste tillsättas i Working Master Mix inom 2 timmar efter beredning om de förvaras i rumstemperatur, eller inom 8 timmar om de förvaras i 2 8 C. G. Amplifieringen ska startas inom 90 minuter efter att de bearbetade proverna och kontrollerna tillsätts i Working Master Mix. MATERIAL SOM MEDFÖLJER Provextraktionsreagens A. AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR extraktionskit för luftvägsprov (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267) RW (tvättlösning för luftvägsprov) RL (lyseringsreagens för luftvägsprov) RN (neutraliseringsreagens för luftvägsprov) RSP PREP Amplifierings- och detektionsreagens B. COBAS TaqMan MTB Test (P/N: 04803531 190) MYCO IC (Mycobacterium-internkontroll) MTB (+) C [M. tuberculosis positiv kontroll] MYCO ( ) C [Mycobacterium negativ kontroll] MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) MYCO Mg 2+ (Mycobacterium-magnesiumreagens) CTM MTB 5

MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Instrument och programvara Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Programmet AMPLILINK Datastation för programmet AMPLILINK Instrumenthandbok till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2-serien Applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR K-tube öppnare/tillslutare (P/N: 03516539001) K-tray capping tool (P/N: 03339904001) Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 K-carrier (P/N: 28150397001) Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 K-tray carrier (P/N: 03341488001) Engångsartiklar K-tubes (P/N: 03137082001) Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 K-trays (P/N: 03343146001) ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Vortexblandare Pipetteringshjälp: Drummond (P/N: 4-000-100) eller motsvarande 1,5 ml polypropylenrör med skruvkork, sterila, ej silikonbehandlade, koniska (Sarstedt 72.692.105 eller motsvarande)** Rörrack (Sarstedt 93.1428 eller motsvarande) Pipetter (50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl och 1 000 µl)* med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning Sterila transferpipetter med fin spets Mikrocentrifug (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller motsvarande 60 C ± 2 C värmeblock Termometer Absorberande papper Engångshandskar, puderfria Biosäkerhetsskåp med undertryck * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. DNase-fria (eller nukleasfria) spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas när så anges, för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon. ** Rör med skruvkork ska användas för prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prover och kontroller. Rör med snäpplock får inte användas. PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. A. Provtagning Det enda godkända luftvägsprovet är upphostat och framkallat slem eller BAL. Provet måste kondenseras, dekontamineras och koncentreras med hjälp av metoden NALC-NaOH 17. B. Transportera prover Dekontaminerade prover måste transporteras till laboratoriet i 2 25 C inom 24 timmar efter att de tagits. Om proverna inte levereras inom 24 timmar måste de förvaras och transporteras i 70 C. Proverna måste transporteras enligt gällande bestämmelser för etiologiska agens 22. C. Förvaring av prov Dekontaminerade prover kan förvaras i 20 C i högst 2 veckor. Extraherade prover kan förvaras i 70 C i högst 6 månader eller i 2 8 C i högst 4 dagar. 6

BRUKSANVISNING OBS! Detaljerad information om användning, utskrift av resultat samt tolkning av flaggor, kommentarer och felmeddelanden finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2-serien och applikationshandboken till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR. OBS! Om extraktion, amplifiering och detektion utförs under samma arbetsdag ska testet utföras enligt beskrivningen nedan. Om extraktion utförs en annan dag än amplifiering och detektion, ska beredning av reagens utföras samma dag som amplifiering och detektion. OBS! Alla amplifierings- och detektionsreagens måste ha uppnått rumstemperatur innan de används; ta ut dem ur kylskåpet (2 8 C) minst 30 minuter före användning. OBS! Prover måste tinas (om de är frysta), ekvilibreras i 15 30 minuter i rumstemperatur och blandas innan de används. OBS! Använd pipetter med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning om så anges. Var ytterst noga med att undvika smitta. Omgångsstorlek: Varje COBAS TaqMan MTB Test-kit innehåller reagens för fyra omgångar med 12 test, vilka kan utföras separat eller samtidigt. Ett replikat vardera av MYCO ( ) C och MTB (+) C måste ingå i varje testomgång med högst 48 prover och kontroller (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Amplifierings- och detektionsreagensen är förpackade i engångsflaskor för 12 test. Reagensen utnyttjas bäst om prover och kontroller extraheras i grupper som är multiplar av 12. A. Prov- och kontrollextraktion Utförs i: Pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområdet 1. Fastställ det antal prover som ska testas och placera tillräckligt många 1,5 ml polypropylenrör med skruvkork i arbetsområdet så att det finns ett rör för varje prov och ett rör för varje kontroll. Rör med snäpplock får inte användas. Se Varningar och försiktighetsåtgärder. Märk varje extraktionsrör med provets identifieringsnummer. 2. Tillsätt 500 µl RW i varje provrör. 3. Tillsätt, med hjälp av en pipettspets som har aerosolbarriär, 100 µl kondenserat, dekontaminerat och koncentrerat luftvägsprov i röret med motsvarande märkning som innehåller RW. Använd en ny aerosolbarriärpipettspets för varje prov. Sätt kork på rören och vortexa i 5 sekunder. 4. Centrifugera vid 12 500 x g i 10 minuter. 5. Aspirera supernatanten med en transferpipett med fin spets och tillsätt 100 µl RL i cellpelleten med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets för varje prov. Resuspendera pelleten genom att vortexa i 5 sekunder. 6. Bered arbetskontrollerna på följande sätt: OBS! Arbetskontrollerna måste beredas varje dag som testet genomförs och kasseras i slutet av dagen. OBS! MTB (+) C och MYCO ( ) C, som ingår i COBAS TaqMan MTB Test-kitet, är utformade för att kunna användas upp till fyra gånger för beredning av arbetskontrollerna MTB (+) och MYCO ( ). När förpackningen öppnats ska MTB (+) C och MYCO ( ) C användas inom 4 veckor, dock senast det angivna utgångsdatumet. a. Vortexa MYCO ( ) C-flaskan i 5 sekunder. Pipettera 50 µl MYCO ( ) C i ett 1,5 ml polypropylenrör med hjälp av en pipettspets med aerosolbarriär. Tillsätt 200 µl RL. Vortexa i 5 sekunder. Det här är Mycobacterium ( )-arbetskontrollen. b. Vortexa MTB (+) C-flaskan i 5 sekunder. Pipettera 50 µl MTB (+) C i ett 1,5 ml polypropylenrör med hjälp av en pipettspets med aerosolbarriär. Tillsätt 200 µl RL. Vortexa i 5 sekunder. Det här är M. tuberculosis (+)-arbetskontrollen. c. Pipettera 100 µl av varje arbetskontroll i ett 1,5 ml polypropylenrör med skruvkork att bearbetas parallellt med de kliniska proverna. 7. Inkubera prover och kontroller i ett 60 C ± 2 C torkvärmeblock i 45 minuter. 8. Ta bort rören från värmeblocket och pulscentrifugera rören i 5 sekunder så att kondens avlägsnas från locket. 7

9. Tillsätt 100 µl RN i varje prov och kontrollrör med hjälp av en pipettspets med aerosolbarriär. Vortexa i 5 sekunder med halv hastighet. Använd en ny pipettspets med aerosolbarriär för varje prov och kontroll. 10. Flytta de extraherade proverna (patientproverna och kontrollerna) till amplifierings-/detektionsområdet. B. Bereda reagens och ladda K-carrier Utförs i: Pre-amplifiering reagensberedningsområde OBS! Prover och kontroller som extraherats med COBAS TaqMan MTB Master Mix (MTB MMX), Working Master Mix (Working MMX) och Working MMX plus är ljuskänsliga. Skydda dessa reagens mot ljus. OBS! COBAS TaqMan MTB Master Mix (MTB MMX), COBAS TaqMan Mycobacteriuminternkontroll (MYCO IC) och COBAS TaqMan Mycobacterium-magnesiumreagens (MYCO Mg 2+ ) måste ekvilibreras i rumstemperatur i minst 30 minuter innan Working Master Mix bereds. OBS! Bered Working MMX när manuell prov- och kontrollextraktion har slutförts. OBS! Extraherade prover är hållbara i högst 2 timmar i rumstemperatur eller upp till 8 timmar i 2 8 C innan de tillsätts i Working Master Mix. OBS! Working MMX ska förvaras i 2 8 C och användas inom 2 timmar efter beredning. OBS! När extraherade prover och kontroller har tillsatts i Working MMX måste amplifiering påbörjas inom 90 minuter. 1. Ekvilibrera en flaska MTB MMX, en flaska MYCO Mg 2+ och en flaska MYCO IC i rumstemperatur i minst 30 minuter. 2. Placera K-carrier i en K-carrier-hållare. 3. Placera nya K-tubes eller en ny K-tray i K-carrier utan att vidröra sidorna på K-tubes eller K-traybrunnarna. OBS! Om färre än 24 analyser ska köras måste K-tube-brunnspositionerna 1, 2, 5, 20, 23 och 24 beläggas så att rätt balans åstadkoms på K-carriern i termocyklern. 4. Avlägsna korkarna på K-tubes med hjälp av K-tube-öppnaren/-tillslutaren om tillämpligt. Placera korkarna i parkeringspositionshållaren för K-tube. 5. Bered Working MMX på följande sätt: Tillsätt 200 µl MYCO Mg 2+ och 50 µl MYCO IC i en flaska MTB MMX. Förslut röret och blanda väl genom att vända 10 gånger. Vortexa inte Working MMX. Skydda Working Master Mix mot ljus och använd inom 2 timmar. 6. Pipettera 50 µl Working MMX i varje K-tube eller lämplig K-tray-brunn. OBS! Working MMX är mycket ljuskänsligt. Minimera ljusexponeringen för K-tubes eller K-tray som innehåller Working MMX. 7. Tillsätt 50 µl av varje extraherat prov eller extraherad kontroll i lämplig K-tube eller K-tray som innehåller Working MMX med hjälp av en mikropipett med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Blanda försiktigt varje prov eller kontroll genom att pipettera upp och ned tre gånger med mikropipetten utan att bubblor genereras. 8. Upprepa steg 7 för varje extraherat prov och extraherad kontroll tills alla har överförts till K-tubes eller K-trays. Använd en ny spets för varje prov och kontroll. Kontrollera om det förekommer bubblor och avlägsna dem vid behov. Förslut K-tubes/K-trays med hjälp av en K-tubeöppnare/ -tillslutare/k-tray capping tool. Kontrollera att korrekt volymer har tillsatts. 9. Förvara den PCR-färdiga K-carrier mörkt i 15 30 ºC om amplifiering inte påbörjas omedelbart. Amplifieringen ska startas inom 90 minuter efter att de extraherade proverna och kontrollerna har tillsatts i K-tubes eller K-tray som innehåller Working MMX. C. Amplifiering och detektion Utförs i: Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområdet Laddning och drift av analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 1. Slå på datorarbetsstationen och logga in på Windows XP med rätt användar-id och lösenord. 2. Slå på analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 minst 30 minuter innan körningen startas. Kontrollera att instrumentet startar och är klart att användas. Om K-carriers från tidigare körning(ar) finns kvar i någon termocykler ska de tas bort med hjälp av K-carrier-transportören. 8

3. Öppna programmet AMPLILINK på datorn. Logga in med rätt användar-id och lösenord. 4. Om du vill skapa K-carrier-beställningar för de prover som ska analyseras klickar du på ikonen Orders. Välj fliken Sample och klicka sedan på knappen New och ange beställningsnumret för varje prov med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Välj testdefinition för COBAS TaqMan MTB Test. Upprepa för varje prov. Klicka på knappen Save. OBS! Om färre än 24 analyser ska köras måste K-tube-brunnspositionerna 1, 2, 5, 20, 23 och 24 beläggas så att rätt balans åstadkoms på K-carriern i termocyklern. 5. Ange kvalitetskontrollinformation på fliken Quality Control i fönstret Orders. Klicka på knappen New och ange informationen från värdekortet till COBAS TaqMan MTB Test som medföljer kitet med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Ange lotnumret för COBAS TaqMan MTB Test, utgångsdatum, intervall för Low (+) Control samt kalibreringskoefficienter i angivna fält. Klicka på OK. 6. Tilldela körningen ett K-carrier-nummer genom att klicka på fliken K-Carrier i fönstret Orders. Klicka på New i fönstret K-Carrier. Skriv in K-carrier-numret från streckkoden på K-carrier eller K-tray i rutan till höger om K-Carrier ID med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Välj testdefinition för COBAS TaqMan MTB Test från testpanelen i fönstrets nedre del. 7. Välj den första raden i kolumnen Type (T) i Worklist. Markera fältet så att du får åtkomst till rullistan och välj sedan önskad kontrolltyp. Dubbelklicka därefter i fältet för prov-id på samma rad; fönstret LookUp Control visas med alla tillgängliga kontroller. När kontrollen väljs visas motsvarande kalibrerings- och kontrollvärden längst ned till höger i informationspanelen. Upprepa för alla kontroller som önskas. 8. Om du vill lägga till prover i Worklist dubbelklickar du på den första positionen (raden) för inmatning av prov. Fönstret Lookup Sample visas, som innehåller de tilldelade provbeställningarna; om du vill markera fler än ett beställningsnummer använder du skift- och piltangenterna. Bekräfta att alla beställningar har tilldelats testdefinitionen för COBAS TaqMan MTB Test. 9. Spara K-carrier-beställningstilldelningen genom att klicka på Save. 10. Välj ikonen Systems på fliken System; öppna termocyklern genom att klicka på Open. När termocyklerskyddet har öppnats helt och Ready to Load visas i fönstret Systems, lyfter du termocyklerlocket och håller det öppet. Flytta den laddade K-carriern som innehåller förslutna K-tubes med Working Master Mix och prover och kontroller till termocyklern med hjälp av K-carriertransportören. Stäng termocyklerlocket. 11. Klicka på Start i fönstret Systems nedanför TC-ikonen så stängs termocyklerskyddet och körningen startas. 12. Amplifiering och detektion utförs automatiskt i analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. RESULTAT Resultatberäkning Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 bestämmer automatiskt om MTB-DNA detekteras eller inte för provet eller kontrollen. Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48: Bestämmer cykeltröskelvärdet (Ct) för MTB-DNA och Mycobacterium-IC-DNA. Bestämmer om MTB DNA detekteras baserat på Ct-värdena för MTB-DNA och MYCO IC-DNA. Bestämmer om MTB (+) C och MYCO ( ) C är giltiga. Validering Försäkra dig om att körningen är giltig genom att kontrollera om det förekommer flaggor eller kommentarer i utskriften eller i resultatfönstret i AMPLILINK. Körningen är giltig om inga flaggor visas för COBAS TaqMan MTB-kontroller. Följande resultat erhålls vid en giltig körning: Kontroll Resultat Betydelse Negativ kontroll Target Not Detected Kontrollen innanför intervallet Positiv kontroll 1 Positive Kontrollen innanför intervallet 9

Körningen är inte giltig om någon av följande flaggor visas för COBAS TaqMan MTB-kontrollerna: MYCO negativ kontroll: Flagga Resultat Betydelse _N_NC_INVALID Invalid Smitta eller ingen IC-signal MTB positiv kontroll: Flagga Resultat Betydelse _L_LPC_INVALID Invalid Kontrollen utanför intervallet, ingen målsignal eller ingen IC-signal OBS! MTB PC kallas lågpositiv kontroll (LPC) Om körningen är ogiltig måste du upprepa hela körningen, dvs. prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion. Tolkning av resultat: Ta reda på om körningen är giltig genom att kontrollera varje enskilt prov avseende flaggor eller kommentarer på resultatutskriften. Tolka resultaten så här: En giltig körning kan innehålla båda giltiga och ogiltiga provresultat, beroende på om flaggor och/eller kommentarer erhålls för de enskilda proverna. Provresultaten tolkas på följande sätt: Flagga Resultat Betydelse M. tuberculosis DNA detekterades inte. Provet antas vara Ingen flagga Target Not negativt för M. tuberculosis. Ett negativt resultat utesluter inte Detected M. tuberculosis-infektion eftersom resultaten är beroende av rätt provtagning, avsaknad av hämmare och tillräckligt med DNA. Ingen flagga 1 Positive M. tuberculosis-dna detekterades. Provet är positivt för M. tuberculosis. _Q_RFITOOLOW > 1 Positive M. tuberculosis-dna detekterades. Provet är positivt för eller M. tuberculosis. Ingen flagga Hämmare. Om M. tuberculosis-dna förekommer, är det inte påvisbart. Extrahera en ny portion av det ursprungliga _Q_QS_INVALID Invalid provet och upprepa testet. Hämmare är ofta labilaoch prover som initialt är hämmare är kanske inte hämmare när de upprepas. Om det ursprungliga provet inte finns tillgängligt måste ett nytt prov tas. Obs! Programmet AMPLILINK flaggar internkontrollfel (IC) som en ogiltig QS (_Q_QS_INVALID). 10

KVALITETSKONTROLL Ett replikat av MYCO ( )-kontroll och MTB (+)-kontroll måste finnas med i varje testkörning. Liksom för alla nya laboratorieförfaranden bör nya användare överväga att använda ytterligare kontroller varje gång testet utförs tills man har fått tillräcklig erfarenhet av testet. Det finns inga krav avseende kontrollernas position i K-carriern. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att körningen är giltig. Negativ kontroll MYCO ( ) C måste ge ett Target Not Detected -resultat, dvs. Ct-värdet för MTB-DNA låg ovanför gränsen för analysen eller inget Ct-värde för MTB-DNA erhölls, men ett giltigt Ct-värde erhölls för Mycobacteriuminternkontroll-DNA. Om MYCO ( ) C inte uppfyller detta kriterium är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Om MYCO ( ) C är konsekvent ogiltig ska du kontakta din Roche-representant och begära teknisk hjälp. Positiv kontroll Det tilldelade intervallet för MTB (+) C anges på värdekortet till COBAS TaqMan MTB Test. Resultatet för MTB (+) C måste ligga inom det intervall som anges på värdekortet till COBAS TaqMan MTB Test för att körningen ska vara giltig. Det korrekta resultatet visas som 1 Positive. Om den positiva kontrollen inte uppfyller detta kriterium är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om resultatet för den positiva kontrollen konsekvent ligger utanför det tilldelade intervallet. MTB (+)-kontrollen innehåller ca 20 kopior/test av en M. tuberculosis plasmid-dna-sekvens. Det är ungefär fyra gånger analysens minsta detektionsnivå fastställd genom Poisson-analys. Amplifiering och detektion av MTB (+)-kontrollen säkerställer att amplifiering skett. MTB (+)-kontrollen övervakar inte testets amplifieringseffektivitet eller detektionsnivå. Internkontroll Internkontrollen är avsedd att identifiera prover som innehåller polymerashämmare. Användning av internkontrollen utesluter inte alla falskt negativa testresultat. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratorieteknik för att denna analys ska fungera korrekt. Med hänsyn till testets höga analytiska sensitivitet är stor noggrannhet nödvändig så att kitets reagens- eller amplifieringsblandningar hålls rena. Renheten ska övervakas noga för alla reagens. Kassera reagenset i tveksamma fall. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Detta test har endast validerats för användning med upphostade och framkallade slem- och BALprover som har kondenserats, dekontaminerats och koncentrerats med hjälp av NALC-NaOH. Testning av andra provtyper kan ge falskt negativa eller falskt positiva resultat. 2. Detektion av M. tuberculosis är beroende av antalet organismer i provet och kan påverkas av provtagningsmetoder, patientfaktorer (t.ex. ålder, förekomst av symptom), och/eller infektionsstadium med M. tuberculosis. 3. Falskt negativa resultat kan uppstå på grund av polymerashämmare. Mycobacterium-internkontrollen har lagts till i COBAS TaqMan MTB Test för att möjliggöra identifiering av extraherade prover som innehåller ämnen som kan påverka PCR-amplifieringen med mer än 20 kopior/test. 4. Falskt negativa resultat kan uppstå i närvaro av andra arter av högtiter-mycobacterium än M. tuberculosis (MTB)-komplexet, om MTB är närvarande vid en lägre titer än den interfererande Mycobacterium-arten. 5. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och extraktion av prover. Variabler som beror på förvaring har inte helt definierats. 6. Tillsats av AmpErase-enzym i Master Mix möjliggör selektiv amplifiering av target-dna. Kontaminering av reagens kan dock endast undvikas om god laboratoriesed tillämpas och de förfaranden som beskrivs i den här bipacksedeln noga följs. 7. Huruvida läkemedelsbehandling lyckas eller ej kan inte avgöras med detta test. 8. Liksom för alla diagnostiska test ska resultaten från COBAS TaqMan MTB Test tolkas med hänsyn till alla kliniska fynd och laboratoriefynd. 9. Endast personer med erfarenhet av PCR-teknik bör använda produkten. 10. COBAS TaqMan MTB Test ger kvalitativa resultat. Det finns inget samband mellan hur högt ett positivt elbow-värde är med COBAS TaqMan MTB Test och antalet M. tuberculosis-celler i ett infekterat prov. 11

11. Den här produkten kan endast användas tillsammans med analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. 12. Närvaron av PCR-hämmare kan orsaka falskt negativa eller ogiltiga resultat. 13. Mutationer inom de maximalt konserverade regionerna på det bakteriegenom som täcks av testets primers och/eller prob är visserligen sällsynta, men kan göra att bakterierna inte kan detekteras. 14. På grund av inneboende skillnader mellan metoder rekommenderas användaren, innan en metod byts ut mot en annan, att genomföra metodkorrelationsanalyser i laboratoriet för att bestämma skillnaderna mellan metoderna. ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING Analytisk specificitet Den analytiska specificiteten för COBAS TaqMan MTB Test utvärderades genom testning av följande bakterier, virus och svamp, varav många är normal flora eller patogener som är vanliga för andningsorganen. Ingen av följande organismer visade reaktivitet i COBAS TaqMan MTB Test: Mykobakteriella arter Mycobacterium abscessus Mycobacterium neoaurum Mycobacterium asiaticum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium avium Mycobacterium phlei Mycobacterium chelonae Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium chitae Mycobacterium senegalens Mycobacterium fallax Mycobacterium shimoidei Mycobacterium flavescens Mycobacterium simiae Mycobacterium fortuitum Mycobacterium smegmatis Mycobacterium gastri Mycobacterium sphagni Mycobacterium gordonae Mycobacterium szulgai Mycobacterium intracellulare Mycobacterium terriae Mycobacterium kansasii Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium komassense Mycobacterium triviale Mycobacterium malmoense Mycobacterium vaccae Mycobacterium marinum Mycobacterium xenopi Icke-mykobakteriella arter Acinetobacter calcoaceticus Corynebacterium xerosis Actinomadura madurae Cryptococcus neoformans Actinomyces pyogenes Deinococcus radiodurans Actinoplanes italicus Dermatophilus congolensis Aeromonas hydrophila Derxia gummosa Arthrobacter oxydans Eikenella corrodens Bacillus subtilis Enterobacter aerogenes Bacteriodes fragilis Enterobacter cloacae Blastomyces dermatitidis Enterococcus faecalis Bordetella parapertussis Enterococcus faecium Bordetella pertussis Escherichia coli Branhamella (Moraxella) catarrhalis Fusobacterium nucleatum Brevibacterium linens Gordona sputi Campylobacter jejuni Haemophilus influenzae Candida albicans Herpes simplex-virus typ 1 Chlamydia trachomatis Histoplasma capsulatum Chromobacterium violaceum Humant adenovirus Citrobacter freundii Humant cytomegalovirus Clostridium perfringens Humant enterovirus Coccidioides immitis Humant rhinovirus 14 Corynebacterium aquaticum Influenza-virus B Corynebacterium diphtheriae Klebsiella pneumoniae Corynebacterium flavescens Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Corynebacterium glutamicum Lactobacillus casei Corynebacterium jeikeium Legionella micdadei Corynebacterium minutissimum Legionella pneumophila Corynebacterium pseudodiphtheriticum Mycoplasma hominis Corynebacterium pseudotuberculosis Mycoplasma pneumoniae Corynebacterium renale Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium striatum Neisseria lactamica 12

Neisseria meningitidis Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia farcinica (W5218) Nocardia nova (W5194) Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensi Oerskovia turbata Parainfluensa 2-virus Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Respiratoriskt syncytialvirus Rhodococcus aichiensis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonellacholeraesus subsp Choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseinus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica Analytisk sensitivitet: M. tuberculosis-celler Detektionsgränsen för COBAS TaqMan MTB Test fastställdes genom att bestämma det minsta antalet M. tuberculosis-kolonibildande enheter (CFU) som reproducerbart kan detekteras ( 95 % positiva resultat) med COBAS TaqMan MTB Test. En dekontaminerad odling av MTB späddes i ett NALC/NaOHkondenserat negativt slemprov för att åstadkomma en panel med 7 nivåer innehållande 10, 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 och 0 MTB CFU/PCR. Panelen bereddes oberoende varje dag i tre dagar. Femtiofyra replikat av varje panel testades med hjälp av tre COBAS TaqMan MTB Test-reagensloter. Resultat från probitanalys (tabell 1) indikerar att detektionsgränsen för COBAS TaqMan MTB Test är 0,46 CFU/PCR eller omkring 18 CFU/ml i slemprover. Prov Tabell 1 Detektionsgräns för COBAS TaqMan MTB Test med M. tuberculosis-celler Nominell input CFU/PCR Antal ogiltiga Antal giltiga Antal pos. Antal försök Träffar i % 95 % CI 1 10 0 54 54 54 100,0 % 94,6 100 % 2 5 0 54 54 54 100,0 % 94,6 100 % 3 1 0 54 54 54 100,0 % 94,6 100 % 4 0,5 0 54 51 54 94,4 % 84,6 98,8 % 5 0,25 0 54 46 54 85,2 % 72,9 93,4 % 6 0,1 0 54 33 54 61,1 % 46,9 74,0 % 7 0 0 54 0 54 0,0 % 0,0 5,4 % 95-procentig detektionsgräns genom PROBIT = 0,46 CFU/PCR 95-procentigt konfidensintervall = 0,33 0,83 CFU/PCR Inklusivitet COBAS TaqMan MTB Test utvärderades med alla arter av Mycobacteria som upptäcktes i MTB-komplexet (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, och M. africanum). Kvantifierade genomiska DNA-extraktioner (10 kopior/pcr) och bakteriella odlingar undersöktes. Vid input-nivån 10 genomiska kopior/pcr identifierades alla 4 arterna i MTB-komplexet som positiva. Dessutom analyserades 169 odlingar av MTB-komplexarter (M. tuberculosis = 159, M. bovis = 6, M. microti = 3, och M. africanum = 1) med COBAS TaqMan MTB Test. En odling av M. microti och en odling av M. tuberculosis testades negativt, vilket ger en total inklusivitetskvot på 99 %. 13

Reproducerbarhet COBAS TaqMan MTB Test utvärderades för reproducerbarhet genom analys av resultat från dag-till-dag, lot-till-lot och användare-till-användare. Dag-till-dag-studien (tabell 2) utfördes av en användare med en COBAS TaqMan MTB Test-reagenslot i 15 dagar med hjälp av MYCO negativ kontroll (NC), MTB positiv kontroll (PC) och MTB positiv kontroll spädd med negativ kontroll (1/2 PC). Lot-till-lot-studien (tabell 3) utfördes av en användare under en dag med tre COBAS TaqMan MTB Test-reagens med hjälp av MYCO negativ kontroll (NC), MTB positiv kontroll (PC) och MTB positiv kontroll spädd med negativ kontroll (1/4 PC och 1/2 PC). Användare-till-användare-studien (tabell 4) utfördes av tre användare under tre dagar med en COBAS TaqMan MTB Test-reagenslot med hjälp av MYCO negativ kontroll (NC), MTB positiv kontroll (PC) och MTB positiv kontroll spädd med negativ kontroll (1/2 PC). De 720 resultaten från de tre studierna sammanfattas i tabellerna 2 4. Negativa resultat erhölls med 100 % av de 132 NC-replikat som testades. Alla 588 positiva replikat, varierande mellan 20 och 5 kopior av MTB target/pcr, testades positivt. I alla tre studierna var CV i % 2,4 eller mindre, vilket påvisar god reproducerbarhet för kvalitativa resultat med testet. Tabell 2 Reproducerbarhetsresultat, dag-till-dag för COBAS TaqMan MTB Test MTB target NC (0 k/pcr) PC (~20 k/pcr) 1/2 PC (~10 k/pcr) Totalt antal giltiga replikat 60 60 60 Positiva resultat i % 0 % 100 % 100 % Genomsnittlig MTB-elbow N/A 39,4 41,1 Minsta värde N/A 38,3 39,9 Högsta värde N/A 40,8 42,8 Standardavvikelse N/A 0,5 0,7 Variationskoefficient N/A 1,3 % 1,7 % Tabell 3 Reproducerbarhetsresultat, lot-till-lot för COBAS TaqMan MTB Test MTB target NC (0 k/pcr) PC (~20 k/pcr) 1/2 PC (~10 k/pcr) 1/4 PC (~5 k/pcr) Totalt antal giltiga replikat 36 36 36 324 Positiva resultat i % 0 % 100 % 100 % 100 % Genomsnittlig MTB-elbow N/A 39,6 40,7 41,6 Minsta värde N/A 38,5 39,1 39,5 Högsta värde N/A 41,3 42,3 48,0 Standardavvikelse N/A 0,8 0,7 1,0 Variationskoefficient N/A 1,9 % 1,7 % 2,4 % 14

Tabell 4 Reproducerbarhetsresultat, användare-till-användare för COBAS TaqMan MTB Test MTB target NC (0 k/pcr) PC (~20 k/pcr) 1/2 PC (~10 k/pcr) Totalt antal giltiga replikat 36 36 36 Positiva resultat i % 0 % 100 % 100 % Genomsnittlig MTB-elbow N/A 39,6 40,8 Minsta värde N/A 38,4 39,2 Högsta värde N/A 41,5 42,6 Standardavvikelse N/A 0,8 0,8 Variationskoefficient N/A 1,9 % 2,0 % Korrelation En korrelationsanalys utfördes för att jämföra egenskaperna hos COBAS TaqMan MTB Test med dem hos COBAS AMPLICOR MTB Test. Totalt 769 slemprover och 186 BAL-prover (bronchial alveolar lavage) analyserades i studien. Prover erhölls antingen från frysta arkiv eller från nytagna frysta rester. Tre unika COBAS TaqMan MTB Test-reagensloter användes i analysen. Den positiva korrelationskvoten för slemprover (tabell 5) var 96,2 % och den negativa korrelationskvoten var 99,1 %, vilket resulterar i en total överensstämmelse på 98,3 % för slemprover mellan COBAS TaqMan MTB Test och COBAS AMPLICOR MTB Test. Den positiva korrelationskvoten för BAL-prover (tabell 6) var 97,1 % och den negativa korrelationskvoten var 99,3 %, vilket resulterar i en total överensstämmelse på 98,9 % för BAL-prover mellan COBAS TaqMan MTB Test och COBAS AMPLICOR MTB Test. Tabell 5 Korrelation mellan COBAS TaqMan MTB Test och COBAS AMPLICOR MTB Test Totalt resultat för slemprover Slemprovsresultat N = 769 COBAS TaqMan MTB Test COBAS AMPLICOR MTB Test + Totalt + 207 5 212 8 549 557 Totalt 215 554 769 Överensstämmelse för positiv procentandel Överensstämmelse för negativ procentandel Total överensstämmelse Kvot Överensstämmelse i % 95-procentigt konfidensintervall 207/215 96,2 % 92,8 98,4 549/554 99,1 % 97,9 99,7 756/769 98,3 % 97,1 99,1 15

Tabell 6 Korrelation mellan COBAS TaqMan MTB Test och COBAS AMPLICOR MTB Test Totalt resultat för BAL-prover BAL-provresultat N = 186 COBAS TaqMan MTB Test COBAS AMPLICOR MTB Test + Totalt + 34 1 35 1 150 151 Totalt 35 151 186 Överensstämmelse för positiv procentandel Överensstämmelse för negativ procentandel Total överensstämmelse Kvot Överensstämmelse i % 95-procentigt konfidensintervall 34/35 97,1 % 85,1 99,9 150/151 99,3 % 96,4 99,9 184/186 98,9 % 98,9 99,9 Systemfel Systemfelskvoten fastställdes för COBAS TaqMan MTB Test genom att undersöka procentandelen positiva resultat med 100 replikat av negativt slemprov spikat med MTB-odling till en slutlig koncentration på 60 CFU/ml eller ~ 3 gånger testets detektionsgräns (se avsnittet om detektionsgräns ovan). Positiva resultat erhölls för 99 av de 100 replikaten, vilket ger en systemfelskvot på 1,0 % och en kvot för lyckade resultat på 99 % för COBAS TaqMan MTB Test. Interferens COBAS TaqMan MTB Test utvärderades för endogen hemoglobininterferens genom att testa negativt slemprov spikat med MTB positiv kontroll (25 kopior/pcr) och hemoglobin från 0,52 till 5,2 mg/ml. Ingen interferens uppvisades med COBAS TaqMan MTB Test på någon nivå med spikat hemoglobin. COBAS TaqMan MTB Test utvärderades för interferens genom sex vanligt förekommande läkemedel mot tuberculosis. De sex läkemedlen (tabell 7) testades vid 1 x C Max och 3 x C Max genom att spika läkemedel i det negativa slemprovet innehållande MTB positiv kontroll-plasmid (~17 kopior/pcr). Egenskaperna hos COBAS TaqMan MTB Test påverkades inte då något av de sex läkemedlen spikades vid både 1 x C Max och 3 x C Max - nivåer. Tabell 7 Läkemedel mot tuberculosis och C Max -nivåer Läkemedel Kemiskt namn Förkortning C Max (µg/ml) Isoniazid Isonikotinsyrehydrazid INH 5 7 Etambutol Etambutolklorid ETH 1,7 Rifampicin Rifadin-rimaktan RIF 7,99 Pyrazinamid Pyrazin-karboxamid PZA 30 35 Kanamycin Kanamycin-monosulfat KM 2,0 Streptomycin Streptomycin-sulfatsalt SM 25 30 Inhibition Inhibitionshastigheten (ogiltig internkontroll) för COBAS TaqMan MTB Test fastställdes genom analys av flera studier med slem- och BAL-prover samt MTB-odlingspanelmaterial, totalt 1 094 datapunkter. Den totala inhibitionshastigheten för COBAS TaqMan MTB Test för alla studier som analyserades (prover och MTBodlingspanelmaterial) var 0,0 % (0/1094). 16

REFERENSER 1. World Health Organization Fact Sheet Nº 104 Revised April 2005. 2. Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a Renewed Commitment Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999. (RR09): 1-13. 3. Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp. 339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Bloom, B.R. and Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a re-emergent killer. Science 257:1055-1063. 5. Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143-152. 6. Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282. 7. Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213. 8. CDC. Nucleic Acid Amplification tests for Tuberculosis. MMWR 2000:49. 9. Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid, other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology 34:834-841. 10. Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 32:393-397. 11. Bergmann, J.S., Keating W.E., Woods G.L. 2000. Clinical evaluation of the BDProbeTec ET system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 38:863-865. 12. Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389. 13. J. C. Palomino. 2005. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. European Respiratory Journal 26:339-350. 14. Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell plate hybridization method (AMPLICOR Mycobacterium) for direct detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133. 15. Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350-1354. 16. Mullis, K. B. and F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335-350. 17. Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, GA. 18. Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rrna. Journal of Clinical Microbiology 28:1751-1759. 19. Longo, M. C., M. S. Berninger, and J. L. Hartley. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 93:125-128. 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 21. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 22. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 17