ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay

Transkript

1 ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay Svenska /1 USA-patentnr. 5,27,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,63; 5,928,869; 5,958,7; 6,54,279; 6,9,552; 6,117,635; 6,316,2; 6,656,68; 6,682,889; 6,743,582. AVSEDD ANVÄNDNING BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay, för användning med BD ProbeTec ET System, nyttjar Strand Displacement Amplification (SDA) teknologi för direkt kvalitativ detektion av DNA från organismer tillhörande familjen Chlamydiaceae (inkluderande, men ej begränsat till Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci). Denna analys är avsedd för användning vid test av svalgprov (med och utan transportmedium) från patienter med kliniska tecken och symptom samt andra diagnostiska belägg för pneumoni. Denna analys kan användas som ett hjälpmedel vid den förmodade diagnosen av klamydia-associerad pneumoni. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Chlamydophila pneumoniae orsakar ungefär 5-15 % av fall med samhällsförvärvad lunginflammation (communityacquired pneumonia, CAP). 1 Den enda kända reservoaren är människa. Överföring från person till person via luftvägssekret och närkontakt är i allmänhet nödvändig 2 med en inkubationstid på flera veckor. Majoriteten av fall med C. pneumoniae-orsakad pneumoni är relativt beskedliga och mortaliteten är låg. Emellertid är återinsjuknande vanligt och uppträder hos äldre patienter som behöver sjukhusvård. Odlingsmetoder för C. pneumoniae är långsamma och mycket svåra att utföra, och används därför inte rutinmässigt för diagnosticering. Likväl är odlingsmetoder viktiga för att dokumentera organismens viabilitet och för att få prov för undersökning av resistens. Mikroimmunofluorescence (MIF)-test för IgM- och IgG-antikroppar är den vanligaste serologiska metoden som används för diagnosticering och tillåter distinktion mellan primär infektion och reinfektion. Akutinfektion definieras av en fyrfaldig stegring av IgG-titern mellan akut- och konvalescentserum eller en IgM-titer 16. En IgG-titer 16 antyder tidigare exponering. 3 Det avrådes från att använda en enstaka förhöjd IgG-titer för diagnos. Därför är serologisk diagnosticering endast användbar som ett retrospektivt epidemilogiskt redskap snarare än för behandling av patient. Vikten av att ställa en säker pneumonidiagnos inklusive dess etiologi, har ökat i takt med den ökande oron för överanvändning av antibiotika. Snabba diagnostiska tekniker som använder sig av nukleinsyreamplifikation kan vara av nytta i diagnosticeringen och följaktligen tillåta lämplig riktad behandling vid rätt tidpunkt. PRINCIPER FÖR METODEN BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF)-diagnostik med DNA-amplifiering bygger på simultan amplifiering och detektion av det sökta DNA, med hjälp av amplifieringsprimers och en fluorescensmärkt detektorprob. SDA-reagenserna är torkade i två separata mikrobrunnar för engångsbruk. Det preparerade provet tillsätts till primningsmikrobrunnen som innehåller primers för amplifiering, den fluorescensmärkta detektorproben samt övriga reagenser som krävs för amplifiering. Primers är avsedda för att amplifiera en konserverad RNAse P-gen med 63 baspar tillhörande medlemmar av Chlamydiaceae-familjen, inkluderande Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis och Chlamydophila psittaci. Efter inkubering överförs reaktionsblandningen till amplifieringsmikrobrunnen, vilken innehåller två enzymer (ett DNA-polymeras och ett restriktionsendonukleas) som krävs för SDA. Amplifieringsmikrobrunnarna förseglas för att förhindra kontaminering och inkuberas därefter i en temperaturkontrollerad fluorescensavläsare som övervakar varje reaktion för generering av amplifieringsprodukter. I varje reaktion co-amplifieras och detekteras en intern amplifieringskontroll (IAC, Internal Amplification Control), vars syfte är att verifiera att korrekta förhållanden föreligger för amplifiering och minska risken för rapportering av ett falskt negativt resultat på grund av förekomst av analysinhibitorer. Närvaro eller frånvaro av DNA från Chlamydiaceae-familjen fastställs genom att beräkna PAT-poängen (PAT="Passes After Threshold") för provet ifråga, på grundval av förbestämda tröskelvärden. Instrumentet rapporterar automatiskt resultaten såsom positiva, negativa eller ej bestämbara. REAGENSER OCH MATERIAL Varje BD ProbeTec ET Chlamydiaeceae-familjen (CF) Amplified DNA Assay-reagensförpackning innehåller: Primningsmikrobrunnar för Chlamydiacea- familjen (CF), (1x24) 6 Oligonukleotider 7,5 pmol; dntp 15,2 nmol; 2 detektorprober 22,5 pmol, Syntetisk oligonukleotid 75 kopior Amplifieringsmikrobrunnar för Chlamydiaceae-familjen (CF), (1x24) Restriktionsenzym: 33 enheter; DNA-polymeras 14 enheter 1 primningslock; 16 amplifieringsförseglingar (1/2); 8 avfallspåsar BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP*/MP**): Innehåll: Diluent för luftvägsprover och medier: Bicine, kaliumfosfat, kaliumhydroxid, DMSO och Proclin; 1 (CF/LP/MP) positiva kontroller: 15 ng laxsperma-dna, 47,3 µg Tris, 9, µg EDTA, 36 kopior CF-Plasmid, 48 kopior LP-Plasmid, 54 kopior MP-Plasmid; 1 (CF/LP/MP) negativa kontroller: 15 ng laxsperma-dna, 47,3 µg Tris, 9, µg EDTA; 1 2-mL rör med snäpplock * Hänvisar till BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP)-analys med DNA-amplifiering ** Hänvisar till BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP)-analys med DNA-amplifiering BD ProbeTec ET diluent för pinnprov och kontrollkit (tcf/tmp)*: Innehåll: Diluent för pinnprov: Bicine, kaliumfosfat, kaliumhydroxid, DMSO och Proclin; 1 (tcf/tmp) positiva kontroller: 175 ng laxsperma-dna, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6 kopior CF-Plasmid, 8 kopior LP-Plasmid, 9 kopior MP-Plasmid; 1 (tcf/tmp) negativa kontroller: 175 ng laxsperma-dna, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * Beteckningen "t" hänvisar till reagens som endast är avsedda för användning med pinnprov för svalg (utan transportmedium). Instrument, utrustning och material: BD ProbeTec ET instrument och instrumentplatta, BD ProbeTec ET lyseringsvärmare, BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare, BD ProbeTec ET lyseringsställ, BD ProbeTec ET pipett, stativ och strömförsörjning, BD ProbeTec ET tillbehörssats, BD ProbeTec ET 2 ml och 4 ml provrör och lock, BD ProbeTec ET pipettspetsar.

2 Material som krävs men ej medföljer: Klass II biologiskt säkerhetsskåp, vortexblandare, frys med fast temperatur -2 C och/eller -7 C (eller kallare), mikrocentrifug 16 x g, vattenbad, digital termometer, vattenbadsställ med skruvlock, ställ för 2 ml provrör, andra lämpliga provrörsställ, BBL CultureSwab EZ provtagningspinnar, engångshandskar, mikropipetter för dispensering av volymer på 2-1 µl, proppade pipettspetsar, destillerat vatten, graderat molekylärbiologiskt vatten, 1 % (vikt/vol) natriumhypoklorit med Alconox.* * Lös 7,5 g Alconox i 1 L 1 % (vol/vol) natriumhypokloritlösning och blanda. Gör i ordning en färsk blandning dagligen. Förvaring och hantering: BD ProbeTec ET CF reagensförpackningar kan förvaras vid 2-33 C. Oöppnade reagensförpackningar får ej användas efter utgångsdatum. Efter att påsen öppnats är mikrobrunnarna hållbara i 12 veckor, förutsatt att påsen är ordentligt återförsluten, eller fram till utgångsdatum, beroende på vilket som inträffar först. Får ej frysas. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) kan förvaras vid 2-33 C. Reagenserna får ej användas efter utgångsdatum. Får ej frysas. BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp) kan förvaras vid 2-33 C. Reagenserna får ej användas efter utgångsdatum. Får ej frysas. Varningar och försiktighetsbeaktanden Avsedda för in vitro-diagnostik. 1. Patogena mikroorganismer, inklusive hepatitvirus och humant immunbristvirus, kan finnas närvarande i kliniska prover. "Allmänna försiktighetsbeaktanden" 4-7 och institutionens riktlinjer bör följas vid hantering av alla föremål som kontaminerats med blod eller andra kroppsvätskor. 2. BD ProbeTec ET spädningsvätskor för pinnprov, luftvägar och medier innehåller dimetylsulfoxid (DMSO). DMSO är farligt vid inandning, hudkontakt och förtäring. Undvik kontakt med ögonen och använd alltid handskar vid hantering. Vid kontakt med ögonen, skölj omedelbart med rikligt med vatten och kontakta läkare. Vid kontakt med huden skall området omedelbart tvättas av med rikligt med vatten. 3. Även om särskilt avdelade arbetsområden inte behövs eftersom BD ProbeTec ET-systemets design reducerar risken för kontaminering med amplifieringsprodukter i testområdet, krävs dock andra försiktighetsåtgärder för att förhindra kontaminering, i synnerhet kontaminering av prover under preparering. 4. Reagenspåsarna med oanvända primningsmikrobrunnar och amplifieringsmikrobrunnar MÅSTE återförslutas noggrant efter att de öppnats. Kontrollera att desickanten finns med innan reagenspåsarna försluts. 5. Plattan med amplifieringsmikrobrunnar MÅSTE förseglas ordentligt med hjälp av amplifieringsförseglingen innan plattan flyttas från BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare till BD ProbeTec ET-instrumentet. Förseglingen säkerställer en sluten reaktion för amplifiering och detektion och är nödvändig för att undvika att instrumentet och arbetsområdet kontamineras med amplifieringsprodukter. Förseglingsmaterialet får ej avlägsnas från mikrobrunnarna vid något tillfälle. 6. Restvätska i primningsmikrobrunnarna (efter överföring av vätska från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna) utgör en källa till kontaminering av provet. Försegla primningsmikrobrunnarna noga med en plattförsegling innan de bortskaffas. 7. För att förhindra att arbetsområdet kontamineras med amplifieringsprodukter skall avfallspåsarna som medföljer i reagensförpackningarna användas för bortskaffning av använda amplifieringsmikrobrunnar. Kontrollera att påsarna är ordentligt förslutna innan de bortskaffas. 8. BYT HANDSKAR vid specificerade steg under preparering och analys av prover, så att kontaminering av proverna undviks. Om handskarna kommer i kontakt med prover skall de omedelbart bytas så att kontaminering av andra prover undviks. 9. I händelse av att arbetsområdet eller utrustningen kontamineras av prover eller kontroller skall det kontaminerade området omsorgsfullt rengöras med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox och sköljas noga med vatten. Låt ytorna torka fullständigt innan du fortsätter med testningen. 1. Använd endast BD ProbeTec ET pipetten och BD ProbeTec ET pipettspetsar för överföring av preparerade prover till primningsmikrobrunnarna och för överföring av prover från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna. 11. Iakttag vedertagna laboratorieförfaranden vid bortskaffning av använda pipettspetsar, provrör, primningsmikrobrunnar samt annat engångsmaterial. Engångsmaterial skall bortskaffas med omsorg. Försegla och bortskaffa avfallsbehållarna när de är till ¾ fulla eller dagligen (beroende på vad som inträffar först). 12. Byt inte ut och blanda inte mikrobrunnar, kontroller eller prepareringsreagenser från satser med olika partinummer. 13. Kontakta Teknisk service om det händer något ovanligt, såsom spill i BD ProbeTec ET-instrumentet eller DNAkontamination som inte kan åtgärdas med hjälp av rengöring. PROVTAGNING OCH TRANSPORT 1. Provtagning Alla prover skall tas enligt rekommendationerna i Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 eller enligt föreskrifterna i laboratoriets metodbok. BBL CultureSwab EZ (BD cat. # 22144) bör användas för provtangning av pinnprov från svalg som förvaras utan transportmedium. 2. Transport och förvaring av prover Pinnprov från svalg (utan transportmedium): Proverna kan förvaras/transporteras vid C i högst 2 dagar. Proverna kan förvaras i kylskåp vid 2-8 C i högst 3 dagar. Proverna kan förvaras vid -2 C eller lägre temperatur i högst 14 veckor. Pinnprov från svalg i 2SP-medium: 8 Prover bör omedelbart ställas i kylskåp vid 2-8 C. Transportera på is eller med kylpåsar om transporttiden överstiger några minut. Proverna kan förvaras i kylskåp vid 2-8 C i högst 2 dagar. Prover som behöver lagras längre perioder bör förvaras vid -7 C. TESTFÖRFARANDE Se användarhandboken till BD ProbeTec ET-systemet för specifik information om användning och underhåll av systemets komponenter. 2

3 A. Förberedelse av instrumentet: 1. Instrumenten måste slås på och värmas upp innan analysen kan påbörjas. a. Uppvärmning och stabilisering av lyserings-, primnings- och förvärmaren tar cirka 9 min. Inställd temperatur för lyseringsvärmaren är 114 C. Inställd temperatur för primningsdelen i primnings- och förvärmaren är 72,5 C. Inställd temperatur för förvärmningsdelen i primnings- och förvärmaren är 54 C. b. BD ProbeTec ET-instrumentet styrs av programvaran och tar cirka 3 min. att värma upp. 2. Värmarnas temperaturer måste kontrolleras innan analysen påbörjas. Anteckna temperaturerna i underhållsloggen för BD ProbeTec ET-systemet. a. Lyseringsvärmare Ta av plastskyddet och låt temperaturen utjämnas i 15 min. Termometern skall visa ett värde inom C. b. Primnings- och förvärmaren Termometern för värmarens primningsdel skall visa ett värde inom C. Termometern för värmarens förvärmardel skall visa ett värde inom 53,5-54,5 C. 3. Kontrollera temperaturen som visas på BD ProbeTec ET-skärmen. Temperaturen skall visa ett värde mellan 47,5-55, C. Anteckna temperaturerna i underhållsloggen för BD ProbeTec ET-systemet. B. PIPETT: Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för utförlig information om funktionerna hos knappsatsen till BD ProbeTec ET pipett. BD ProbeTec ET pipett skall också rengöras efter varje användning. Se närmaste teknisk service-representant för anvisningar om korrekt rengöring och underhåll av BD ProbeTec ET pipett. Följande program krävs för att utföra BD ProbeTec ET CF-analysen: Program 1 ombesörjer överföring av vätska från de preparerade proverna till CF-primningsmikrobrunnarna. Program 5 ombesörjer överföring av vätska från CF-primningsmikrobrunnarna till CF-amplifieringsmikrobrunnarna. Utför nedanstående steg för att programmera pipetten: Program 1: 1. Slå PÅ pipetten. Pipetten avger ett pip, visar "ZERO" följt av programversion, varefter ytterligare ett pip avges. 2. Tryck på den blå "Prog" (program)-knappen. Tryck på knappen "Vol" (volym) tills "1" visas, för att välja Program 1. Tryck på "Enter". 3. Tryck och håll på knappen "Prog" för att komma in i programmeringsfunktionen. Fortsätt att hålla knappen "Prog" intryckt och tryck samtidigt på knappen för specialfunktioner med hjälp av en pipettspets eller änden på ett gem. 4. Tryck på knappen "Fill" (fyll). Tryck på upp-pilen tills 2 visas. Tryck på "Enter". 5. Tryck på knappen "Disp" (dispensera). Tryck på upp-pilen tills 15 visas. Tryck på "Enter". 6. Tryck på "Enter" en gång till för att spara programmet och lämna denna funktion. Ett pip bör nu avges som bekräftelse på att programmeringen är klar. 7. Kontrollera din programmering genom att trycka på utlösaren så att du stegar framåt ett steg i taget. Ställ in aspirerings-/dispenseringshastigheten med hjälp av knappen "Vol" efterhand som du stegar dig fram. För varje steg visas hastighetsindikatorn (Speed). Använd "Vol"-knappen för att ställa in hastighetsindikatorn så att den visar 2 fyrkanter för stegen "Fill" och "Disp". Program 5 1. Tryck på "Prog" (program)-knappen. Tryck på knappen "Vol" (volym) tills "5" visas, för att välja Program 5. Tryck på "Enter". 2. Tryck och håll på knappen "Prog" för att komma in i programmeringsfunktionen. Fortsätt att hålla knappen "Prog" intryckt och tryck samtidigt på knappen för specialfunktioner med hjälp av en pipettspets eller änden på ett gem. 3. Tryck på knappen "Fill" (fyll). Tryck på upp-pilen tills 1 visas. Tryck på "Enter". 4. Tryck på "Disp". Tryck på upp-pilen tills 1 visas. Tryck på "Enter". 5. Tryck på "Mix". Tryck på upp-pilen tills 5 visas. Tryck på "Enter". 6. Tryck på "Enter" en gång till för att spara programmet och lämna denna funktion. Ett pip bör nu avges som bekräftelse på att programmeringen är klar. 7. Kontrollera din programmering genom att trycka på utlösaren så att du stegar framåt ett steg i taget. Ställ in aspirerings-/dispenseringshastigheten med hjälp av knappen "Vol" efterhand som du stegar dig fram. För varje steg visas hastighetsindikatorn (Speed). Använd "Vol"-knappen för att ställa in hastighetsindikatorn så att den visar 2 fyrkanter för funktionerna aspirering och dispensering. Använd "Vol"-knappen för att ställa in hastigheten för blandningen så att den visar 3 fyrkanter. Granskning av program Programmen bör granskas innan testförfarandet påbörjas. För att granska programmet skall pipetten först slås PÅ. Tryck på den blå "Prog" (program)-knappen. Tryck på knappen "Vol" (volym) tills rätt programnummer (1 eller 5) visas. Tryck på "Enter"-knappen. Använd pipetteringsutlösaren för att stega dig fram ett steg i taget genom programmet. Program 1: I detta program aspireras 2 µl varav 15 µl dispenseras i CF-mikrobrunnen. Pipettens display bör visa följande: Fill 2 µl SII Dispense 15 µl SII Program 5: I detta program aspireras 1 µl, 1 µl dispenseras och 5 µl blandas tre gånger. Pipettens display bör visa följande: Fill 1 µl SII Dispense 1 µl SII Mix 5 µl SIII Zero (blinkar) 3

4 C. Plattlayout: Plattlayoutrapporten (Plate Layout Report) genereras av BD ProbeTec ET-instrumentet efter att analystyp, provdata, kontrollpartinummer och satspartinummer loggats in i systemet. Plattlayoutrapporten visar hur proverna och kontrollerna är placerade på varje platta som skall testas. Denna orientering används för både plattan med primningsmikrobrunnar och plattan med amplifieringsmikrobrunnar. Primningsmikrobrunnarna för CF-analysen utgörs av enfärgade ljusblå mikrostrips. Amplifieringsmikrobrunnarna utgörs av ljusblårandiga mikrostrips. D. Pinnprov från svalg (utan transportmedium): ANMÄRKNINGAR: Låt BD ProbeTec ET spädningsvätska för pinnprov (tcf/tmp) värmas upp till rumstemperatur och blanda genom försiktig vändning före användning. Häll av nödvändig mängd BD ProbeTec ET spädningsvätska för pinnprov (tct/tmp) i en ren behållare. För att uppskatta hur stor mängd som behövs multipliceras antalet prover med 1 ml och ytterligare 1-2 ml läggs till för att underlätta pipettering. Undvik kontaminering av spädningsvätskan - häll ej tillbaka överbliven vätska i flaskan. 1. Märk ett 4 ml provrör för varje pinnprov från svalg som ska prepareras. 2. Låt proverna värmas upp till rumstemperatur. 3. Pipettera 1 ml av spädningsvätska för pinnprov (tcf/tmp) till varje provrör. 4. För ned provtagningspinnen. Blanda genom att röra om med pinnen i spädningsvätskan i 5-1 s. 5. Pressa provtagningspinnen mot rörets insida för att få bort all vätska. 6. Ta ut pinnen försiktigt så att det inte stänker. OBS! Droppar kan medföra att arbetsområdet kontamineras. 7. Sätt tillbaka pinnen i transportröret och kasta röret. 8. Sätt på locket ordentligt på röret. 9. Vortexblanda röret i 5 s. 1. Upprepa steg 3-9 för ytterligare pinnprover från svalg. 11. Bered kontrollerna. Se Beredning av kontroller för pinnprover från svalg (avsnitt F). 12. Använd plattlayoutrapporten som vägledning och placera prover och kontroller i rätt ordning i lyseringsstället. 13. Lås fast proverna på plats i BD ProbeTec ET lyseringsställ. 14. Sätt in lyseringsstället i BD ProbeTec lyseringsvärmaren. 15. Värm proverna i 1 min. 16. Efter 1 min. avlägsna BD ProbeTec ET lyseringsställ från BD ProbeTec ET lyseringsvärmaren och låt svalna under minst 15 min. Slå stället försiktigt på bänkskivan för att insamla så mycket av kondensatet som möjligt i röret. OBS! Efter att proverna lyserats: a. Proverna kan förvaras vid ºC i upp till 6 h och kan analyseras utan att lyseras på nytt. b. Proverna kan förvaras i upp till 3 dagar vid 2-8 ºC. Proverna måste då vortexblandas och lyseras på nytt före analys. c. Proverna kan förvaras i upp till 14 veckor vid -2 C. Proverna måste då tinas vid rumstemperatur, vortexblandas och lyseras på nytt före analys. 17. Proverna är nu klara att analyseras enligt Testförfarande vid BD ProbeTec ET CF-analys (avsnitt G). E. Preparering av pinnprov från svalg (2SP-medium) Anmärkningar angående förfaranden: Byt pipettspetsar mellan alla vätskeöverföringar. Användning av proppade pipettspetsar rekommenderas. Låt BD ProbeTec ET spädningsvätska för luftvägsprover och medier (CF/LP/MP) värmas upp till rumstemperatur och blanda genom försiktig vändning före användning. Häll av nödvändig mängd BD ProbeTec ET spädningsvätska för luftvägsprover och medier (CF/LP/MP) i en ren behållare. För att uppskatta hur stor mängd som behövs multipliceras antalet prover med,4 ml och ytterligare 1-2 ml läggs till för att underlätta pipettering. Undvik kontaminering av spädningsvätskan - häll ej tillbaka överbliven vätska i flaskan. 1. Låt proverna värmas upp till rumstemperatur. 2. Märk ett 2 ml rör med skruvlock för varje prov som skall testas. 3. Tillsätt 4 µl spädningsvätska för luftvägsprover och medier (CF/LP/MP) till varje rör med skruvlock. Följande steg 4-6 skall utföras i biologiskt säkerhetsskåp: 4. Vortexblanda proverna i korta pulser under 5-15 s så att de blandas ordentligt. 5. Pipettera 2 µl prov till det märkta röret. OBS! Om provvolymen är mindre än 2 µl (det måste minst vara 1 µl prov), tillsätt graderat molekylärbiologiskt vatten så att volymen blir 2 µl. 6. Byt handskar efter att du tillsatt proverna. OBS! Fyll ett vattenbad med destillerat vatten och låt vattnet koka upp före fortsättning till steg Vortexblanda i korta pulsar i 5 s. 8. Bered kontrollerna. Se Beredning av 2SP-mediumkontroll (avsnitt F). 9. Sätt proverna och kontrollerna i ett vattenbadsställ. 1. Sätt vattenbadsstället i det kokande vattenbadet i 1 min. 11. Ta upp vattenbadsstället efter 1 min och låt rören svalna i rumstemperatur i 15 min. VARNING! Var försiktig så att du inte bränner dig på det kokande vattnet, vattenbadsstället eller vattenbadets ytor som kan vara heta. 12. Centrifugera rören (16 x g) i cirka 5 s efter att de svalnat. OBS! Efter att proverna kokats: Proverna kan förvaras vid ºC i upp till 6 h och kan analyseras utan att kokas på nytt. Proverna kan förvaras i upp till 3 dagar vid 2-8 ºC. Proverna måste då vortexblandas och lyseras på nytt före analys. De kan förvaras i upp till 14 veckor vid -2 C. Prover måste tinas vid rumstemperatur, vortexblandas och kokas på nytt före analys. 4

5 13. Proverna är nu klara att analyseras enligt Testförfarande vid BD ProbeTec ET CF-analys (avsnitt G). F. Beredning av kontroll: Beredning av kontroll för pinnprov från svalg 1. Bered ett negativt kontrollrör (tcf/tmp) och ett positivt kontrollrör (tcf/tmp) för varje omgång (platta) som skall testas. Om en platta innehåller mer än ett partinummer per reagensförpackning måste kontroller testas tillsammans med varje enskilt parti. 2. Ta av locket från röret med negativ kontroll (tcf/tmp). 3. Använd en ny pipettspets och tillsätt 1 ml av spädningsvätska för pinnprov. 4. Sätt på locket ordentligt på röret. 5. Ta av locket från röret med positiv kontroll (tcf/tmp). 6. Använd en ny pipettspets och tillsätt 1 ml av spädningsvätska för pinnprov. 7. Sätt på locket ordentligt på röret. 8. Vortexblanda kontrollrören i 5 s. 9. Kontrollrören är nu klara att lyseras. Se Preparering av pinnprover från svalg (avsnitt D). Beredning av 2SP-mediumkontroll: 1. Bered ett negativt kontrollrör (CF/LP/MP) och ett positivt kontrollrör (CF/LP/MP) för varje omgång (platta) som skall testas. Om en platta innehåller mer än ett partinummer per reagensförpackning måste kontroller testas tillsammans med varje enskilt parti. 2. Vänd spädningsvätskan för luftvägsprov och medier försiktigt före användning. 3. Ta av locket från röret med negativ kontroll (CF/LP/MP). 4. Använd en ny pipett för varje kontrollrör och tillsätt 2 µl graderat molekylärbiologiskt vatten. 5. Använd en ny pipett för varje kontrollrör och tillsätt 4 µl spädningsvätska för luftvägsprover och medier. 6. Sätt på locket ordentligt på röret. 7. Ta av locket från röret med positiv kontroll (CF/LP/MP). 8. Använd en ny pipett för varje kontrollrör och tillsätt 2 µl graderat molekylärbiologiskt vatten. 9. Använd en ny pipett för varje kontrollrör och tillsätt 4 µl spädningsvätska för luftvägsprover och medier. 1. Sätt på locket ordentligt på röret. 11. Vortexblanda kontrollrören i 5 s. 12. Kontrollerna är nu klara att kokas. Se Beredning av 2SP-mediumkontroll (avsnitt E). G. Testförfarande vid BD ProbeTec ET CF-analys: OBS! Innan testen utförs skall de preparerade proverna och de preparerade kontrollerna sättas i ett ställ för 2 ml eller 4 ml provrör, som t.ex. BD ProbeTec ET ställ för 2 ml provrör eller BD ProbeTec ET lyseringsställ, vilka båda är kompatibla med BD ProbeTec ET pipett. 1. Ta av och kasta locken från de avsvalnade proverna och kontrollerna. 2. BYT HANDSKAR innan du fortsätter, så att kontaminering undviks. 3. Förbered primningsplattan med hjälp av plattlayoutrapporten - se Plattlayout (avsnitt C). 4. Återförsegla mikrobrunnpåsarna på följande sätt: a. Lägg påsen på en plan yta. Håll den öppna änden platt med ena handen. b. Tryck och för samtidigt fingrarna längs förseglingens utsida från ena änden av påsen till den andra. c. Kontrollera att påsen är förseglad. 5. Välj Program 1 på BD ProbeTec ET pipetten. 6. Plocka upp pipettspetsarna. Expandera BD ProbeTec ET pipett genom att dra ut distanseringsratten hela vägen. OBS! Kontrollera att spetsarna sitter väl fast på pipetten så att läckage förhindras. 7. Aspirera 2 µl från den första kolumnen prover. 8. Fäll varligt ihop pipetten, snudda med pipettspetsarna mot brunnarnas sidor och dispensera 15 µl i den motsvarande kolumnen primningsmikrobrunnar (1 A-H). OBS! Pipetten får inte fällas ihop över proverna eller mikrobrunnarna, eftersom detta kan orsaka kontaminering. Plötsliga rörelser kan ge upphov till bildning av droppar eller aerosoler. 9. Kasta spetsarna. Tryck in pipetteringsutlösaren för att återställa pipetten. OBS! Bortskaffa spetsarna försiktigt så att droppar och aerosoler som kan kontaminera arbetsområdet undviks. 1. Plocka upp nya spetsar, expandera pipetten och aspirera 2 µl från den andra kolumnen prover. 11. Fäll varligt ihop pipetten, snudda med pipettspetsarna mot brunnarnas sidor och dispensera 15 µl i den motsvarande kolumnen primningsmikrobrunnar (2 A-H). 12. Kasta spetsarna. 13. Fortsätt att överföra de återstående proverna i analysomgången. 14. Täck över primningsmikrobrunnarna med primningsskyddet och inkubera plattan vid rumstemperatur i minst 2 min. (Kan inkuberas i upp till 6 h.) OBS! Förslut de preparerade proverna med nya lock. BYT HANDSKAR. 15. När primningsinkuberingen är avslutad skall plattan med amplifieringsmikrobrunnar göras i ordning. Konfigurera amplifieringsmikrobrunnarna på en platta enligt plattlayoutrapporten (på samma sätt som för primningsplattan). Försegla åter mikrobrunnpåsen enligt anvisningarna i steg Ta av skyddet från plattan med primningsmikrobrunnar och sätt in plattan i primningsvärmaren. Sätt OMEDELBART in plattan med amplifieringsmikrobrunnar i förvärmaren. 17. Ställ in tidtagaren på 1 min. (OBS! Korrekt tid för detta steg är ytterst viktigt.) 18. Välj program 5 på pipetten efter den 1 min. långa (± 1 min) inkuberingen. 19. Plocka upp pipettspetsar och överför 1 µl från kolumn 1 på plattan med primningsmikrobrunnar till kolumn 1 på plattan med amplifieringsmikrobrunnar. Snudda med pipettspetsarna vid brunnarnas sidor och dispensera vätskan. Låt pipetten automatiskt blanda vätskan i brunnarna efter utförd dispensering. Lyft försiktigt upp pipetten från plattan. Undvik att vidröra andra brunnar. 5

6 2. Kasta spetsarna. Plocka upp nya spetsar och fortsätt att överföra reaktionsblandningen från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna, kolumn för kolumn, med nya pipettspetsar för varje kolumn. 21. Ta av baksidan från en amplifieringsförsegling efter att den sista kolumnen har överförts (en halv amplifieringsförsegling täcker upp till 6 kolumner. Om plattan har mer än 6 kolumner MÅSTE en hel amplifieringsförsegling användas). Håll i förseglingens kanter och placera den över mikrobrunnarna. Använd styranordningarna på förvärmaren som vägledning vid påsättning av förseglingen. Tryck ned förseglingen så att samtliga mikrobrunnar är fullständigt förseglade. 22. Vid BD ProbeTec ET-användargränssnittet, ta ut hållaren, öppna dörren och lyft upp plattskyddet. Överför OMEDELBART (inom 3 s) den förseglade plattan med amplifieringsmikrobrunnar till BD ProbeTec ET-instrumentet och starta analysomgången. (För detaljerade anvisningar hänvisas till användarhandboken för BD ProbeTec ETsystemet.) 23. Gå vidare med följande del av rengöringsproceduren efter att analysomgången satts igång: a. Försegla primningsmikrobrunnarna med amplifieringsförseglingen och avlägsna plattan från primnings- och förvärmaren. VARNING! Temperaturen överskrider 7 C - använd den värmetåliga handsken för att avlägsna plattan. b. Låt plattan svalna på bänken i 5 min. c. Ta upp de förseglade primningsmikrobrunnarna från plattan genom att hålla i förseglingen på båda sidorna och lyfta brunnarna rakt uppåt som en enhet. Lägg in de förseglade mikrobrunnarna i en avfallspåse och försegla påsen. d. Rengör metallplattan: Skölj plattan med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit - Alconoxlösning. Skölj plattan med vatten. Linda in plattan i en ren pappershandduk och låt den torka fullständigt innan den åter används. 24. När analysomgången är avslutad genereras en utskrift av analysresultaten. 25. Flytta ut platthållaren ur stativet, öppna dörren och avlägsna plattan. Stäng dörren och för plattstativet tillbaka in i instrumentet. 26. Ta upp de förseglade amplifieringsmikrobrunnarna från plattan. OBS! Förseglingsmaterialet får ej avlägsnas från mikrobrunnarna. De förseglade mikrobrunnarna kan enkelt avlägsnas från plattan som en enhet genom att man håller i förseglingens över- och nederdel och lyfter brunnarna rakt upp och ut ur plattan. Lägg in de förseglade mikrobrunnarna i avfallspåsen. Försegla påsen. 27. Rengör metallplattan: Skölj plattan med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit - Alconoxlösning. Skölj plattan med vatten. Linda in plattan i en ren pappershandduk och låt den torka fullständigt innan den åter används. 28. Utför följande rengöringsprocedurer efter att den sista analysomgången för dagen är avslutad: a. Dränk in pappershanddukar eller gasvävskompresser med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconoxlösning och applicera rengöringslösningen på arbetsbänkarna, lyseringsvärmarens, primnings- och förvärmarens utsidor, provrörsstället, vattenbaden, centrifugen samt BD ProbeTec ET-instrumentet. Låt lösningen verka på dessa ytor i 2-3 min. Dränk in pappershanddukar eller gasvävskompresser med vatten och avlägsna rengöringslösningen. Byt handdukar eller kompresser ofta under applicering av rengöringslösningen och sköljningen med vatten. Fukta pappershanddukar eller gasvävskompresser med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox och torka av pipettens handtag (ENDAST HANDTAGET). Torka av handtaget efter 2-3 min med pappershanddukar eller gasvävskompresser fuktade med vatten. b. Sänk ned lyseringsstället samt dess bas, skydd och plattor, eller vattenbadsstället i 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox i 1-2 min. Skölj noga med vatten och låt delarna lufttorka. c. Återuppladda pipetten. d. Bortskaffa de förseglade avfallspåsarna och påsen med biologiskt riskavfall enligt fastställda rutiner för bortskaffande av kontaminerat biologiskt avfall. 29. Följande åtgärder skall utföras minst en gång i veckan: a. Häll bort vattnet i vattenbaden. b. Rengör vattenbaden med 1 % (vol/vol) natriumhypokloritlösning med Alconox. Skölj med vatten och låt vattenbaden lufttorka. c. Fyll vattenbaden på nytt med destillerat vatten. Kvalitetskontroll Kvalitetskontroll måste utföras i enlighet med gällande bestämmelser eller ackrediteringskrav samt laboratoriets etablerade procedurer för kvalitetskontroll. Det rekommenderas att användaren konsulterar tillämpliga CLSI (tidigare NCCLS)-riktlinjer och CLIA-föreskrifter för lämpliga kvalitetskontrollförfaranden. Spädningsvätska för pinnprov och kontroller tillhandahålls tillsammans i Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp). Spädningsvätska för luftvägsprover och medier samt kontroller tillhandahålls tillsammans i Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP). En positiv och en negativ kontroll måste inkluderas för varje prov och analysomgång av en platta samt för varje nytt reagenspartinummer. Kontrollerna kan utplaceras slumpartat. Den positiva kontrollen används för att övervaka större reagensfel. Den negativa kontrollen används för att övervaka kontaminering av reagens och/eller omgivning. För att provresultaten skall kunna rapporteras måste analysresultatet för de positiva och negativa kontrollerna utfalla positivt respektive negativt. Om resultaten för kontrollerna inte utfaller som förväntat betraktas analysomgången som ogiltig och patientresultaten rapporteras inte av instrumentet. Om analyskontrollerna inte utfaller med förväntat resultat skall hela analysomgången upprepas med ett nytt set kontroller, nya mikrobrunnar och de preparerade proverna. Om det inte finns tillräckligt med preparerat prov kvar för upprepning av analysen skall en ny alikvot från primärprovet prepareras. Om upprepad kontroll inte ger förväntat resultat skall Teknisk service kontaktas (se "Tolkning av resultat"). En intern amplifieringskontroll (IAC, Internal Amplification Control) är torkad i primningsmikrobrunnen. IAC innehåller nukleinsyra som amplifieras i närvaro av provmatrix. IAC är utformad för att bekräfta validiteten i amplifieringsreaktionen och identifiera potentiell inhibition från det preparerade provet. 6

7 Provprepareringskontroller Provprepareringskontroller kan testas i enlighet med kraven fastställda av tillämpliga ackrediteringsorganisationer. En positiv och negativ kontroll bör testa hela analyssystemet. För detta ändamål kan kända positiva prover tjänstgöra som kontroller genom att prepareras och analyseras tillsammans med prover vars resultat är okända. Prover som används som prepareringskontroller måste förvaras, prepareras och analyseras enligt anvisningarna i bipacksedeln. De positiva och negativa kontrollerna är avsedda att kontrollera effektiviteten av provprepareringsprocedurerna vid analys av pinnprov från svalg (antingen med eller utan transportmedium respektive kontroller för pinnprov samt kontroller för luftvägar och medier), därför att kontrollerna är preparerade på ett liknande sätt jämfört med proverna. Övervakning av förekomst av DNA-kontamination Följande testförfaranden bör utföras minst en gång i månaden, för att kontrollera om arbetsområdet och utrustningens ytor har kontaminerats med DNA. Övervakning av miljön är av avgörande betydelse för att detektera kontaminering innan sådan hinner utvecklas till ett problem. 1. Använd en BBL CultureSwab EZ provtagningspinne för varje område* som skall testas. 2. Märk ett provrör för varje provtagningsområde och pipettera 1 ml av spädningsvätska för pinnprov (tcf/tmp) till varje rör. 3. Doppa den första provtagningspinnen i spädningsvätskan, och torka av det första området med en bred, svepande rörelse. 4. Stoppa ned provtagningspinnen i spädningsvätskan, exprimera provtagningspinnen, sätt på locket på röret och vortexblanda i 5 s. Kassera provtagningspinnarna. 5. Upprepa ovanstående steg för varje område som skall provtas. 6. Placera rören i lyseringsstället och värm i lyseringsvärmaren i 1 min. Avlägsna stället från värmaren, och tillåt proverna att svalna i 15 min innan fortsättning av analysen. 7. Använd rena handdukar indränkta med vatten för att avlägsna rester av buffertblandning från provtagningsområdena medan rören värms. 8. Gå vidare enligt Testförfarande vid BD ProbeTec ET CF-analys (avsnitt G) efter att proverna svalnat. *Rekommenderade testområden inkluderar: Lyseringsställets ytor, lyseringsvärmaren, vattenbadsstället, mikrocentrifugen, primnings- och förvärmaren, svarta mikrobrunnbrickor, pipettens handtag, instrumentets pekknappar, instrumentets tangentbord, vattenbadens torra ytor, provrörsställens ytor samt arbetsbänkarna inklusive områden för preparering av prover. Vid positivt resultat för ett område skall området rengöras med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Se till att hela området fuktas med rengöringslösningen och låt den verka på ytan i minst 2 min eller tills den torkat. Torka vid behov bort överflödig rengöringslösning med en ren handduk. Torka av området med en ren handduk indränkt med vatten och låt ytan torka. Testa området på nytt. Upprepa förfarandet tills ett negativt resultat erhålls. Kontakta Teknisk service för ytterligare information om det inte går att få bukt med kontaminationen. TOLKNING AV ANALYSRESULTAT Närvaro eller frånvaro av DNA från Chlamydiaceae-familjen fastställs genom att beräkna PAT-poängen (PAT="Passes After Threshold") för provet ifråga, på grundval av förbestämda tröskelvärden. PAT-poängen är en enhet som används för att bedöma storleken på den signal som genereras som resultat av reaktionen. Högre siffror för denna enhet anger att tröskeln uppnåddes under amplifieringens tidiga faser, medan lägre siffror innebär att tröskeln uppnåddes senare under reaktionens gång. Storleken på PAT-poängen anger inte hur stor mängd av Chlamydiaceae-familjens DNA som finns närvarande i provet. Om förväntade analyskontrollresultat ej erhålls, skall svar på patientproverna ej lämnas. Se avsnittet om kvalitetskontroll för information om förväntade kontrollvärden. De rapporterade resultaten bestäms enligt följande: PAT-poäng CF-mål IAC-mål-DNA Resultat Tolkning Provsvar > > eller = Positivt Chlamydiaceae-familjens DNA detekterat med SDA. = > Negativt Chlamydiaceae-familjens DNA ej detekterat med SDA. a Upprepa BD ProbeTec ET CF-analysen med användning av det preparerade provröret. Om otillräcklig volym återstår efter provprepareringen, upprepa proceduren vid behov med det ursprungliga provet eller begär ett nytt prov. Om resultatet av den upprepade analysen är positivt eller negativt tolkas resultatet enligt ovan. Om resultatet av den upprepade analysen fortfarande ej är bestämbart skall ett nytt prov begäras. Bestämning av CF- och IAC-tröskelvärden: Tröskelvärdena för Chlamydiaceae-familjens mål-dna och IAC fastställdes initialt med användning av Receiver Operator Characteristic-kurvanalys av data erhållna från positiva och negativa kontroller. Dessa tröskelvärdena verifierades och validerades i kliniska studier. METODENS BEGRÄNSNINGAR 1. BD ProbeTec ET CF Assay är specifik för, men differentierar ej mellan medlemmar av Chlamydiaceae-familjen (dvs. C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis och C. psittaci). 7 Positivt för organismer tillhörande Chlamydiaceaefamiljen, talande för aktuell infektion. Ytterligare testning krävs för identifiering av species. Förmodat negativt för organismer tillhörande Chlamydiaceae-familjen. Infektion orsakad av Chlamydiaceae-familjen kan inte uteslutas därför att nivåerna av aktuellt DNA är under detektionsgränsen för analysen. = = Ej bestämbart. Amplifieringskontrollen inhiberad. Ytterligare testning krävs för tolkning av resultatet. a

8 2. BD ProbeTec ET CF-analysen har endast utvärderats för pinnprov från svalg (med eller utan 2SP-transportmedium). Prestandan vid användning med andra provtyper har ej fastställts. 3. BD ProbeTec ET CF-analysen har utvärderats endast för prover från patienter 1 år och äldre. 4. Som vid många diagnostiska tester skall resultaten som erhålls med BD ProbeTec ET CF analysen tolkas i kombination med andra laboratorie- och kliniska data som läkaren har tillgång till. Ett positivt resultat av denna analys i kombination med andra kliniska tecken och symptom samt diagnostiska belägg för pneumoni, talar för klamydia-associerad pneumoni. 5. Ett negativt analysresultat bör inte användas för att utesluta diagnosen klamydia-associerad pneumoni, eftersom analysresultaten kan påverkas av felaktig provtagningsteknik, tekniska fel, förväxling av prover, pågående antibiotikabehandling eller förekomst av en mängd DNA från familjen Chlamydiaceae i provet som ligger under analysens sensitivitet. Följaktligen kan ytterligare diagnostiska testförfaranden behövas såsom odling, serologi och/eller en validerad nukleinsyreamplifikationstest enligt rekommenderade utfärdade riktlinjer BD ProbeTec ET CF-analysen kan inte användas för att bedöma huruvida behandlingen varit framgångsrik eller misslyckad, eftersom nukleinsyror från Chlamydiaceae-familjen kan kvarstå även efter framgångsrik antimikrobiell behandling. 7. För optimalt resultat av denna analys krävs att provtagning och hantering av proverna utförs korrekt. 8. Användning av BD ProbeTec ET CF-analysen skall begränsas till personal med utbildning i analysförfarandet och BD ProbeTec ET-systemet. 9. BD ProbeTec ET CF-analysen ger kvalitativa resultat. PAT-poängens storlek och mängden av DNA från Chlamydiaceae-familjen i ett prov korrelerar inte med varandra. FÖRVÄNTADE RESULTAT A: Prevalens Frekvensen positiva resultat vid Chlamydiaceae-testning varierar beroende på vilken testmetod som används, patientens ålder, förekomst av bakomliggande riskfaktorer, geografiskt läge och, viktigast av allt, den lokala prevalensen av sjukdomen inklusive exponering via arbetet. B: PAT-poäng - frekvensdistribution Prospektiv studie Obs! Alla BD ProbeTec ET CF-analysresultat jämfördes med odlingsresultat av pinnprov från svalg som exprimerats i 2SP-transportmedium. Se "Prestanda" för en utförlig beskrivning av den kliniska studiens uppläggning. Totalt insamlades och analyserades 354 prospektiva pinnprover från svalg (förvarade utan transportmedium) från 354 patienter på sju institutioner i USA och Kanada med BD ProbeTec ET CF-analysen. Frekvensdistributionen för de initiala CF-PAT-poängen jämfördes med odlingsresultaten som visas i figur 1. Sjuttiofem pinnprov från svalg, som insamlades prospektivt och exprimerades i 2SP-transportmedium för odling, testades också med BD ProbeTec ET CF-analysen. Frekvensdistributionen för de initiala CF-PAT-poängen jämfördes med odlingsresultaten som visas i figur 2. Retrospektiv studie Tjugofem retrospektiva pinnprov från svalg, som exprimerades i 2SP-transportmedium och förvarades frysta, testades med BD ProbeTec ET CF-analysen på en institution i Europa. En frekvensdistribution av de initiala CF-PATpoängen jämfördes med de ursprungliga odlingsresultaten och visas i figur 3. En frekvensdistribution av de initiala CF-PAT-poängen jämfördes med de ursprungliga PCR-resultaten från samma prov och visas i figur 4. Figur 1: Frekvensdistribution över CF-PAT-poäng - resultat från prospektiva pinnprov från svalg (utan transportmedium) jämförda med odlingsprover Frekvens (-) (+) CF-PAT-poäng 1 Odling - Odling + Resultat vid odling Total Negativt Positivt Total

9 Figur 2: Frekvensdistribution över CF-PAT-poäng - resultat från prospektiva pinnprov från svalg (2SP-medium) jämförda med odlingsprover Frekvens (-) (+) Odling - Odling CF-PAT-poäng Resultat vid odling Total Negativt Positivt Total Figur 3: Frekvensdistribution över CF-PAT-poäng - resultat från retrospektiva pinnprov från svalg (2SP-medium) jämförda med odlingsprover (2SP-medium) Frekvens (-) (+) 1 Odling - Odling CF-PAT-poäng Resultat vid odling Total Negativt Positivt 1 3 Total

10 Figur 4: Frekvensdistribution över CF-PAT-poäng - resultat från retrospektiva pinnprov från svalg (2SP-medium) jämförda med PCR-prover (2SP-medium) Frekvens (-) (+) CF-PAT-poäng Odling - Odling + PCR-resultat Total Negativt Positivt Total C. Kontroller Under den kliniska utvärderingen genomfördes 45 körningar med användning av kontrollerna för luftvägar och medier (CF/LP/MP). Alla körningar hade acceptabla kontrollresultat. Totalt 78 körningar genomfördes med användning av kontrollerna för pinnprov (tcf/tmp). Två av körningarna hade misslyckade kontroller. Ett misslyckande berodde på procedurfel, det andra felet kunde ej tillskrivas någon speciell orsak. PAT-poängen för CF/LP/MP-kontrollerna och tcf/tmp-kontrollerna är sammanfattade i respektive tabell 1 och 2. Tabell 1: Sammanfattning av CF-PAT-poäng på kontroller för luftvägar och medier (CF/LP/MF) Kontroll N Område 5:e percentilen Medelvärde Median 95:e percentilen CF-negativ 45 CF-positiv 45 39,5 52, , , Tabell 2: Sammanfattning av CF-PAT-poäng på kontrollerna för pinnprov (tcf/tmp) Kontroll N Område 5:e percentilen Medelvärde Median 95:e percentilen CF-negativ 77 CF-positiv 76 28,3 52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 KLINISKA PRESTANDA Prospektiv studie BD ProbeTec ET CF-analysen utvärderades prospektivt vid sju kliniska centra i USA och Kanada under den "respiratoriska" säsongen under Ett pinnprov från svalg (CultureSwab EZ - förvarat utan transportmedium) insamlades för testning med BD ProbeTec ET CF-analysen. Ett prov med en polyesterprovtagningspinne insamlades och suspenderades i 2SP- (sukrosfosfat) transportmedium för odlingsanalys och ett andra prov med polyesterprovtagningspinne insamlades och suspenderades i Tris-EDTA- (TE) buffert för PCR-analys. Följaktligen har resultat från alla prospektivt insamlade prover jämförts med odlingsresultat av pinnprov från svalg i 2SP-medium. En av de sju kliniska centren utförde alla referensanalyserna av Chlamydiaceae-odlingarna. Närvaron av minst en inklusion efter färgning med en genusspecifik monoklonal antikropp ansågs tala för att provet var positivt för en species av Chlamydiaceae. Närvaron av minst en inklusion efter färgning med en FITC-konjugerad C. pneumoniaespecifik monoklonal antikropp ansågs tala för att provet var positivt för C. pneumoniae. En av de sju kliniska centren utförde all PCR-analysering av de prospektiva proven. PCR utfördes på pinnprov från svalg exprimerade i TE-buffert från alla patienter med en positiv BD ProbeTec ET CF-analys, liksom även på en del av de samstämmigt negativa proven och alla prov med icke överensstämmande resultat (t.ex. prover med avvikande resultat mellan BD ProbeTec ET CF-analysen och referensmetoden). PCR-analysen var specifik för C. pneumoniae och utgör en av fyra publicerade protokoll som nöjaktigt uppfyller optimala kriteria för en validerad PCR-analys. 3,9 Totalt 354 pinnprov från svalg (förvarade utan transportmedium) som insamlades från 354 patienter uppfyllde inklusionskriterierna för studien (dvs. röntgenologiska tecken på pneumoni, patienter 1 års ålder, stått på antibiotika 14 dagar, giltig provtyp tagen, lämpliga referensmetoder utförda, etc.). För att kunna bedöma prestanda av BD ProbeTec ET CF-analysen, jämfördes resultat av pinnprov från svalg (utan transportmedium) med odlingsresultat från ett parallellt pinnprov från svalg exprimerat i 2SP-medium. Ett prov betraktades som positivt om odlingsresultatet var positivt. Ett prov betraktades som negativt om odlingsresultatet var negativt. Resultaten av pinnproverna från svalg (utan transportmedium) har sammanfattats i tabell 3. Inga icke bestämbara resultat observerades. 1

11 Tabell 3: Jämförande prospektiva analysresultat av pinnprov från svalg mellan BD ProbeTec ET CF-analysen (utan transportmedium) och odling Institution Odling CF-resultat Positivt Negativt Total 1 Positivt Negativt 2 a Total Positivt Negativt Sensitivitet (95 % CI) % (/2) ( % 84,2 %) Total ET 3 Positivt 1 b 1 Negativt Total ET 4 Positivt Negativt Specificitet (95 % CI) 1 % (89/89) (95,9 % 1 %) 1 % (26/26) (86,8 % 1 %) 99 % (97/98) (94,4 % 1 %) Total ET 6 Positivt Negativt Total ET 7 Positivt 1 % (24/24) (85,8 % 1 %) 1 % (34/34) (89,7 % 1 %) Negativt 1 c 8 81 Total Sammanlagt Positivt 1 1 Negativt Total % (/1) ( % 97,5 %) % (/3) ( % 7,8 %) 1 % 8/8) (95,5 % 1 %) 99,7 % (35/351) (98.4,% 1 %) a Odlingsresultaten för båda proverna hade en graderad 1+ växt (1 inklusion per brunn eller 5 inklusioner per ml 2SP-medium). PCR-resultaten för båda proverna var negativa. b PCR-resultatet var positivt. c Odlingen hade en graderad 2+ växt (72 inklusioner per brunn eller 36 inklusioner per ml 2SP-medium). PCR-resultatet var negativt. ET = Ej Tillämpligt Obs! PCR-analysen är specifik för C. pneumoniae och utgör en av fyra publicerade protokoll som nöjaktigt uppfyller optimala kriteria för en validerad PCR-analys. 3,9 Sjuttiofem pinnprov från svalg (exprimerade i 2SP-medium), som insamlades prospektivt och exprimerades i 2SPtransportmedium för odling, testades också med BD ProbeTec ET CF-analysen. Jämfördes resultat av pinnprov från svalg exprimerade i 2SP-medium med odlingsresultat av samma prov. Ett prov betraktades som positivt om odlingsresultatet var positivt. Ett prov betraktades som negativt om odlingsresultatet var negativt. Resultaten av pinnproverna från svalg, förvarade i 2SP-transportmedium, har sammanfattats i tabell 4. Inga icke bestämbara resultat observerades. 11

12 Tabell 4: Jämförande prospektiva analysresultat av pinnprov från svalg mellan BD ProbeTec ET CF-analysen (2SP-medium) och odling Odling Institution CF-analys Positivt Negativt Total 2 Positivt Negativt 1 a Total Positivt 1 c 1 Negativt 2 b Total Sammanlagt Positivt 1 1 Negativt Total Sensitivitet (95 % CI) % (/1) ( % 97,5 %) % (/2) ( % 84,2 %) % (/3) ( % 7,8 %) Specificitet (95 % CI) 1 % (36/36) (9,3 % 1 %) 97.2 % (35/36) (85,5 % 99,9 %) 98,6 % (71/72) (92,5 % 1 %) a Odlingen hade en graderad 2+ växt (72 inklusioner per brunn eller 36 inklusioner per ml 2SP-medium). PCRresultatet var negativt. b Odlingsresultaten för båda proverna hade en graderad 1+ växt (1 inklusion per brunn eller 5 inklusioner per ml 2SPmedium). PCR-resultaten för båda proverna var negativa. c PCR-resultatet var positivt. OBS! PCR-metodanalysen är specifik för C. pneumoniae och utgör en av fyra publicerade protokoll som nöjaktigt uppfyller optimala kriteria för en validerad PCR-analys. 3,9 Ett av pinnproverna från svalg insamlade från varje patient, som ingick i den prospektiva studien med BD ProbeTec ET CF-analysen, suspenderades i Tris-EDTA-buffert för PCR-analys. Alla positiva, avvikande (BD ProbeTec ET CFanalyspositiva, odlingsnegativa eller vice versa) och ungefär 1 % av de samstämmigt negativa proven testades med en etablerad C. pneumoniae-specifik PCR-metod. All PCR-analysering utfördes på en klinisk institution. Prov från totalt 27 patienter analyserades med C. pneumoniae PCR-analysen (dvs. 21 patienter med samstämmigt negativa resultat och sex patienter med avvikande resultat). Tabell 5 sammanfattar de sammanlagda resultatkombinationerna från odling, BD ProbeTec ET CF-analysen och PCR-analysen. Tabell 5: Sammanfattning av prospektiva patienttestmetoder och BD ProbeTec CF-analysresultat Resultat vid odling Resultat vid BD ProbeTec ET CF-analys Pinnprov från svalg 2SP-medium PCR Resultat c Patientantal + a 3 Ej eftergiven b + ET ET 65 ET 17 ET ET 263 ET ET 1 Teckenförklaring: ET = Ej Tillämpligt + utmärker ett positivt resultat utmärker ett negativt resultat a Två odlingar hade en graderad 1+ växt (1 inklusion per brunn eller 5 inklusioner per ml 2SP-medium). En odling hade en graderad 2+ växt (72 inklusioner per brunn eller 36 inklusioner per ml 2SP-medium). b Provet anlände upptinat till testinstitutionen. Odlingen utfördes ändå och var negativ. På grund av att provet var skadat användes ej odlingsresultatet för utvärdering av CF-analysens prestanda. c PCR-metodanalysen är specifik för C. pneumoniae och utgör en av fyra publicerade protokoll som nöjaktigt uppfyller optimala kriteria för en validerad PCR-analys. 3,9 Retrospektiv studie På grund av det låga antalet positiva prov i den prospektiva studien, identifierade BD en institution i Europa som hade 25 exprimerade pinnprov från svalg nedfrysta i 2SP-transportmedium. Dessa retrospektiva prover förvarades frysta i upp till åtta år; de flesta proverna (84 %, 21/25) förvarades under kortare tid än sex år. De 25 retrospektiva proven karakteriserades som en kombination av odling och PCR eller endast PCR. Av de 25 proven hade alla PCRresultat (22 positiva, tre negativa). Av de 22 PCR-positiva proven hade endast fyra odlingsresultat positiva för C. pneumoniae. Av de resterande 18 PCR-positva proven och de tre PCR-negativa proven, hade ingen odling utförts. Ett prov betraktades som positivt om antingen odlingsresultatet eller PCR-resultatet var positivt. Ett prov betraktades som negativt om det tillgängliga PCR-resultatet var negativt. Den procentuella överensstämmande uppskattningen av BD ProbeTec ET CF-analysen av pinnprov från svalg förvarade i 2SP-transportmedium jämfört med tillgänglig odling och/eller PCR-resultat har sammanfattats i tabell 6. Jämfört med odling var den procentuella överensstämmelsen 1 % (4/4). De positiva, negativa och sammanlagda procentuella överensstämmelserna jämfört med PCR var 81,8 % (18/22), 1 % (3/3) respektive 84 % (21/25). 12

13 Tabell 6: Retrospektiva resultat av pinnprov från svalg analyserade med BD ProbeTec ET CF-analysen (2SP-medium) jämfört med odlings- (2SP-medium) och/eller PCR-resultat (2SP-medium) Odling och/eller PCR Uppskattad procentuell överensstämmelse (95 % konfidensintervall) Institution CFresultat Positivt Negativt Total Positivt Negativt Sammanlagt DAN 8 Positivt 18 a,b 18 Negativt 4 c 3 d 7 Total a Fyra av de 18 proven identifierades positiva för C. pneumoniae med odling. b Av de 18 prov, som var positiva med PCR, identifierades två som positiva för C. psittaci, och 16 identifierades som positiva för C. pneumoniae. c Fyra prov identifierades som PCR-positiva för C. pneumoniae. d Tre prov var PCR-negativa med både en genus- och en species-specifik PCR-analys för C. pneumoniae. Odlingsanalys utfördes ej. Analytiska studier Amplifieringsreaktionsvolymen för BD ProbeTec ET CF-analysen är 1 µl preparerat prov. Analytisk sensitivitet Den analytiska sensitiviten av BD ProbeTec ET CF-analysen bestämdes med hjälp av en representativ panel av organismer tillhörande familjen Chlamydiaceae inkluderande Chlamydophila pneumoniae (16 stammar), Chlamydia trachomatis (15 serovarer), Chlamydophila psittaci (6 stammar) och C. muridarum (1 stammar). För varje organism, med undantaget av C. trachomatis serovarer E och F, späddes bakterielösningar till nivåerna, 6, 9 och 12 elementarkroppar (EB, elementary bodies) per reaktion. C. trachomatis serovarer E och F analyserades vid, 6, 12 och 18 EB/reaktion. För studier utförda med kliniska prover eller transportmedium, valdes C. pneumoniae ATCC AR39 stammen som den representativa organismen för Chlamydiaceae-familjen. Den analytiska sensitiviteten för BD ProbeTec ET CF-analysen i närvaro av ett pinnprovsmatrix från svalg bestämdes genom utsådd av material från provtagningspinnar med 2 µl utspädd C. pneumoniae AR39 moderlösning för att erhålla nivåer på, 3, 6 och 9 EB per reaktion. Den analytiska sensitiviteten för BD ProbeTec ET CF-analysen i närvaro av 2SP-medium bestämdes genom en utsådd av 2SP-medium med utspädd C. pneumoniae AR39 moderlösning för att erhålla nivåer på, 9, 12 och 2, 4 och 6 EB per reaktion. Alla proverna preparerades och analyserades i triplikat. Baserat på 1 % positivitet, har den analytiska sensitiviteten för olika organismer och provmatrix sammanfattats i tabell 7. Den faktiska detektionsgränsen (LOD, limit of detektion) kan dock vara lägre än den lägsta nivå som testades. Tabell 7: BD ProbeTec ET CF-analys - analytisk sensitivitet för olika isolat* Organism Analytisk sensitivitet (EB/reaktion) C. pneumoniae (16 stammar) 6 C. trachomatis serovarer B, Ba, C, D, I, LGV-1, LGV-2, LGV-3 81,8 % (18/22) (59,7 % 94,8 %) 1 % (3/3) (29,2 % 1 %) C. trachomatis serovar A 9 C. trachomatis serovar G 12 C. trachomatis serovarer H, J, K 15 C. trachomatis serovar E och F 12 respektive 25 C. pneumoniae (6 stammar) 6 (5 stammar) och 12 (1 stam) C. pneumoniae (1 stam) 6 Preparerade pinnprov från svalg 3 2SP-transportmedium 9 * Såvida inte annat har noterats, representerar LOD medianen för alla analyserade stammar eller serovarer. Analytisk specificitet Totalt 18 mikroorganismer (86 bakterier, sju jästsvampar, 14 virus och en parasit) utvärderades med användning av BD ProbeTec ET CF-analysen. Bacterieisolat analyserades vid koncentrationer från 1,17 x 1 7 till 3,7 x 1 9 CFU/mL eller celler/ml, med undantag för Coccidioides immitis och Haemophilus ducrei som analyserades med användning av bakterielösningar som var ekvivalenta med McFarland-standarder på 5 respektive 2. Virus analyserades vid en koncentration på 1 x 1 6 viruspartiklar/ml, medan Trichomonas vaginalis analyserades vid 4,6 x 1 6 celler/ml. Genomisk DNA eller RNA analyserades för fyra virus vid en koncentration på 1 x 1 6 genomer/ml. Ingen av de analyserade mikroorgansimerna gav ett positivt resultat eller inhiberade IAC (tabell 8) % (21/25) (63,9 % 95,5 %) 13

14 Tabell 8: BD ProbeTec ET LP-analys - analytisk specificitet Acinetobacter calcoaceticus Haemophilus parainfluenzae Peptostreptococcus Acinetobacter lwoffii Herpes simplex virus-1 asaccharolyticus Actinomyces israelii Herpes simplex virus-2 Peptostreptococcus productus Adenovirus-5 Histoplasma capsulatum Plesiomonas shigelloides Aeromonas hydrophila HIV-I, serotyp B Porphyromonas asaccharolytica Alcaligenes faecalis HPV, typ 16 Prevotella melaninogenicus Bacillus subtilis HPV, typ 18 Prevotella oralis Bacteroides fragilis Influensavirus A Propionibacterium acnes Blastomyces dermatitidis Influensavirus B Proteus mirabilis Bordetella bronchiseptica Kingella kingae Providencia stuartii Bordetella parapertussis Klebsiella pneumoniae subsp. Pseudomonas aeruginosa Bordetella pertussis ozaenae typ 4 Respiratoriskt syncytialvirus, lång Branhamella catarrhalis Klebsiella pneumoniae subsp. stam Candida albicans pneumoniae Rhinovirus Candida glabrata Lactobacillus acidophilus Salmonella choleraesuis serotyp Candida tropicalis Lactobacillus brevis Enteritidis Citrobacter freundii Legionella pneumophila Salmonella choleraesuis serotyp Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Typhi Coccidioides immitis Mobiluncus mulierieris Salmonella Minnesota Corynebacterium diphtheriae Moraxella lacunata Salmonella typhimurium Corynebacterium jeikeium Moraxella osloensis Serratia marcescens Corynebacterium renale Morganella morganii Staphylococcus aureus, protein A- Cryptococcus neoformans Mycobacterium avium producerande Cytomegalovirus Mycobacterium gordonae Staphylococcus aureus, icke protein Edwardsiella tarda Mycobacterium kansasii A-producerande Eikenella corrodens Mycobacterium intracellulare Staphylococcus epidermidis Enterobacter aerogenes Mycobacterium smegmatis Stenotrophomonas maltophilia Enterobacter cloacae Mycobacterium tuberculosis Streptococcus grupp B Enterococcus faecalis Mycoplasma genitalium Streptococcus mitis Enterococcus faecium Mycoplasma hominis, typ 1 Streptococcus mutans Enterovirus (Echovirus) Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Epstein-Barr virus Neisseria cinerea Streptococcus pyogenes Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptomyces griseus Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis Tatlockia (Legionella) micdadei Fusobacterium nucleatum Neisseria mucosa Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis Neisseria polysaccharea Ureaplasma urealyticum Gemella haemolysans Parainfluensavirus I Veillonella parvula Haemophilus ducreyi Peptostreptococcus anaerobius Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae Yersinia enterocolitica Interfererande substanser Möjliga interfererande substanser, vilka kan påträffas i pinnprov från svalg, analyserades med BD ProbeTec ET CFanalysen i frånvaro av mål eller i närvaro av 15 EB/reaktion av C. pneumoniae ATCC stam AR39. I frånvaro av mål, gav ingen av de analyserade substanserna ett positivt resultat eller inhiberade IAC vid de koncentrationer som har listats i tabell 9. Vid närvaro av mål, utföll alla analyserade prov positiva med de substanskoncentrationer som finns angivna i tabell 9. 14

15 Hostmedicin Tabell 9: BD ProbeTec ET LP-analys - substanser screenade för interferens Testade substanser Pinnprov från svalg Koncentration i prov Robitussin DM 25 % Triaminic (druvsmak) 25 % Nässprayer (poolade) Vicks Sinex 1 % Neo-Synephrine (normal styrka) 1 % Halssprayer Cepacol (svalkande mentol) 25 % Vicks Chloraseptic (körsbärssmak) 25 % Munvatten Scope (originalmint) 25 % Listerine (original) 25 % Hostdroppar Halls Sugar Free Citrus Blend 25 % Cold-Eeze Zinc 25 % Organismer Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae och Legionella pneumophila 1 7 celler/ml 1 7 CFU/mL 1 7 celler/ml respektive 1 7 CFU/mL Studie av spetsade prover För att supplementera det antal positiva prover som påträffades under den kliniska studien spetsades 25 pinnprov från svalg med 5 x 1 4 EB/mL av C. pneumoniae (positiva prov). Likaledes, spetsades 5 pinnprov från svalg med en bakteriesuspension innehållande L. pneumophila och M. pneumoniae för att efterlikna Chlamydiaceae-negativa pinnprov. Alla proverna testades med BD ProbeTec ET CF-analysen. Resultaten har sammanfattats i tabell 1. Den sammanlagda noggrannheten var 98,7 % (74/75). Tabell 1: BD ProbeTec ET CF-analys - resultat av spetsade pinnprov från svalg Resultat vid BD ProbeTec ET CF-analys Spetsningsnivå Positivt Negativt Total Positivt 25 1* 26 Negativt Total *Initialt falskt positiva utföll vid förnyad analys negativa med BD ProbeTec ET CF-analysen Reproducerbarhet Reproducerbarheten för BD ProbeTec ET CF-analysen fastställdes för pinnprov från svalg vid tre laboratorier genom analys av paneler med 24 prov som preparerades i PBS/BSA. Bestod panelen av 12 prover som var negativa för C. pneumoniae, liksom tre lågt och tre högt positiva prov för C. pneumoniae (45 respektive 75 EB/reaktion). Dessutom, var det tre lågt positiva prov som innehöll 45 EB, 4 CFU och 6 celler/reaktion av C. pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) respektive M. pneumoniae (MP), och tre högt positiva prov, vardera innehållande 75 EB, 65 CFU respektive 1 celler/reaktion av dessa organismer. En undersökare vid var och en av laboratorierna testade panelerna en gång per dag under tre dagar. Resultaten sammanfattas i tabell 11. Tabell 11: BD ProbeTec ET CF-analys: Estimering av reproducerbarhet av pinnprov från svalg efter provnivå Mellan dag inom laboratoriet Mellan olika laboratorier Panelmedlem N % Korrekt Medelvärde för PAT SD % CV SD % CV CP-HÖG 27 1 % 51,2,31,61,11,21 CP-LÅG 27 1 % 5,7,,,29,58 CP/LP/MP-HÖG 27 1 % 51,8,26,51,, CP/LP/MP-LÅG 27 1 % 5,6,,,, Negativt 18 1 %, IAC med CP-negativa prover 18 1 % 52,,17,32,6,12 15

16 TILLGÄNGLIGHET Följande BD ProbeTec ET-produkter finns tillgängliga: Kat. nr. Beskrivning BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay 4473 BD ProbeTec ET spädningsvätska för pinnprov och kontrollkit BD ProbeTec ET spädningsvätska för luftvägar och medier samt and kontrollkit BD ProbeTec ET tillbehörskit 4471 BD ProbeTec ET tillbehörskit ll BD ProbeTec ET pipettspetsar, 6 x BD ProbeTec ET 2 ml provrör, lock och etiketter, BD ProbeTec ET provrör (4. ml) och lock, vardera BD ProbeTec ET 2 ml lock, BD ProbeTec ET Instrument, utanför USA BD ProbeTec ET Instrument, USA & Kanada BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare, 22V 4448 BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare, 12V BD ProbeTec ET lyseringsvärmare, 22V BD ProbeTec ET lyseringsvärmare, 12V BD ProbeTec ET Pipettor 4452 BD ProbeTec ET lyseringsställ REFERENSER 1. Bartlett, J.G., Dowell, S. F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2. Guidelines from the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 31: Murray et al Manual of clinical microbiology, 7th edition, ASM Press. 3. Dowell, S.F., Peeling, R.W., et.al. 21. Standardizing Chlamydia pneumoniae Assays: Recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis 33: National Committee for Clinical Laboratory Standards. 21. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd. ed. NCCLS, Wayne, Pa. 5. Garner. J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 7. Directive 2/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/1/2, p Isolation of Chlamydia ssp. in cell culture. In: Clinical microbiology procedures handbook, Isenberg HD (Ed.), 1992, American Society for Microbiology, Washington DC, pp Mandell, L.A., Bartlett, J.G., et. al. 23. Update of practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in immunocompetent adults. Clin Infect Dis 37:

17 17

18 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: Alconox is a trademark of Alconox, Inc. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BBL, BD ProbeTec and CultureSwab are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 28 BD.