Metoder för detektion av norovirus i vatten

Relevanta dokument
Norovirus i vatten - vad vet vi och hur kan kunskapen användas?

VISK. Hur går vi tillväga för att analysera virus från. Oslo Slutkonferens VISK 19 mars vattenprover? Fredrik Nyström

Virus i vatten metoder för detektion av norovirus

Norvid norovirus i svenska råvattentäkter

- Analys av norovirus i dricksvattenberedningen

Nationella dricksvattenkonferensen i Göteborg den april 2013

NORVID. Riskanalys med MRA och GDP baserad på långtidsundersökning av norovirusförekomst i svenska ytvattentäkter. Rapport Nr

2011 års noro/sapoviruspanel och en tillbakablick på fecesjakten. Kjell-Olof Hedlund Equalis Användarmöte 13 mars 2012

dricksvattenberedningen

Kartläggning av virusförekomst i Göta älvregionen

Utvärdering av BD MAX enteric parasite panel på ett kliniskt laboratorie

Johan Nordgren, Andreas Matussek, Ann Mattsson, Lennart Svensson, Per-Eric Lindgren Division of Medical Microbiology/Molecular Virology Department of

Calicivirus och andra virus. Kjell-Olof Hedlund Enheten för Speciell Diagnostik Smittskyddsinstitutet

DNA-labb / Plasmidlabb

5/201. Från Unilabs Laboratoriemedicin, Stockholm gällande fr.o.m (om inget annat datum anges i texten)

DNA FRÅN BLOD & KINDCELLER

Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter

Varför vill vi veta något om vilka patogener som finns i avloppsvattnet och hur gör vi?

VIRUS I VATTEN SKANDINAVISK KUNSKAPSBANK ARBETSPAKET 2 EPIDEMIOLOGI

Vinterkräksjuka. Säsongen Fredrik Idving Hygiensjuksköterska

Laboratoriemetod för att manuellt rena DNA från ett prov på 0,5 ml

Mikrobiologisk riskbedömning av dricksvattenförsörjning (QMRA) Thomas Pettersson Chalmers tekniska högskola, Göteborg

Minska samhällets sårbarhet för vattenburen virussmitta i ett förändrat klimat VISK

Slutrapport - Calicivirussäsongen 2013/2014

MycXtra Fungal DNA Extraction Kit

- Sänkt pris för B-PEth den bästa alkoholmarkören. - Ändrade referensintervall för barn och vuxna: P-Kreatinin P-Ferritin P-Järn P-Transferrin

Dricksvattenberedning och Risk för Magsjuka: En Multi-City Studie av Telefonsamtal till 1177 Vårdguiden

Varför vill vi veta något om vilka patogener som finns i avloppsvattnet och hur gör vi?

Hydrodynamisk modellering av mikrobiell vattenkvalitet

Från Unilabs Laboratoriemedicin, Västra Götaland - gällande fr.o.m (om inget annat datum anges nedan)

Analys av råvatten och dricksvatten vid oväntad mikrobiologisk förorening

Gastro och lite annat

Cirkulerande cellfritt DNA

Mikrobiologisk riskbedömning för grundvattentäkter

Laboration v.40 Detektion av Legionella pneumophilia med nestad PCR

Mikrobiologiska dricksvattenrisker Riskklassning av svenska ytråvatten

Tillämpning av olika molekylärbiologiska verktyg för kloning av en gen

Hepatit C Statistik. Smittskydd, , Eva Lundmark

CMV/EBV Molekylär diagnostik. Annika Allard Klinisk Mikrobiologi/Virologi Norrlands Universitetssjukhus

Mikrobiologins tekniksprång Dr. Erik Nygren SP Food and Bioscience

VISK minska samhällets sårbarhet för vattenburen virussmitta trots förändrat klimat

Hur kan GIS-modellering utgöra ett stöd för mikrobiell riskvärdering? Johan Åström, Tyréns AB

Laboration DNA. Datum:16/11 20/ Labgrupp: 11 Laboranter: Johanna Olsson & Kent Johansson

Klimatförändringar, råvattenkvalitet, mikrobiella risker genom hälsostudier. Andreas Tornevi

Förbättrad bekämpning av HIV resistens i Afrika och Sverige. Professor Anders Sönnerborg

edna i en droppe vatten

Kunde vi ha undgått Östersundsutbrottet. riskvärdering? Norsk vannförening 30 jan Anette Hansen Smittskyddsinstitutet Stockholm

Dricksvattenburna sjukdomsutbrott

Estelle Larsson Doktorand i miljövetenskap 11/25/2011 1

ChromoQuant In vitro diagnostiskt test kit för analys av vanligen förekommande aneuploidier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt i X och Y.

Linköpings Universitet. Laboration i genteknik

Downstream Processing

Chlamydophila pneumoniaeantikroppar

Utveckling av multiplex realtids PCR metod för detektion av kalvdiarrévirus hos nöt

Disposition. snabb bedömning med ny metod. Jordbundna sjukdomar Detektionsteknik Markartor Jordanalyser Ärtrotröta

Värdering av risker för en relativt opåverkad ytvattentäkt. Modellering av Rådasjön med stöd av inaktiveringsstudier och mikrobiell källspårning

ChromoQuant In vitro diagnostiskt test kit för analys av vanligen förekommande aneuploidier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt i X och Y.

Enterovirus D68 diagnostik vid utbrott. Malin Grabbe Klinisk mikrobiologi, Solna Karolinska Universitetslaboratoriet

Hur stor är risken att bli magsjuk av dricksvatten? Magnus Simonsson Jonas Toljander

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

System Metod/ Mätprincip Utrustning Enhet undersökning Rubellavirus Anti-Rubella IgG. Blod Antikropps-bestämning (IgG)

QIAsymphony DSP DNA Kits

Ackrediteringens omfattning

Mikroplaster i svenska ytvatten

Norovirus Food-borne Disease and Infectious Gastroenteritis

VINTERKRÄKSJUKAN Symtom, smitta, kostnader SMI-dag 22 mars Bo Svenungsson Smittskydd Stockholm

Sören Andersson. Professor, prefekt, överläkare. Institutionen för medicinska vetenskaper Örebro universitet & Laboratoriemedicin, Region Örebro län

/LGM. Amplifiering och analys av humant mitokondrie-dna med hjälp av PCR teknik och agarosgelelektrofores

Säkert dricksvatten. ProMaqua. Presenterad av Bengt Ottefjäll.

Cryptosporidium (och Giardia) vad är det för något? Kan det finnas i min vattentäkt? Anette Hansen Smittskyddsinstitutet Livsmedel och Vatten

Ackrediteringens omfattning Klinisk mikrobiologi

Undersökningar av mikroplast bakgrund, problembeskrivning och resultat från svenska vatten

Fisk, kräftor & musslor som edna Patrik Bohman, SLU Aqua Sötvattenslaboratoriet

Eluering av transglutaminasantikroppar från tarmbiopsier. En pilotstudie från Örebro

Lagerrensning! Upp till 70% rabatt!

Kapitel 15. Syra-basjämvikter

Polymerase Chain Reaction

Kvantitativ mikrobiell riskanalys för hälsosamt dricksvatten i Örebro

Ackrediteringens omfattning Unilabs AB, Laboratoriemedicin, molekylärbiologi

Tillämpning av olika molekylärbiologiska verktyg för kloning av en gen

MYKOBAKTERIER INFORMATION

FilmArray - helautomatiserad multiplex likvordiagnostik

Slutrapport - Förstudie om Alternariaförekomst i potatis och behandlingseffekter 2013 i Mellansverige.

Analysmetoder för norovirus i ytvatten

MYKOBAKTERIER INDIKATION

Att arbeta med och koordinera ett Interreg finansierat projekt VISK

Provtagningsanvisningar Norovirus (Calicivirus) Avgränsning/Bakgrund. Provtagning. Ange på remissen

INTRODUKTION...5 MATERIAL OCH METODER...6 GASKROMATOGRAFI...7 UPPARBETNING AV LT-8 FRÅN BLODPROV...7 RESULTAT OCH DISKUSSION...7

Dricksvattenkonsumtionens påverkan på frekvensen magsjuka. Jonas Toljander & Magnus Simonsson Livsmedelsverket

Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System BRUKSANVISNING FÖR PRODUKTEN AS1155.

Ackrediteringens omfattning Unilabs AB, Laboratoriemedicin, molekylärbiologi 1329

Tissue_LC_200_V7_DSP och Tissue_HC_200_V7_DSP

artus EBV QS-RGQ Kit Prestandaegenskaper Maj 2012 Sample & Assay Technologies Analytisk sensitivitet plasma artus EBV QS-RGQ Kit, Version 1,

KI Biobank Tjänstekatalog

Riskkarakterisering och riskhantering av Cryptosporidium. Anette Hansen

Detektion av Streptococcus agalactiae (GBS) från selektiv odlingsbuljong med MALDI-TOF och illumigene

Handbok för QIAamp DSP Virus Kit

Mikrobiologiska dricksvattenrisker Riskklassning av svenska ytråvatten

Minska samhällets sårbarhet för vattenburen virussmitta i ett förändrat klimat VISK

Sample & Assay Technologies. artus C. trachomatis TM PCR Kit Handbok. Januari Kvantitativ in vitro-diagnostik

Transkript:

Metoder för detektion av norovirus i vatten En sammanställning av genomförda projekt Elisabeth Hallin 2016-11-23

Innehåll Bakgrund Syfte Informationsinhämtning Metoder och Resultat Slutsatser Sid 3. 2016-11-23

Bakgrund Norovirus är en vanlig orsak till gastroenterit världen över. Norovirus kan spridas via kontaminerat vatten. Finns olika genogrupper, svårt att odla. Norovirus, elektronmikroskop. Foto: Kjell-Olof Hedlund Flera vattenburna utbrott har konstaterats i Sverige där samma sekvens av norovirus har påvisats i vatten och patientprover. Flera forskargrupper håller på att utveckla metoder för att påvisa norovirus i vatten. Svenskt Vatten kontaktade Folkhälsomyndigheten med förslag om sammanställning av resulaten från olika projekt. Sid 4. 2016-11-23

Syfte Syftet med projektet är att sammanställa befintlig kunskap inom virus i vatten-området. Var står vi nu, vilken kunskap har vi och vilka kunskapsluckor finns? Projektresultat leder till bättre samordning inom området och att resurserna nyttjas effektivare. En typ av filtreringsutrustning. Sid 5. 2016-11-23

Informationsinhämtning Litteratursökning med hjälp av informationsspecialist på Folkhälsomyndigheten Genomgång av befintliga projektrapporter Genomgång av relevanta publikationer från Svenskt Vattens rapportdatabas. Inbjudan till aktörer inom virus i vatten-området att inkomma med egna eller förslag på andra gruppers arbete inom området Sid 6. 2016-11-23

Inkluderade projekt (avslutade) FOOD-VIRUS Reducing the risk from foodborne viruses in the Nordic countries, 2008-2011 NORVID Humanpatogena virus i Svenska vattentäkter, 2009-2012 VISK Virus i vatten Skandinavisk kunskapsbank, 2010-2013 Viroclime Impact of climate change on the transport, fate and risk management of viral pathogens in water, 2010-2012 Sid 7. 2016-11-23

Andra publikationer (urval) Schultz et al. 2011, Collaborative validation of a rapid method for efficient virus concentration in bottled water. International journal of food microbiology. Maunula et al. 2012, Presence of human noro- and adenoviruses in river and treated wastewater, a longitudinal study and method comparison. Journal of water and health. Grøndahl-Rosado et al. 2014, A One Year Study on the Concentrations of Norovirus and Enteric Adenoviruses in Wastewater and A Surface Drinking Water Source in Norway. Food and environmental virology. Petterson et al. 2015, Variability in the recovery of a virus concentration procedure in water: Implications for QMRA. Water research. Sid 8. 2016-11-23

NORVID Förfiltrering Flockulering Viruskoncentrering Eluering Sekundär koncentrering Nucleinsyraextraktion RT-PCR Realtids-PCR Glasfiberfilter MgCl 2 Hydrofilt filter Basisk triton-xlösning Neutralisera ph Ultrafiltrering QIAamp Viral RNA kit Illustra ready to go reverse transcriptase bead LUX Sid 9. 2016-11-23

Förfiltrering NORVID Glasfiberfilter Grøndahl-Rosado et al. 2014 Flockulering Viruskoncentrering Eluering Sekundär koncentrering Nucleinsyraextraktion RT-PCR Realtids-PCR MgCl 2 Hydrofilt filter Basisk triton-xlösning Neutralisera ph Ultrafiltrering QIAamp Viral RNA kit Illustra ready to go reverse transcriptase bead LUX NanoCeram Basisk triton-xlösning PEG NucliSense easymag Norovirus: Superscript III TaqMan Sid 10. 2016-11-23

Förfiltrering/ Förbehandling NORVID Glasfiberfilter Grøndahl-Rosado et al. 2014 Viroclime Justering av ph och konduktivitet Flockulering MgCl 2 Torrmjölk Viruskoncentrering Eluering Hydrofilt filter Basisk triton-xlösning NanoCeram Basisk triton-xlösning Omrörning Sedimentering Sekundär koncentrering Neutralisera ph Ultrafiltrering PEG Viruskonc. Resusep. Flocklarna centrifugeras Nucleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA kit NucliSense easymag QIAamp Viral RNA kit RT-PCR Realtids-PCR Illustra ready to go reverse transcriptase bead LUX Norovirus: Superscript III TaqMan Realtids- RT-PCR Ultrasense onestep Quantitative RT-PCR kit Sid 11. 2016-11-23

Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Sid 12. 2016-11-23

Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Sid 13. 2016-11-23

Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Norovirus påvisades i alla fyra provplatserna, framförallt under novfeb. Norovirus GII påvisades oftare och i högre halter än norovirus GI. Sid 14. 2016-11-23

Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Norovirus påvisades i alla fyra provplatserna, framförallt under novfeb. Norovirus GII påvisades oftare och i högre halter än norovirus GI. Har inte räknat upp resultat för processförlusten, osäkert hur många genom som är viabla och infektiösa. Sid 15. 2016-11-23

Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Norovirus påvisades i alla fyra provplatserna, framförallt under novfeb. Norovirus GII påvisades oftare och i högre halter än norovirus GI. Har inte räknat upp resultat för processförlusten, osäkert hur många genom som är viabla och infektiösa. Modell med fiktivt vattenverk visar på låg risk för norovirusspridning till konsumenter vid beräkningar med MBA och MRA. Sid 16. 2016-11-23

Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al. 2015 Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Sid 17. 2016-11-23

Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al. 2015 Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Låg korrelation mellan utbytet för mengovirus och norovirus. Sid 18. 2016-11-23

Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al. 2015 Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Låg korrelation mellan utbytet för mengovirus och norovirus Under en ettårsstudie med prover från Glomma påvisades norovirus GI i 62 % och GII i 46 % av alla prover. Sid 19. 2016-11-23

Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al. 2015 Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Låg korrelation mellan utbytet för mengovirus och norovirus Under en ettårsstudie med prover från Glomma påvisades norovirus GI i 62 % och GII i 46 % av alla prover. Data från studien användes för att QMRA-beräkningar för två vattenverk (Överby och Nedre Romerike). Båda visade på god avskiljningsförmåga under normala förhållanden. Sid 20. 2016-11-23

Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Sid 21. 2016-11-23

Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Utbyte varierade med virus: 49 % för adenovirus, 8 % för norovirus GII Sid 22. 2016-11-23

Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Utbyte varierade med virus: 49 % för adenovirus, 8 % för norovirus GII Tillsats av saltvatten sänkte Cq med 1-2 cykler Sid 23. 2016-11-23

Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Utbyte varierade med virus: 49 % för adenovirus, 8 % för norovirus GII Tillsats av saltvatten sänkte Cq med 1-2 cykler Matrisen verkar påverka RT steget då man såg hämning av RNA virus men inte DNA virus. Sid 24. 2016-11-23

Maunula et al. 2012 Ettårsstudie Förfiltrering /Förbehandling Köttglycinbuffert Viruskoncentrering Eluering /resuspendering Waterra Negativt filter Millipore AVL-buffert Nukleinsyraextraktion Realtids-RT-PCR QIAamp Viral RNA kit Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Adenovirus: in-house realtids-rt-pcr Sid 25. 2016-11-23

Maunula et al. 2012 Ettårsstudie Metodjämförelse Förfiltrering /Förbehandling Waterra Waterra ph justering 3.5 Köttglycinbuffert - 80 C fryst prov Viruskoncentrering Negativt filter Millipore Negativt filter Millipore Glasull Frystorkning Eluering /resuspendering Nukleinsyraextraktion Realtids-RT-PCR AVL-buffert NucliSense lysisbuffert + dest. vatten Köttglycinbuffert Köttglycinbuffert Syraprecipitering centrifug. PBS QIAamp Viral RNA kit NucliSense NucliSense NucliSense Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Adenovirus: in-house realtids-rt-pcr Sid 26. 2016-11-23

Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, norovirus framförallt under vintermånaderna (dec-april). Sid 27. 2016-11-23

Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, 1 gång/månad 5 provplatser under ett år. Norovirus framförallt under vintermånaderna (decapril). Norovirus GII påvisades signifikant oftare än norovoris GI. Totalt påvisades norovirus i 30 % av proverna. Sid 28. 2016-11-23

Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, 1 gång/månad 5 provplatser under ett år. Norovirus framförallt under vintermånaderna (decapril). Norovirus GII påvisades signifikant oftare än norovoris GI. Totalt påvisades norovirus i 30 % av proverna. Jämförelsestudie genomfördes senare då man tog prover under februari, mars och maj vid 4 olika punkter. Sid 29. 2016-11-23

Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, 1 gång/månad 5 provplatser under ett år. Norovirus framförallt under vintermånaderna (decapril). Norovirus GII påvisades signifikant oftare än norovoris GI. Totalt påvisades norovirus i 30 % av proverna. Jämförelsestudie genomfördes senare då man tog prover under februari, mars och maj vid 4 olika punkter. Under tremåndersstudien påvisades inte norovirus i något prov. Adenovirus påvisades i 11 av 12 prover. Glasullmetoden påvisade adenovius oftast. Sid 30. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Viruskoncentrering D Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Kött-glycin buffert ph 9.5 ph justering Sekundär koncentrering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid 31. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Viruskoncentrering A D Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert Kött-glycin buffert ph 9.5 Sekundär koncentrering CIM QA monolitisk kolonn, anjonutbyte Ultracentrifugering ph justering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid 32. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Viruskoncentrering A B D CIM QA monolitisk kolonn, anjonutbyte Positivt filter Zetapor Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert NucliSense easymag lysisbuffert Kött-glycin buffert ph 9.5 ph justering Sekundär koncentrering Ultracentrifugering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense easymag alt minimag NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid 33. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Viruskoncentrering A B C D CIM QA monolitisk kolonn, anjonutbyte Positivt filter Zetapor Positivt filter Sartorius Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert NucliSense easymag lysisbuffert Kött-glycin buffert ph 9.5 Kött-glycin buffert ph 9.5 ph justering Sekundär koncentrering Ultracentrifugering Ultracentrifugering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense easymag alt minimag QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid 34. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Sid 35. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Metod B (positivt filter med easymag/minimag) hade signifikant lägre Ct för både felint calicivirus och hepatit A virus relativt till metod D jämfört med de andra metoderna. Sid 36. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Metod B (positivt filter med easymag/minimag) hade signifikant lägre Ct för både felint calicivirus och hepatit A virus relativt till metod D jämfört med de andra metoderna. Metod B utvärderas vidare i en samarbetsstudie mellan olika laboratorier. Flaskvatten spikades med felint calicivirus, hepatit A virus, norovorius GI och norovorus GII. Sid 37. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Metod B (positivt filter med easymag/minimag) hade signifikant lägre Ct för både felint calicivirus och hepatit A virus relativt till metod D jämfört med de andra metoderna. Metod B utvärderas vidare i en samarbetsstudie mellan olika laboratorier. Flaskvatten spikades med felint calicivirus, hepatit A virus, norovorius GI och norovorus GII. Utbytet vid samarbetsstudien var i medelprocent 61 % för norovirus GI, 35 % för norovirus GII, 34 % för felint calicivirus och 51 % för hepatit A virus, men det var stor variation i utbyte mellan labben för samma virus. Sid 38. 2016-11-23

Slutsats Olika metoder varierar i Metodologin Förfiltrering/förbehandling (ingen, waterra, glasfiberfilter, ph, konduktivitet) Adsorption (negativa filter, postiva filter, glasull, flockulering, frystorkning) Elueringsmetod/lösning (AVL-buffert, kött-glycin, NucliSense lysisbuffert, fosfatbuffert, triton-x-lösning) Sekundär koncentrering (ingen, ultrafiltrering, PEG, ultracentrifugering) Nukleinsyraextraktion (QIAamp, NucliSense) Separat RT och realtids-pcr eller one-step Vilka virus som används som processkontroll Mengovirus, felint calicivirus, murint norovirus, hepatit A virus, adenovirus Om man anger utbyte och/eller koncentration Anger koncentration i genomkopior/l eller PCR units/l, utbyte i procent Sid 39. 2016-11-23

Slutsats I stort sett alla drar slutsatsen att det finns norovirus i ytvatten under framförallt de kalla månaderna. Det finns stora processförluster inom metoderna. Hämning sker i PCR-stegen. Vattenkvalitén verkar påverkar utbytet. Sid 40. 2016-11-23

Slutsats I stort sett alla drar slutsatsen att det finns norovirus i ytvatten under framförallt de kalla månaderna. Det finns stora processförluster inom metoderna. Hämning sker i PCR-stegen. Vattenkvalitén verkar påverkar utbytet. Gemensam syn på kontroller och utvärdering av metoderna! Sid 41. 2016-11-23

Mål Målet med projektet är att sammanställa vilken kunskap som finns i framförallt Sverige, men även i övriga Norden, om: Vilka metoder som används i Norden för analys av virus i vatten, samt vilka styrkor och svagheter dessa har Hur resultaten av analyserna tolkas Hur projekten har använt sina resultat i MRA/GDP beräkningar Vilka virushalter som har studerats och vilka halter som har uppmätts i olika typer av vatten Befintlig kunskap om olika barriärers effekt på virus i vatten Vad betydelsen för folkhälsan är Vilka kunskapsluckor som finns Sid 43. 2016-11-23

Förfiltrering/ Förbehandling Norvid Glasfiberfilter 4,5 l Grøndahl-Rosado et al. 2014 Viroclime Justering av ph och konduktivitet 10 l Flocculering MgCl 2 4,5 l Torrmjölk 100 ml till 10 l vatten Viruskoncentrering Hydrofilt filter 4 l NanoCeram 5 l Omrörning 8-10 timmar Eluering Basisk triton-x-lösning 15 ml Neutralisera ph Basisk triton-x-lösning Eluering med 40 ml Sedimentering 8-10 timmar Sekundär koncentrering Ultrafiltrering, 50 kda 15 ml till 200 µl PEG Resuspenderas i 3 ml NucliSense lysis buffer Viruskonc. Resusep. Flocclarna centrifugeras Pellet löses i 10 ml PBS Nucleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA kit 60 µl NucliSense easymag 3 ml används, ger 25 µl QIAamp Viral RNA kit RT-PCR Illustra reday to go reverse transcriptase bead 8 µl används, ger 30 µl cdna Norovirus: Superscript III 11 µl RNA ger 20 µl cdna Realtids- RT-PCR Ultrasense one-step Quantitative RT-PCR kit Realtids-PCR LUX 2 µl cdna används TaqMan 2 µl cdna används Sid 44. 2016-11-23

Schultz et al. 2011 Viruskoncentrering CIM QA monolitisk kolonn, anjon-utbyte 1,5 l Positivt filter Zetapor 1,5 l Positivt filter Sartorius 1,5 l Positivt filter Zetapor 1,5 l Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert 15 ml NucliSense easymag lysisbuffert 3 ml Kött-glycin buffert ph 9.5 3 ml Kött-glycin buffert ph 9.5 10 ml ph justering 8,0 Sekundär koncentrering Ultracentrifugering Pellet resuspenderas i 560 µl AVL buffert Ultracentrifugering Pellet resuspenderas i 100 µl PBS buffert Ultrafiltrering 500 µl Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit 100 µl NucliSense easymag alt minimag 100 µl QIAamp Viral RNA Mini kit 100 µl NucliSense minimag 100 µl Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr (Invitrogen) 5 ul RNA används Sid 45. 2016-11-23

Maunula et al bild 2 från pek. Ettårsstudie Metodjämförelse Förfiltrering /Förbehandling Waterra 3 l Waterra 3 l ph justering 3.5-80 C fryst prov Kött-glycinbuffert 50 ml Kött-glycinbuffert 50 ml Viruskoncentrering Negativt filter HA 3 l Negativt filter HA 3 l Glasull 3 l Frystorkning 30-50 ml Eluering /resuspendering AVL-buffert 1 ml NucliSense lysisbuffert + dest. vatten Totat 3,5 ml Kött-glycinbuffert Elueras till 50 ml Syraprecipitering, centrifugering Löses i 8 ml PBS PBS Prov löses i 1 ml Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA kit 60 µl NucliSense 3,5 ml extraheras NucliSense 1 ml extraheras NucliSense 1 ml extraheras Realtids-RT-PCR Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Adenovirus: in-house realtids-rt-pcr Sid 46. 2016-11-23

Avgränsning Rapporten är inte en handlingsplan utan en kunskapssammanställning. Sammanställningen kommer inte rapportera om förhållanden utanför Norden, om inte dessa anses vara av särskilt intresse. Sid 47. 2016-11-23