Vitamin D Lc-Ms/Ms Benny Larsson Laboratorie Medicin Skåne Klinisk Kemi Malmö
25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2
25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2
Vilken metabolit skall analyseras? Även genom kost och Supplement D3 + D2 UV-B Sol 7-dehydrocholesterol Pre-Vitamin D Hud D3 Lever + 3-epi form Förrådsformen nmol/l 25(OH)D3 + D2 Aktiva formen pmol/l Njure 1,25(OH)2D3+D2 Målorgan
Shimadzu Prominence Applied API 4000 Q0 Q1 Q2 Q3 1.Spänning (V) Detektor 2.Frekvens (Hz) 3.Polaritet (±) Jonkälla ESI/APCI
UV/VIS detektor Avgasning Kolonnugn + kolonnväxlare Pumpar Rackväxlare Autoinjektor
Triple Quadrupole Sequence of Events Ion production Ion transport Ion filtering Fragmentation Ion filtering Ion detection
1. Step Ion production
Atmospheric Pressure Chemical Ionization Vitamin D Heated Nebulizer source: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) polar to unpolar and thermally stable compounds
Provupparbetning 1.Proteinfällning 2.Indunstning 3.Återlösning
Proteinfällning Fällningsplatta 100µL Serum 400µL Acetonitril/ internstandard Uppsamlingsplatta
Vacum elut Efter 60 min 4 C Proteinfällningsplatta Uppsamlingsplatta
Indunstning SPE Dry 96 Återlösning mobilfas Varm kvävgas 50 C
Deutererad Internstandard 25-OH-Vitamin D3 25-OH-Vitamin D3-d6 D= Väte(2H) med både proton och neutron i kärnan (masstal 2)
Vit D3-kvalificeringsjon Vit D3-huvudjon Internstandard-D3d6 Vit D2 383,3 / 91,1 383,3 / 211,2 389,4 / 91,1 395,5 / 91,3
Internkontroll integrering D2 D3 huvudjon D3 kvalific-jon IST IST IST
Patientprov med D2 D2=9nmol/L IST D3= 32nmol/L IST D3 kvalific-jon IST
Vit D3+D2 el bara D3? D2 form vanligt förekommande som supplement i Sverige Endast D2 form godkänt som supplement i USA (FDA) D2 formens effektivitet omtvistad, enligt vissa studier lika effektiv J Clin Endocrinol Metab. 2008 March; 93(3): 677 681. Michael F.Holick mfl Toxiciteten av D2 inte klargjord
Ex.Patientprover Malmö D3 + D2 Patienter D3 - D2 Patienter D3 - D2 250 600 D2 = 540 D3 =17 nmol/l nmol/l 200 500 400 150 Vit D2 D2 Vit Vit D3 D3 Vit 300 100 200 50 100 00 11 3 55 77 11 1313 15151717 99 11
25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2
3-epi former av 25-OH-Vitamin D3 + D2 Exakt samma moderjoner och fragment, dvs masspektrometer kan inte skilja dessa åt
3-epi-25-OH-Vit D2+D3 Lever 3-epi-1,25-(OH)2 -Vit D2+D3 Njurar
Effekter hos barn <1 år Kan ha 10-60% som epi former, orsak ej klargjord, omogenhet??? Omognad i första hydroxyleringssteget i lever Binder till Vitamin D binding protein för transport Sänker parathormon(pth) lika effektivt Calcium transporten till skelett signifikant lägre med epi-formen Binder signifikant sämre till vitamin-d receptorn i målorganen???
Referens artikel, Pub Med 1α, 25 (OH) 2-3-Epi-Vitamin D3, a Natural Physiological Metabolite... F Molnár - 2011 (2011) 1α,25(OH)2-3-Epi-Vitamin D3, a Natural Physiological Metabolite of Vitamin D3: Its Synthesis, Biological Activity and Crystal Structure with Its Receptor.... Visar på biologisk effekt hos målorgan
Metod för epi-form barn 1år Måste separeras kromatografiskt Samma provupparbetning Samma elueringslösningar, ny gradient Ny analyskolonn: Ascentis Express, 10cm 3,0mm Id 2.7µm partiklar Analystid: 12 min Analyseras på barn <1år
NIST Referensmetod Vitamin D (epi-former) 40 min
Ny metod 3-epi-Vitamin D NIST med 3-epi Vit D3 D3 3-epi-D3 6,8 min IST
NIST referensstandard med 3-epi-25-OH-Vitamin D3 Börvärde NIST: D3= 82,3 D2= 5,81 Malmö värde epi-metod: D3= 81,7 D2= 5,88 25-OH-D3 25-OH-D2 3-epi-form IST IST
Vuxen normalnivå epi-form D3 med epi-form medräknad= 49.8 utan epi= 49.2 Diff 0.6 = 1% 3-epi Vit D3
Vuxen 72 år högst epi-konc av 90 vuxenprover D3 med epi-form medräknad= 62,7 utan epi= 59 Diff 3,7 = 6%
Samma prov och upparbetning, analyserat med Epi-metod D3 = 68 nmol/l, D2 = 94 nmol/l Barn 2 mån Rutin D3 = 133 nmol/l, D2= 132 nmol/l Diff D3 Epi D3 = 65 nmol/l ( 49%) Diff D2 Epi D2 = 38 nmol/l ( 29%) Epi-D2 Epi-D3 IST IST
Barn 9 mån D3 med epi-form medräknad= 76 utan epi= 71 Diff 5 = 7%
Barn 4 mån D3 med epi-form medräknad= 41 utan epi= 34 Diff 7 = 17%
25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2
DHVD 2D kromatografi Prov renas Separation dubbla kolonner Prov 100µL injiceras Li-aduct + 7 Da Renat Prov Gradient pumpar A= 0.5mM LiAcetat i H2O B= 0.5mM LiAcetat i MeOH Tvättpumpar A= H2O B= 25% ACN i MeOH LiAcetate
Rackväxlare Autoinjektor Sciex 5500 QTrap ESI jonisering Liaduct Renat prov Tvättpumpar 2 st Gradientpumpar 2 st Li Kolonnugn 6 pos Valco-valve 10-ports System-controller HPLC
DHVD kalibreringskurva DHVD3 IST-d6
Pat-prov DHVD 60 picomol/l 1,25-di-hydroxy-Vit D3 60 picomol/l Ref.omr 36 120 picomol/l
Tack för visat intresse Frågor?