Hemoglobinutredningar på Karolinska Christin Sisowath Sjukhuskemist Karolinska Universitetslaboratoriet, Klinisk kemi
Analyser på Karolinska för hemoglobinutredningar Hemoglobinfraktioner HPLC (HbA 2 och HbF) Elektrofokusering (IEF) Hb, MCH och Ret He Masspektrometri PCR-RFLP Hb S Hb E Hb Lepore Hb Tacoma Sekvensering (HBA1, HBA2, HBB) www.uic.edu α-thalassemi (α-globin Strip Assay) β-thalassemi (Klinisk genetik, Karolinska)
Hemoglobinfraktioner Vid utredning av hemoglobinvarianter och thalassemi Hemoglobinfraktioner innefattar Hemoglobin A 2 (α 2 δ 2 ) Hemoglobin F (α 2 γ 2 ) Elektrofokusering
HbA2 och HbF mäts kvantitativt med jonbyteskromatografi (HPLC) HbA 2 och HbF separeras från övriga hemoglobinfraktioner och elueras med saltgradient Eluatet passerar en flödescell och absorbansen mäts Ytan under topparna beräknas och svaret fås i % av totalt hemoglobin
HbA 2 Vuxna normalt: 2-3% av totala hemoglobinmängden Högre halt HbA 2 Heterozygot β-talassemi (β-thalassemia minor) ca dubblerad halt Vissa β-varianter, såsom HbS lätta stegringar Lätt sänkt halt HbA 2 α-talassemi järnbrist
HbF Vuxna normalt: <1% av totala hemoglobinmängden Högre halt HbF β -thalassemia major vid vissa genetiska tillstånd (hereditär persistens av HbF, HPFH) ibland vid β -thalassemia minor (lätt förhöjd) olika speciella sjukdomstillstånd
Elektrofokusering Elektrofokusering, IEF, för att utesluta tillstånd utan HbA 2 - ökning som fenotypiskt liknar heterozygot β -thalassemia (β -thalassemia minor), som t.ex. förekomst av Hb Lepore. Vi överväger att avstå från rutinmässig IEF
Hemoglobinfraktioner Utöver HPLC och elektrofokusering görs även Hb MCH (Hemoglobinmassa) Ret He (Retikulocythemoglobin equivalent) och ibland (Hb, instabilt)
masspektrometri Hemoglobinfraktioner
Masspektrometri Analys av Hb-fraktioner på masspektrometri utförs vid fall med oklar erytrocytos där elektrofokusering gett normalt resultat när elektrofokusering eller kromatografi inger misstanke om förekomst av hemoglobinvariant och man önskar kartlägga om α- eller β-variant
Masspektrometri Medelmassan av α- och β-globin kedjan förändras lika mycket som masskillnaden mellan den nya och den utbytta aminosyra Skillnaden i molekylmassan som uppstår vid utbyte av en aminosyra är mellan 0 till 129 Da. α-globin kedjan:15126.38 Da β-globin kedjan: 15867.24 Da
Masspektrometri Samma masskillnad kan uppstå vid olika aminosyrautbyten Undersökning av intakt globin ger inte information om var i peptiden utbytet skett.
Masspektrometri Bedömningen av möjliga aminosyrautbyten med avseende på: Vilka som är förenliga med kända punktmutationer Utifrån variantens isoelektriska punkt, IEF
Hemoglobinfraktioner masspektrometri DNA-analyser: PCR-RFLP Sekvensering hybridisering
Hb S med PCR-RFLP I β-globinkedjan: glutaminsyra valin, aminosyraposition 6 För att skilja på homozygot Hb S och heterozygot Hb S och β-noll-thalassemi Vid misstänkt mönster vid elektrofokusering eller HPLC DNA analys
15* 37 53 88 99 199 297 1500* 0 Fluorescence Hb S med PCR-RFLP Ej muterad HbS 201, 96, 89/88, 49/37 297 89/88, 49/37 100 Htz kontr.hbs 90 80 70 297 60 50 40 30 20 10 96 201 0-10 20 40 60 80 100 120 Time (seconds)
HbE med PCR-RFLP I β-globinkedjan: glutaminsyra lysin, aminosyraposition 26 För att skilja mellan homozygoti för HbE respektive kombination av heterozygoti för HbE och beta-noll-thalassemi i de fall där HbE är den helt dominerande hemoglobinformen. Vid misstänkt mönster vid elektrofokusering eller HPLC DNA analys
Hb Lepore med PCR-RFLP Samma fenotyp som heterozygot β-thalassemi (βthalassemia minor). Ingen HbA 2 -stegring 3 olika Hb Lepore: Hb Lepore Boston/Washington: δ-globin (aa 1-87) och β-globin (aa 116-146) Hb Lepore Baltimore: δ-globin (aa 50) och β-globin (aa 86) Hb Lepore Hollandia: δ-globin (aa 22) och β-globin (aa 50)
Hb Lepore Boston/Washington med PCR-RFLP Del av -genen 417 bp Del av -genen Ingen PCR produkt bildas PVU II klyvningsställe Fusion av - och -generna Efter klyvning med PVU II 249 bp 166 bp
Hb Tacoma med PCR-RFLP Analys av HbA1c med HPLC patienten har minst 30% lägre nivå.
Hb Tacoma med PCR-RFLP I β-globinkedjan: arginin serin, aminosyraposition 30 1612 bp stort fragment amplifieras från β-globingenen Klyver med restriktionsenzymet Bsl I Vildtyp 168 130 704 610 Tacoma 168 834 610
α-thalassemi Oftast större deletioner Multiplex-PCR (Tan et al, Blood. 2001 Jul 1;98(1):250-1 ) α- globin strip assay (ViennaLab) 3 PCR reaktioner 2 hybridiseringsstrip
α-thalassemi α- globin strip assay (ViennaLab)
β-thalassemi Herlev Karolinska, Klinisk genetik Sekvensering och gap PCR enligt Chan et al (Am J Clin Pathol 2010;133:700-707)
Sekvensering Alfaglobin HBA2 kodande delen av exon 1, 2 och 3 HBA1 exon 1, 2 och 3 Betaglobin: exon 1, 2 och 3
Erytrocytosutredning Lokalt intresse för familjär erytrocytos (högt Hb, ej PCV)
Utredning av högt Hb-värde S-EPO lågt normalt- högt ja JAK2 mutation nej Polycytemia vera EPO-receptorn Sekvensering av del av exon 8 Hb-variant VHL mutation: PCR-RFLP för Chuvash (Arginin tryptofan i aminosyraposition 200) Sekvensering av exon 1, 2 och 3 (kodande delen)
Sammanfattning Hemoglobinfraktioner HPLC (HbA 2 och HbF) Elektrofokusering (IEF) Hb, MCH och Ret He Masspektrometri PCR-RFLP Hb S Hb E Hb Lepore Hb Tacoma Sekvensering (HBA1, HBA2, HBB, VHL, EPOR) α-thalassemi (α-globin Strip Assay) inkl Hb Constant Spring β-thalassemi (Klinisk genetik, Karolinska)
TACK! Frågor? Maila christin.sisowath@karolinska.se