Neisseria meningitidis 2010

Susanne Jacobsson Datum: 2011-03-03 Sidan 1 av 10 Neisseria meningitidis 2010 Årsrapport avseende serogruppering, genosubtypning och antibiotikakänslighet hos svenska Neisseria meningitidis stammar samt direkt PCR diagnostik vid bakteriell meningit. Sändlista: Samtliga svenska Kliniskt Mikrobiologiska laboratorier, Infektionskliniker och Smittskyddsenheter SMI: generaldirektör, chef för epidemiologen samt kvalitetsansvarig SMI s motsvarigheter i Norden ECDC: Johan Giesecke, Karl Ekdahl SoS: Anders Tegnell English version to ECDC, EMGM with the Ref. laboratories in Europe, CDC, Australia, New Zeeland. Totalt har 98 N. meningitidis (MC)-isolat från 94 patienter sänts in från de kliniska mikrobiologiska laboratorierna i landet och undersökts i Örebro under 2010. Isolat från likvor och/eller blod har karakteriserats från totalt 56 patienter. Den samlade bilden av invasiv meningokocksjukdom i Sverige för år 2010 fås genom sammanslagning av aktuell rapport med de obligatoriska kliniska anmälningarna som går till Smittskyddsinstitutet (SMI). Publikation av totalbilden kommer från SMI, Solna i samarbete med vårt referenslaboratorium där även mortalitet och åldersfördelning m.m. redovisas. Isolat av MC från likvor/blod, svalg/luftvägar inklusive konjunktiva, urogenitalt och annan lokal (punktat) fördelade på serogrupp presenteras i Tabell I. Ett isolat redovisas per patient. Tabell II a, b och c visar resultatet av genosubtypningen för de 57 invasiva isolaten. För vår internationella redovisning har Tabell III utarbetats. Genetisk subtypning, s.k. genosubtypning, utförs med ering av pora genens tre mest variabla regioner (VR1, VR2 och VR3). Sedan 2006 påvisas även uttrycket av PorA proteinet som komplement till genetiken. Tekniken är co-agglutination med monoklonal antikropp (4BG4-E7) som binder till en relativt konservativ del av PorA proteinet. Alla 57 invasiva MC isolaten var genosubtypningsbara, medan uttryck av PorA proteinet kunde påvisas i 52/57=91%. PCR diagnostik på likvor, blod och punktat har genomförts med ett optimerat protokoll för att påvisa artspecifikt bakteriellt DNA (ctra för meningokocker) och bakteriellt DNA generellt (genen för 16S rrna), ref 11. POSTADRESS BESÖKSADRESS TELEFON TELEFAX ORG.NR Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi Universitetssjukhuset Örebro 701 85 Örebro Södra Grev Rosengatan Ingång F2 Örebro 019-602 15 20 019-12 74 16 232100-0164 E-POST susanne.jacobsson@orebroll.se INTERNET www.orebroll.se/uso/mikrobiol

Sidan 2 av 10 MC-stammar isolerade från likvor, blod och punktat. (antal patienter = antal stammar) Serogrupp B. De 12 invasiva serogrupp B MC-isolaten (7 sulfaresistenta, d.v.s. MIC >10 mg/l) tillhörde 11 olika genosubtyper vilka presenteras i Tabell II a. Serogrupp C. De 19 invasiva serogrupp C MC-isolaten (15 sulfaresistenta) tillhörde 7 olika genosubtyper, se Tabell II b. Flest serogrupp C isolat hade genosubtyp P1.5,2,36-2 (n=9), P1.7,16-29,35 (n=4), P1.5-1,10-8, 36-2 (n=2). Övriga genosubtyper återfanns bara hos enstaka isolat. Serogrupp Y. De 22 invasiva serogrupp Y MC-isolaten (16 sulfaresistenta) tillhörde 6 olika genosubtyper, se Tabell II c. Flest serogrupp Y isolat hade genosubtyp P1.5-2,10-1,36-2 (n=15), P1.5-1,2-2,36-2 (n=3) övriga genosubtyper återfanns bara hos enstaka isolat. MC DNA påvisat från normalt steril lokal. (likvor, blod, punktat) Under 2010 analyserades 89 prover med PCR-teknik avseende bakteriellt DNA (ref 11). MC DNA påvisades i 9 av dessa prover, fem var likvorprover, tre rena DNA preparationer och ett blodprov. Genogrupp erhölls från alla och genosubtyp från 7 av 9 på genetisk väg direkt från provet (ref 1). Penicillin känsligheten skattades också med ering av pena genen direkt från några odlingsnegativa likvor prov (ref 7). De flesta proverna kom från andra laboratorier i landet. Sekvensering av bakteriellt DNA (16S rdna) har också använts för speciesbestämning.

Sidan 3 av 10 Antibiotikakänslighet. Alla MC-isolat har testats med Etest avseende MIC för pcg, cefotaxim, kloramfenikol, ciprofloxacin, meropenem och rifampicin. Behandlas patienten med annat antibiotikum görs alltid test även mot detta. Dessutom testas sulfakänslighet, vilket är en epidemiologisk markör som kompletterar den övriga karakteriseringen, se ovan. Under året har choklad Mueller Hinton II agar medium (5 % hästblod) ersatts med Mueller Hinton II agar medium (5 % hästblod och NAD) enligt rekommendationer internationellt. Av likvor/blod/punktat-isolaten hade 8/57=14 % nedsatt känslighet för pcg (MIC >0,064 mg/l). Tidigare proportioner från 1999 och framåt ses i Figur 1 nedan. Alla stammar hade cefotaxim-mic 0,008 mg/l frånsett två stammar med MIC 0,012 respektive 0,016. Alla stammar hade ciprofloxacin-mic 0,006 mg/l frånsett en stam med MIC 0,094. Meropenem-MIC varierade mellan 0,003 och 0,023. Kloramfenikol-MIC varierade mellan 0,19 och 2,0 mg/l. Rifampicin-resistens sågs i en stam med MIC 0,38 i övrigt var det högsta MIC 0,125 mg/l. Nedsatt känslighet eller resistens mot ciprofloxacin orsakas framförallt av mutationer i gyra genen (ref 9). Denna gen kodar för en av subenheterna i DNA gyras till vilken ciprofloxacin binder in och på så sätt stör DNA replikationen och bakterien avdödas. Med hjälp av ering av gyra genen kunde en av de tidigare beskrivna substitutionerna, threonin till isoleucin vid position 91 (T91I) identifieras hos den stam med MIC 0,094 för ciprofloxacin. Brytpunkter för MC inom SIR-systemet (S /R>) i mg/l, fastlagda av EUCAST/RAF-M, är för pcg 0,06/0,25, cefotaxim 0,12/0,12, ciprofloxacin 0,03/0,06, meropenem 0,25/0,25, kloramfenikol 2/4 och rifampicin 0,25/0,25. 40 35 30 25 20 15 % 10 5 0 1999 2001 2003 2005 2007 2009 Figur 1. Proportionen (%) MC med nedsatt känslighet enligt internationell norm (MIC >0,064 mg/l) för pcg 1999 tom 2010.

Sidan 4 av 10 Sammanfattningsvis. Ur referenslaboratoriets perspektiv dominerande Y:P1.5-2,10-1,36-2 med 15 isolat bland likvor/blodisolaten i Sverige under 2010. I övrigt var C:P1.5,2,36-2 (n=9), C:P1.7,16-29,35 (n=4) och Y:P1.5-1,2-2,36-2 (n=3) vanligast. MC serogrupp B isolaten uppvisade alla individuella karaktäristika utom 2 som var B:P1.7,16,35. Jämfört med tidigare år (Tabell III) har det totala antalet MC-isolat ökat något under 2010. Det kan även konstateras att MC serogrupp B (n=11) liksom de sista tre åren ligger på en låg nivå jämfört med tidigare och fortsätter att sjunka ytterligare under 2010. Medeltal 14 likvor/blod isolat av MC serogrupp B per år, range 11-16, under år 2007-2010 jämfört med 30 likvor/blod isolat av MC serogrupp B per år, range 20-54, under åren 1995-2006. MC serogrupp C har identifierats från 19 patienter, vilket är inom det övre intervallet 9-25 fall/år som registrerats sedan 1995 och motsvarar nästan en fördubbling från år 2009 då 10 st MC serogrupp C identifierades. McY fortsätter liksom förra året att öka ytterligare i år. Under året har en utredning omfattande alla MC serogrupp Y-isolat under 2000-talet genomförts för att belysa om vi fått in en ny klon av Y meningokocker i landet. Denna visade att det framförallt är en klon, MCY:P1.5-2,10-1,36-2:F4-1: ST23(cc23), som troligen introducerades med ett isolat år 2002 och 2004 följt av sex isolat under åren 2006-2007, åtta isolat under åren 2008-2009 och som sedan har ökat till 12 isolat under år 2010. Anmärkningsvärt är även att denna klon i högre utsträckning drabbar unga vuxna (20-29 år) än äldre vilka annars har varit hårdast drabbade av meningokocksjukdom orsakad av MC serogrupp Y. Slutligen är det viktigt att följa penicillin/cefalosporin och kinolon känsligheterna men ännu krävs ingen ändring av antibiotika policy vad det går att förstå från laboratoriets horisont. Nyheter och förändringar under 2011. Från och med 1 februari 2011 lägger vi till identifiering av crga genen som komplement till ctra för påvisandet av artspecifikt bakteriellt DNA i vår bakteriella meningit PCR (ref 11). Detta efter att man i Europa har upptäckt mutationer i primersitet för ctra, vilket kan leda till falskt negativa resultat (ref 17). I Sverige har vi än så länge inte upptäckt några muterade isolat men man bör vara uppmärksam på detta i och med att flera lab i Sverige använder sig av ctra för identifikation av MC. Under året kommer en meningokock-serologi att sättas upp. Denna har tidigare utförts i Lund vid Labmedicin Skåne, Klinisk immunologi och transfusionsmedicin. Tekniken är kvantitativ bestämning av IgG-antikroppar mot kapselpolysackariderna hos MC serogrupp A, C, Y och W-135 i serum/plasma mha ELISA och används främst för att dokumentera serologiskt svar efter vaccination. Sedan länge har laboratoriet en komplementbindningstest för serologisk diagnos av invasiv meningokocksjukdom. Liksom tidigare ges ett första svar (s.k. prelsvar) på misstänkta MC isolat, oftast inom 2 arbetsdagar, med serogrupp och antibiogram. Den genetiska karaktäriseringen tar ca 1 månad om inte epidemiologi eller andra faktorer gör att den skall påskyndas. Örebro 2011-03-03 Susanne Jacobsson, Per Olcén, Hans Fredlund, Paula Mölling, Sara Thulin Hedberg, Magnus Unemo, Emma Johansson och Ronza Hadad.

Sidan 5 av 10 Publikationer. 1. Mölling P, Jacobsson S, Bäckman A, Olcén P. Direct and rapid identification and genogrouping of meningococci and pora amplication by LightCycler PCR. J Clin Microbiol 40:4531-4535, 2002. 2. Clarke SC, Diggle MA, Mölling P, Unemo M, Olcén P. Analysis of PorA variable region 3 in meningococci: implications for vaccine policy? Vaccine 21:2468-2473, 2003. 3. Olcén P, Fredlund H. Isolation, culture, and identification of meningococci from clinical specimens. Kapitel 2 i Methods in Molecular Medicine, vol. 67 (2001): Meningococcal Disease: Methods and Protocols. Ed.: Pollard AJ, Maiden M. Human Press Inc., Totowa, NJ 4. Taha M-K, Olcén P. Molecular genetic methods in diagnosis and direct characterization of acute bacterial central nervous system infections. APMIS 112:753-770, 2004. 5. Taha M-K.Olcén P... et al. Interlaboratory comparison of PCR-based identification and genogrouping of Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol 43:144-149, 2005. 6. Thulin S, Olcén P, Fredlund H, Unemo M. Total variation in the pena gene of Neisseria meningitidis: correlation between susceptibility to β-lactam antibiotics and pena gene heterogeneity. Antimicrob Agents Chemother 50:3317-3324, 2006. 7. Thulin S, Olcén P, Fredlund H, Unemo M. Combined real-time PCR and pyrosequencing strategy for objective, sensitive, specific, and high throughput identification of reduced sensitivity to penicillins in Neisseria meningitidis. Antimicrob Agents Chemother 52:753-756, 2008. 8. Jacobsson S, Olcén P, Löfdahl M, Fredlund H, Mölling P. Characteristics of Neisseria meningitidis isolates causing fatal disease. Scand J Infect Dis 40:734-744, 2008. 9. Wu HM, Harcourt BH, Hatcher CP et al. Emergence of ciprofloxacin-resistant Neisseria meningitidis in North America. NEJM 360:886-892, 2009. 10. Jacobsson S, Thulin Hedberg S, Mölling P, Unemo M, Comanducci M, Rappuoli R, Olcén P. Prevalence and sequence variations of the genes encoding the five antigens included in the novel 5CVMB vaccine covering group B meningococcal disease. Vaccine 27:1579-1584, 2009. 11. Thulin Hedberg S, Olcén P, Fredlund H, Mölling P. Real-time PCR detection of five prevalent bacteria causing acute meningitis. APMIS 117:856-860, 2009. 12. Susanne Jacobsson. Doctoral dissertation. Characterization of Neisseria meningitidis from a virulence and immunogenic perspective that includes variations in novel vaccine antigens. Örebro Studies in Medicine 31, Örebro 2009. 13. Sara Thulin Hedberg. Doctoral dissertation. Antibiotic susceptibility and resistance in Neisseria meningitidis phenotypic and genotypic characteristics. Örebro Studies in Medicine 38, Örebro 2009. 14. Olcén P, Fredlund H. Isolation and characterization of Neisseria meningitidis in the vaccine era. Who needs what and when? Scand J Infect Dis 42:4-11, 2010. 15. Jacobsson S, Wedege E. A review of vaccines against group B meningococcal disease. European Infectious Disease 4:50-53, 2010. 16. Thulin Hedberg S, Olcén P, Fredlund H, Unemo M. Antibiotic susceptibility of invasive Neisseria meningitidis isolates from 1995 to 2008 in Sweden the meningococcal population remains susceptible. Scand J Infect Dis 42:61-64, 2010. 17. Cavrini F, Liguori G, Andreoli A, Sambri V. Multiple nucleotide substitutions in the Neisseria meningitidis serogroup C ctra gene cause false-negative detection by realtime PCR. J Clin Microbiol 48:3016-3018, 2010.

Sidan 6 av 10 Tabell I. Serogruppmönster hos N. meningitidis isolat från 94 patienter som skickats till laboratoriet för karakterisering under 2010. Ett isolat per patient redovisas. Serogrupp likvor/blod svalg/luftvägar inkl. ögon urogenitalt punktat Totalt A 1 0 0 0 1 B 11 13 a) 1 1 d) 26 C 19 4 0 0 23 X 0 0 0 0 0 Y 22 8 b) 0 0 30 Z 0 0 0 0 0 W-135 2 0 0 0 2 29E 1 0 0 0 1 ej grupperbar (ng) 0 10 c) 1 0 11 Totalt 56 35 2 1 94 a) 4 konjunktiva och 1 sputum; b) 1 sputum, 1 BAL och 1 provart ej angiven; c) 1 bronk; d) knä

Sidan 7 av 10 Tabell IIa. Genosubtypmönster för samtliga invasiva N. meningitidis grupp B isolat (n=12) uppdelat på de tre variabla regionerna VR1, VR2 och VR3 hos pora genen. VR1 P1.5 P1.7 P1.18 P1.19 P1.21 P1.22 0 5 0 1 1 1 variant 2* 0 2* 0 0 0 VR2 P1.3 P1.9 P1.10 P1.14 P1.15 P1.16 1 1 0 1 0 4 variant 0 0 2* 0 1 2* VR3 P1.35 P1.36 P1.37 P1.38 4 1 1 1 variant 1 3 1 0 * = två varianter Grupp B-stammarna hade genosubtyp P1.5-1,10-4,36-2 (n=1) P1.18-1,3,38 (n=1) P1.5-2,10-12,36-2 (n=1) P1.18-7,9,35-1 (n=1) P1.7,16,35 (n=2) P1.19,15-1,36-2 (n=1) P1.7,16,37 (n=1) P1.21,16,37-1 (n=1) P1.7,16-32,35 (n=1) P1.22,14,36 (n=1) P1.7,16-66,35 (n=1)

Sidan 8 av 10 Tabell IIb. Genosubtypmönster för samtliga invasiva N. meningitidis grupp C isolat (n=19). VR1 P1.5 P1.7 P1.22 9 4 1 variant 3* 2 0 VR2 P1.2 P1.10 P1.14 P1.16 9 0 1 0 variant 0 3* 0 6* VR3 P1.35 P1.36 6 1 variant 0 12 * = två varianter Grupp C-stammarna hade genosubtyp P1.5,2,36-2 (n=9) P1.7-2,16-29,35 (n=1) P1.5-1,10-8,36-2 (n=2) P1.7-2,16-82,35 (n=1) P1.5-2,10-1,36-2 (n=1) P1.22,14,36 (n=1) P1.7,16-29,35 (n=4)

Sidan 9 av 10 Tabell IIc. Genosubtypmönster för samtliga invasiva N. meningitidis grupp Y isolat (n=22). VR1 P1.5 P1.15 0 1 variant 21* 0 VR2 P1.2 P1.9 P1.10 0 1 0 variant 3 0 18* VR3 P1.36 variant 22 * = två varianter 0 Grupp Y-stammarna hade genosubtyp P1.5-2,10-1,36-2 (n=15) P1.5-1,2-2,36-2 (n=3) P1.5-2,10-3,36-2 (n=1) P1.5-1,10-4,36-2 (n=1) P1.5-2,10-28,36-2 (n=1) P1.15,9,36-2 (n=1) Invasiva stammar från övriga serogrupper Grupp W-135 P1.5,2,36-2 (n=1) P1.18-1,3,38 (n=1) Grupp A P1.20,9,35-1 (n=1) Grupp 29E P1.5,2,36-2 (n=1)

Susanne Jacobsson Datum: 2011-03-03 Sidan 10 av 10 Tabell III. Alla MC från 1995 till 2010. Totalt antal MC-isolat (ett per patient) 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 114 133 99 87 87 102 116 83 74 73 70 75 81 76 79 94 MC från CSF/blod 68 75 64 57 46 44 58 36 41 47 48 44 43 38 45 56 MC från luftvägar 42 51 35 26 39 56 55 43 27 24 19 28 34 35 24 35 MC från genitaltrakt 1 4 0 3 2 1 2 3 4 0 1 3 3 2 9 2 Andra invasiva MC 3 3 0 1 0 1 1 1 2 2 2 0 1 1 1 1 MC från CSF/blod serogrupp A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 B 42 54 32 35 25 23 33 20 27 24 25 21 16 14 16 11 C 19 9 25 13 12 15 14 10 11 11 15 15 15 16 10 19 Y 6 8 6 4 7 1 8 4 2 6 4 5 9 7 16 22 W-135 0 4 1 3 2 5 2 1 1 5 1 2 2 1 2 2 annan 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 ng 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 2 1 1 0 1 0