HercepTest for the Dako Autostainer

Transkript

1 HercepTest for the Dako Autostainer Kod nr K5207 Utgåva 19 För immunocytokemisk färgning. Kitet är för 50 tester (100 objektglas). ( ) P04087SE_K / s. 1/51

2 Innehållsförteckning Sida Avsedd användning 4 Sammanfattning och förklaring - Bröst 5 Bakgrund 5 Egenskaper 5 Procedurens princip - Bröst 5 Reagenser - Bröst 6 Medföljande material 6 Ytterligare erforderligt material som ej ingår 7 Förvaring - Bröst 8 Provförberedning - Bröst 8 Paraffininbäddade snitt 8 Bearbetning av vävnader före färgning 8 Försiktighetsåtgärder - Bröst 9 INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Bröst 10 A. Reagensförberedning 10 A.1 Epitopåtervinningslösning 10 A.2 Tvättbuffert 10 A.3 Substrat-kromogenlösning (DAB) 10 A.4 Motfärg 10 A.5 Monteringsmedel 11 B. Färgningsprocedur utförd på Autostainer 12 B.1 Proceduranmärkningar 12 B.2 Färgningsprotokoll 12 Kvalitetskontroll - Bröst 14 Färgningstolkning - Bröst 15 Begränsningar - Bröst 18 Allmänna begränsningar 18 Produktspecifika begränsningar 18 Prestandaegenskaper - Bröst 19 Bakgrund 19 Jämförande undersökningar 19 Jämförelse med den kliniska prövningen (CTA) 19 Precision 20 Reproducerbarhet 20 Immunreaktivitet 21 Felsökning - Bröst 22 Sammanfattning och förklaring - Mage 25 Bakgrund 25 Egenskaper 25 Procedurens princip - Mage 25 Reagenser - Mage 26 Medföljande material 26 Ytterligare erforderligt material som ej ingår 27 Förvaring - Mage 28 Provförberedning - Mage 28 Paraffininbäddade snitt 28 Bearbetning av vävnader före färgning 28 Försiktighetsåtgärder - Mage 29 INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Mage 30 A. Reagensförberedning 30 A.1 Epitopåtervinningslösning 30 A.2 Tvättbuffert 30 A.3 Substrat-kromogenlösning (DAB) 30 A.4 Motfärg 32 A.5 Monteringsmedel 32 B. Färgningsprocedur utförd på Autostainer 32 B.1 Proceduranmärkningar 32 B.2 Färgningsprotokoll 33 Kvalitetskontroll - Mage 34 Färgningstolkning - Mage 36 Begränsningar - Mage 39 ( ) P04087SE_K / s. 2/51

3 Allmänna begränsningar 39 Produktspecifika begränsningar 40 Prestandaegenskaper - Mage 40 Bakgrund: 40 Reproducerbarhet 42 Immunreaktivitet 45 Felsökning - mage 46 Referenser 49 Symbolförklaringar 51 ( ) P04087SE_K / s. 3/51

4 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. HercepTest är en semikvalitativ immuncytokemisk analys för att bestämma överexpression av HER2-protein i bröstcancervävnader, som behandlats rutinmässigt för histologisk bedömning och formalinfixerad, paraffininbäddad cancervävnad från patienter med adenocarcinom i magen inklusive gastro-esofageala förbindelsen. HercepTest indikeras som ett hjälpmedel vid bedömningen av patienter för vilka Herceptin (trastuzumab) behandling övervägs (se produktbladet för Herceptin ). OBS endast för bröstcancer: Alla patienter i de kliniska prövningarna med Herceptin utvaldes med användning av en undersökande immuncytokemisk klinisk prövningsanalys (CTA). Inga av patienterna i dessa prövningar utvaldes med användning av HercepTest. HercepTest jämfördes med CTA på en oberoende sats prover och befanns ge acceptabelt överensstämmande resultat. Den egentliga korrelationen mellan HercepTest och Herceptin kliniskt resultat har inte fastställts. OBS endast för magcancer: Samtliga patienter i fas III-studien BO18255 (ToGA) som sponsras av Hoffmann-La Roche valdes ut med användning av Dako HercepTest (IHC) och Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Studien påvisade den kliniska nyttan av båda testerna för bedömning av HER2-status hos patienter med lokalt framskriden cancer som inte går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller den gastroesofageala förbindelsen. För det nuvarande kitet, Kod nr K5207 har reagensvolymer justerats särskilt för användning med Autostainer. Adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, kallas även magcancer i detta dokument. För bröstcancerapplicering, var god se sidorna För magcancerapplicering, var god se sidorna Viktigt: Observera skillnaderna för bröstcancervävnad och magcancervävnad, speciellt i avsnitten Tolkning av färgning. ( ) P04087SE_K / s. 4/51

5 Bröstcancer Sammanfattning och förklaring - Bröst Bakgrund: Den humana HER2-genen, (även kallad ERBB2 ellerneu) kodar ett protein som ofta kallas HER2-protein eller p185 HER2. HER2-proteinet är ett membranreceptortyrosinkinas med homologi med den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1 8). HER2-proteinet är en normal komponent, som uttrycks av flera olika epitelialcelltyper (8). Hos en del av patienter med bröstcancer, överutrycks HER2-proteinet som en del av processen för malign transformering och tumörprogression (9). Överexpression av HER2- proteinet på ytan av bröstcancerceller, antydde att det kunde vara en målorganism för antikroppsterapi. Herceptin (trastuzumab) är en humaniserad monoklonal antikropp (10), som binder med hög affinitet till HER2-proteinet och har visat sig hämma proliferationen av humana tumörceller som överuttrycker HER2-protein in vitro och in vivo (11 13). Egenskaper HercepTest utvecklades för att tillhandahålla ett alternativ till den undersökande CTA, som användes vid de kliniska studierna med Herceptin. Prestandan hos HercepTest, för bestämning av överexpression av HER2-protein, utvärderades i en oberoende undersökning, där resultaten av HercepTest jämfördes med CTA hos 548 brösttumörprover, av vilka inga erhölls från patienter i de kliniska studierna med Herceptin. Resultaten indikerade 79 % konkordans mellan resultaten från de båda analyserna av dessa vävnadsprover. Konkordansdata indikerar även att en 3+ avläsning med HercepTest högst sannolikt skulle motsvara en positiv avläsning med CTA, vilket skulle ha uppfyllt inträdeskriterierna för prövningen (2+ eller 3+). Ett fynd av 2+ på HercepTest korrelerade inte lika väl med CTAresultaten. Cirka 42 % (53/126) av HercepTest 2+ resultaten var negativa med CTA (0 1+), vilket inte skulle ha medgivit deltagande i de kliniska prövningarna med Herceptin. HercepTest tolkas som negativt för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ färgningsintensitet), svagt positiv (2+ färgningsintensitet), och starkt positiv (3+ färgningsintensitet). HercepTest är inte avsett att tillhandahålla prognostisk information till patienten och läkaren och har inte validerats för detta ändamål. Procedurens princip - Bröst HercepTest innehåller reagenser som krävs för att utföra en tvåstegs immunocytokemisk färgningsprocedur för rutinmässigt bearbetade paraffininbäddade prover. Efter inkubering med den primära kanin-antikroppen mot humant HER2-protein, använder denna sats en bruksfärdig Visualization Reagent baserad på dextranteknik. Denna reagens består av både sekundära anti-kaninimmunglobulinmolekyler från get och pepparrotsperoxidasmolekyler bundna till en gemensam dextranpolymerryggrad, vilket sålunda eliminerar behovet av sekventiell applicering av länkantikropp och peroxidaskonjugerad antikropp. Korsreaktion av visualiseringsreagenset med humana immunoglobuliner och kalvfosterserum har avlägsnats genom absorption i fast fas. Den enzymatiska konverteringen av det därefter tillsatta kromogenet resulterar i att en synlig reaktionsprodukt bildas på antigenplatsen. Provet kan därefter motfärgas och förses med täckglas. Resultaten tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollpreparat som innehåller tre formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+ tillhandahålls för att validera färgningskörningarna. Färgningsintensiteten hos dessa cellinjer har korrelerats med antalet receptorer per cell. HercepTest, Kod nr K5207, är tillämpligt för automatiserad färgning med Autostainer. ( ) P04087SE_K / s. 5/51

6 Bröstcancer Reagenser - Bröst Medföljande material Det uppräknade materialet nedan är tillräckligt för 50 tester (50 objektglas inkuberade med primärantikropp mot HER2-protein och 50 objektglas inkuberade med motsvarande negativt kontrollreagens). Antalet tester baseras på användning av 200 µl per vävnadssnitt (22 mm x 22 mm) av vialnr 1, 2, 3 och 4 och av substrat-kromogenlösningen (DAB). Kitet innehåller tillräckligt med material för maximalt 15 individuella färgningskörningar. Vialnr Kvantitet Beskrivning 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Peroxidas-blockeringsreagens: 3 % väteperoxid innehållande 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). Anti-humant kanin-her2-protein: Bruksfärdig affinitetsisolerad antikropp. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN3, ph 7,2, innehållande stabiliserande protein. Immunogen: Syntetiskt C-terminalt fragment (intracytoplasmisk del) av HER2-proteinet, bundet till keyhole limpet hemocyanin. Specificitet: HER2-protein. Reningsmetod: Antikroppen affinitetsisoleras med användning av en immobiliserad HIER2-proteinpeptid. Visualiseringsreagens: Dextranpolymer konjugerad med pepparrotsperoxidas och affinitetsisolerade antikaninimmunoglobuliner från get. Levereras i Tris/HCl-buffert innehållande stabiliserande protein och ett antimikrobiellt medel. Negativt kontrollreagens: Immunglobulinfraktion av normalt kaninserum vid en ekvivalent proteinkoncentration som antikroppen mot HER2-protein. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, innehållande stabiliserande protein. DAB-buffrat substrat: Substratbuffertlösning, ph 7,5, innehållande < 0,1 % väteperoxid, stabilisatorer, förstärkare och antimikrobiellt medel. DAB-kromogen: 5 % 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid kromogenlösning. Epitopåtervinningslösning (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citratbuffert med antimikrobiellt medel. Tvättbuffert (10x): Tris/HCl-buffert med ett rengöringsmedel och ett antimikrobiellt agens. ( ) P04087SE_K / s. 6/51

7 3 x 5 objektglas Bröstcancer Kontrollobjektglas: Varje kontrollpreparat innehåller snitt av tre formalinfixerade, paraffininbäddade bröstcancercellinjer, som representerar olika nivåer av expression av HER2-protein. MDA-231 (0), MDA-175 (1+), och SK-BR-3 (3+). Kontrollpreparaten har värmebehandlats för att snitten ska fästa bättre vid objektglasen. Eventuell ytterligare värmebehandling av kontrollpreparaten, som utförs för att förbättra snittens vidhäftning till objektglasen, kan äventyra färgningsresultaten. OBS! Alla reagenser, inklusive epitopåtervinningslösning och tvättbuffert, formuleras specifikt för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras utom för tvättbufferten, där Dako Kod S3006 kan användas. Ytterligare erforderligt material som ej ingår Ammoniumhydroxid, 15 mol/l spätt till 37 mmol/l Motfärg: Hematoxylin, som det vattenbaserade Mayer's Hematoxylin, Dako Kod S3301 (se INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING, A.4) Täckglas Destillerat eller avjoniserat vatten (tvättvatten) Torkugn, som kan bibehålla 60 C eller lägre Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (4 40x objektivförstoring) Monteringsmedium, som t.ex. Dako Faramount, Kod S3025 eller Glycergel, Kod C0563 Positiva och negativa vävnader att använda som processkontroller (se avsnittet om Kvalitetskontroll) Objektglas, SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagda objektglas eller Dako Silanized Slides, Kod S3003 (se Provförberedning) Färgningskyvetter eller -bad Timer (kapabel till 2 40 minuters intervaller) Vattenbad med lock (kapabel att hålla epitopåtervinningslösning vid C) Xylen, toluen eller xylensubstitut K5207 har anpassats för användning med Autostainer Immunostaining System, Kod S3400. Se användarmanualen för Autostainer för nödvändiga Autostainer-komponenter. ( ) P04087SE_K / s. 7/51

8 Bröstcancer Förvaring - Bröst Förvara vid 2 8 C. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som är tryckt på förpackningen. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som anges i produktbladet (14a,14b). Observera att kontrollobjektglas också måste förvaras vid 2 8 C. Det finns inga tydliga tecken som tyder på instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller köras simultant med patientprover. Om oförväntad färgning upptäcks som inte kan förklaras av variationer i laboratorieutföranden och ett problem med HercepTest misstänks, kontakta omedelbart Dakos serviceavdelning. Provförberedning - Bröst Biopsiprover måste hanteras så att vävnaden bevaras för immuncytokemisk färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling bör användas för alla prover (15). Paraffininbäddade snitt Vävnader konserverade i neutralbuffrat formalin eller Bouins fixativ för rutinbehandling och paraffininbäddning är lämpliga för användning. Exempelvis ska biopsiprover blockas till en tjocklek på 3 eller 4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Vävnader dehydreras därefter i en serie med alkohol och xylen, följt av en infiltration av smält paraffin vid en temperatur på högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader som uttrycker HER2-protein kommer att vara stabila länge före snittning och montering på objektglas om de förvaras kallt (15 25 C) (15, 16). I USA kräver Cl inical Laboratory Improvement Act, 1988 i 42 CFR (b) att Laboratoriet måste behålla färgade objektglas i minst tio år från undersökningsdatum och provblock i minst två år från undersökningsdatum (16). Vävnadsprover ska skäras i snitt på 4 5 µm, monteras på objektglas och lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar (eller tills de är torra), vid 37 C över natten eller vid 60 C i en timme. VARNING! För hög värme i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller förlust av den specifika membran-associerade HER2-immunreaktiviteten (17). För att bevara antigeniciteten bör snitt som monterats på objektglas (SuperFrost Plus, Poly-Llysine eller silaniserade objektglas) färgas inom 4 6 veckor efter snittning, vid förvaring vid rumstemperatur (20 25 C) (18). Objektglas som kräv s för HER2-proteinutvärdering och verifiering av tumörförekomst bör förberedas samtidigt. Minst fem objektglas rekommenderas, ett objektglas för tumörförekomst, två objektglas för HER2-proteinutvärdering (ett för inkubation med vialnr 2 och ett för inkubation med vialnr 4) och två objektglas för backup. Användning av HercepTest TM på avkalkade vävnader har inte kontrollerats och rekommenderas inte. Se Dakos Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) och litteraturhänvisningarna 15 och 16 för ytterligare information om provpreparation. Bearbetning av vävnader före färgning En specifik epitopåtervinningsmetod i 10 mmol/l citratbuffert måste användas för optimal analysprestanda. Epitopåtervinningslösningen medföljer HercepTest -satsen. Denna metod inbegriper uppvärmning av vävnadssnitt monterade på objektglas som nedsänks i 10 mmol/l citratbuffert (20) i ett kalibrerat vattenbad kapabelt att hålla epitopåtervinningslösningen vid nödvändig temperatur (95 99 C). Laboratorier lokal iserade på höga platser bör bestämma den bästa metoden för att hålla den nödvändiga vattenbadstemperaturen. Epitopåtervinningen måste utföras i ett vattenbad. Andra uppvärmningsmetoder har testats och ger inga reproducerbara resultat. Påbörja färgningsproceduren omedelbart efter epitopåtervinning. Avvikelse från den beskrivna proceduren kan påverka resultaten. ( ) P04087SE_K / s. 8/51

9 Bröstcancer Försiktighetsåtgärder - Bröst 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Vial 1, peroxidas-blockeringsreagens, innehåller 3 % väteperoxid. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 4. Vial 6, DAB-kromogen, innehåller 5-<10% bifenyl-3,3',4,4'- tetrayltetraammoniumtetraklorid och är märkt: H350 H341 P201 P280 Fara P308 + P313 P405 P501 Kan orsaka cancer. Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. Inhämta särskilda instruktioner före användning. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (SDS). 5. Vial 8, tvättbuffert, innehåller 5-<10% 2-amino-2-(hydroximetyl)propan-1,3-diolhydroklorid och 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxolan. Kan ge allergisk reaktion. Wash Buffer (10x) är märkt: Varning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 6. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3 ), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Vid kassering, spola med stora mängder vatten för att undvika att metallazider ackumuleras i rören (21, 22). 7. Vial 2, 3 och 4 innehåller material av animaliskt ursprung. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 8. Kontrollglas och prover, före och efter fixering, samt alla material som exponerats för dessa, bör hanteras som potentiellt smittbärande och kasseras med lämpliga försiktighetsåtgärder (23). Pipettera aldrig reagenser med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagenser och prover. Om reagenserna kommer i kontakt med känsliga områden, tvätta med stora mängder vatten. 9. Minimera mikrobiell kontamination av reagenser genom att undvika icke-specifik färgning. ( ) P04087SE_K / s. 9/51

10 Bröstcancer 10. Andra inkubationstider, temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. För lång torkning i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller förlust av den specifika membran-associerade HER2-immunreaktiviteten (17). 11. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i minskad antigenfärgning. 12. Alla reagenser, inklusive epitopåtervinningslösning och tvättbuffert, formuleras specifikt för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras utom för tvättbufferten, där Kod S3006 kan användas. 13. Visualiseringsreagens och DAB-kromogen kan påverkas negativt om de utsätts för höga ljusnivåer. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, såsom direkt solljus. 14. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Se materialsäkerhetsdatabladet (SDS) för ytterligare information. 15. Rester av paraffin kan leda till falska negativa resultat. 16. Användning av andra reagensvolymer än de som rekommenderas kan leda till förlust av synlig HER2-immunreaktivitet. Vävnadssnitt större än 22 mm x 22 mm kräver 2-3 x 200 µl reagens, applicerat på 2-3 automatiserade applikationsområden. INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Bröst A. Reagensförberedning Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: A.1 Epitopåtervinningslösning Späd en tillräcklig kvantitet av vial 7 (epitopåtervinningslösning x 10) 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten för färgningsproceduren som planeras. Oanvänd spädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den spädda lösningen om den är grumlig. A.2 Tvättbuffert Späd en tillräcklig kvantitet av vial 8 (tvättbuffert x 10) 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten för tvättstegen. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. Autostainer är programmerad för att skölja vävnadssnitt efter peroxidas-blockeringsreagenset och substrat-kromogenlösningen. Observera att för dessa sköljsteg kan antingen destillerat (eller avjoniserat) vatten eller tvättbuffert användas. Alla andra sköljsteg kräver användning av tvättbuffert. A.3 Substrat-kromogenlösning (DAB) Bered substrat-kromogenlösning genom att tillsätta 11 droppar (25 30 µl per droppe) DABkromogen från flaska 6 till en flaska 5 innehållande DAB-buffrat substrat (11 ml) och blanda. Förberedd substrat-kromogenlösning (DAB) är stabil i ungefär fem dagar när den förvaras vid 2 8 C. Denna lösning bör grundligt blandas före an vändning. Eventuell utfällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. OBS! Färgen på DAB-kromogen i vial 6 kan variera från klar till ljust blåbrun. Det här påverkar inte produktens prestanda. Späd enligt riktlinjerna i den här bipacksedeln. Tillsats av överflödigt DAB-kromogen till DAB-buffrat substrat resulterar i försämring av den positiva signalen. A.4 Motfärg DAB-färgningsreaktionens färgade slutprodukt är olöslig i alkohol och vatten. Använd en hematoxylin-kontrastfärg och justera hematoxylin-färgningsintensiteten till en liknande nivå som visas i Dakos HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer. Hematoxylin, antingen alkohol- eller vattenbaserad, som Dako Mayers Hematoxylin, Kod S3301, kan användas. Följ hematoxylin-kontrastfärgning med en noggrann sköljning i destillerat eller avjoniserat vatten och sänk därefter ned vävnadsobjektglas i ett bad med 37 mmol/l ammoniakvatten (se avsnitt B.2, steg 3). Ammoniakvatten (37 mmol/l) förbereds genom ( ) P04087SE_K / s. 10/51

11 Bröstcancer blandning av 2,5 ml av 15 mol/l (koncentrerad) ammoniumhydroxid med 1 Liter destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänt 37 mmol/l ammoniakvatten kan förvaras i rumstemperatur (20 25 C) i en flaska med hårt påskruvat lock i up p till 12 månader. A.5 Monteringsmedel Icke vattenhaltigt, permanent monteringsmedium rekommenderas. Vattenhaltig montering är emellertid också acceptabelt. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, bruksfärdig, Kod S3025 eller Glycergel Mounting Medium, Kod C0563, rekommenderas för vattenhaltig montering. Lös upp Glycergel genom uppvärmning till ungefär 40 (±5) C före användning. ( ) P04087SE_K / s. 11/51

12 Bröstcancer B. Färgningsprocedur utförd på Autostainer B.1 Proceduranmärkningar Användaren bör läsa dessa instruktioner noggrant och känna till alla komponenter och funktion före användning (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser bör ha antagit rumstemperatur (20 25 C) före immunofärgning. På samma sätt bör alla inkubationer utföras i rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitt torka medan objektglas laddas på Autostainer och under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Om färgningsproceduren avbryts kan glasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av primärantikroppen i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C) utan att färgningsresultatet påverkas. Avparaffinering och rehydrering: Före färgning måste vävnadsobjektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Undvik ofullständigt avlägsnande av paraffin. Kvarlämnat inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglas i xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Slå av vätskeöverskott och placera objektglas i absolut etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Slå av vätskeöverskott och placera objektglas i 95 % etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i destillerat eller avjoniserat vatten i minst 30 sekunder. Påbörja färgningsproceduren som beskriven i avsnitt B.2, steg 1, Epitopåtervinning. Xylen- och alkohollösningar ska bytas efter 40 objektglas. Toluen eller xylen-substitut, som Histoclear, kan användas i stället för xylen. OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer denna sats har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra analysresultaten ogiltiga för användning vid urval av patienter för Herceptin -terapi. B.2 Färgningsprotokoll Utförd i rumstemperatur, C. Steg 1: Epitopåtervinning Fyll färgningskärl, t.ex. Coplin-kärl, med den spädda epitopåtervinningslösningen (se INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärl med epitopåtervinningslösning i vattenbad. Värm upp vattenbadet och epitopåtervinningslösningen till C. Efter uppvärmning blir epitopåtervinnningslösningen grumlig. Täck kärlen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda epitopåtervinningslösningen i färgningskärlen. ÅTERFÖR TEMPERATUREN PÅ VATTENBADET OCH EPITOPÅTERVINNINGSLÖSNINGEN TILL C. Inkubera i 40 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Låt objektglas svalna i epitopåtervinningslösningen i 20 (±1) minuter i rumstemperatur. Håll ut epitopåtervinningslösningen och skölj snitt i tvättbuffert (se INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING, avsnitt A.2). ( ) P04087SE_K / s. 12/51

13 Lägg snitten i tvättbufferten i 5-20 minuter efter epitopåtervinningen och före färgningen för optimal prestanda. OBS! Epitopåtervinningslösningen är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Autostainer-procedur Bröstcancer 1. Använd Autostainer-genererad karta med HercepTest -autoprogram för nödvändiga programtider och reagensvolymer (se punkt 4 nedan för specifika volymer). 2. Placera Autostainer-reagensvialer i Autostainerns reagensställ i enlighet med den datorgenererade reagenskartan. 3. Ladda objektglas på Autostainern i enlighet med den datorgenererade objektglaskartan. 4. Ställ in programmet och påbörja HercepTest -programmet. Följande är en beskrivning av programkörningen: Skölj 200 µl peroxidas-blockeringsreagens - 5 minuter Skölj 200 µl primärt anti-her2-protein (eller negativt kontrollreagens) - 30 minuter Skölj 200 µl visualiseringsreagens - 30 minuter Skölj Skölj Byt 200 µl substrat-kromogenlösning (DAB) - 10 minuter Skölj objektglas i avjoniserat vatten efter substrat-kromogensteget OBS! Autostainer maskinvaruversion 01 sköljer objektglas i buffert. Därför måste objektglas sköljas med avjoniserat vatten efter att de tagits bort från Autostainern. Steg 3: Kontrastfärgning (instruktionerna är tillämpliga på hematoxylin) Ta bort objektglas från Autostainern och kontrastfärga i hematoxylin som beskrivet nedan. Sänk ned objektglas i ett hematoxylin-bad. Inkubera i 2 5 minuter, beroende på styrkan hos använt hematoxylin. Skölj försiktigt i ett destillerat eller avjoniserat vattenbad. Se till att återstående hematoxylin har avlägsnats. Valfritt: Doppa objektglasen tio gånger i ett bad med 37 mmol/l ammoniakvatten (se avsnitt A.4). Skölj objektglas försiktigt i ett destillerat eller avjoniserat vattenbad i 2 5 minuter. OBS! Beroende på inkubationslängden och styrkan hos det hematoxylin som används, kommer kontrastfärgningen att ge en blek till mörk blåfärgning av cellkärnor. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. Steg 4: Montering Icke vattenhaltigt, permanent monteringsmedium rekommenderas. Vattenhaltigt monteringsmedel är emellertid också acceptabelt. Prover kan monteras och förses med täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedium som Dako Faramount, Kod S3025 eller Glycergel, Kod C0563. OBS! Objektglasen kan avläsas när så är lämpligt. Viss blekning förekommer emellertid om objektglasen täcks med ett vattenhaltigt monteringsmedium och utsätts för starkt ljus under en period på en vecka. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekning en. ( ) P04087SE_K / s. 13/51

14 Bröstcancer Kvalitetskontroll - Bröst Avvikelser i vävnadsfixering, behandling och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt med regelbundna egna kontroller utöver användningen av kontrollpreparaten från Dako. För USA, se kvalitetskontrollriktlinjer från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se också CLSI (före detta NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24) och referens 25 för ytterligare information. Tabell 1. Ändamålet för daglig kvalitetskontroll. Vävnad: Fixerade och behandlade som patientprover Positiv kontroll: Vävnader eller celler som innehåller målantigen som ska detekteras (kan finnas i patientvävnad). Den ideala kontrollen är svagt positivt färgande vävnad eftersom denna är mest känslig för antikropps- eller antigendegradering. Specifik antikropp och sekundär antikropp Kontrollerar alla stegen i analysen. Validerar reagenser och procedurer som används för HER2-proteinfärgning Icke-specifik antikropp* eller buffert plus samma sekundära antikropp som används med specifik antikropp Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Negativ kontroll: Vävnader eller celler som förväntas vara negativa (kunde lokaliseras i patientvävnad eller positiv kontrollvävnad) Detektion av oavsiktlig korsreaktivitet mellan antikropp och celler/cellulära komponenter Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Patientvävnad Detektion av specifik färgning Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Kontrollpreparat tillhandahålls av Dako Färgningsprocedur endast för kontroller * Serum från samma art som den specifika antikroppen, men inte riktade mot samma målantigen. För att detektera icke-specifik antikroppsbindning, t.ex. bindning av Fc-delen av antikroppen genom vävnaden. Kontrollpreparat (medföljer): Vart och ett av de medföljande kontrollpreparaten innehåller tre pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+. Ett objektglas bör färgas i varje färgningskörning. Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. Positiv kontrollvävnad: Kontroller bör vara färska autopsi-/biopsi-/kirurgiska prover, som fixerats, behandlats och inbäddats så snart som möjligt på samma sätt som patientprovet (proverna). Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt preparerad vävnad och korrekt färgningsteknik. En positiv kontrollvävnad för varje sats testförhållanden bör inkluderas i varje färgningskörning. De positiva kontrollvävnaderna ska ge svag positiv färgning så att de kan detektera små förändringar i den primära antikroppens sensitivitet. Kontrollpreparaten som levereras med detta system eller prover som behandlats annorlunda än patientprover validerar endast reagensprestanda och verifierar inte vävnadspreparationen. Använd tidigare fastställt HER2- protein 2+, som överuttrycker invasiv (infiltrerande) human bröstcarcinomvävnad, som ideal positiv kontrollvävnad. OBS! Kända positiva kontrollvävnader bör endast användas för att övervaka korrekt prestanda av behandlade vävnader och testreagenser, INTE som ett hjälpmedel för att formulera en specifik diagnos av patientprover. Om positiva kontrollvävnader inte uppvisar riktig positiv färgning bör resultaten med testproverna anses som ogiltiga. ( ) P04087SE_K / s. 14/51

15 Bröstcancer Negativ kontrollvävnad: Använd en negativ kontrollvävnad (som är känt HER2 -proteinnegativ), som fixerats, behandlats och inbäddats på samma sätt som patientproverna, med varje färgningskörning för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppen och för att ge en indikation på specifik bakgrundsfärgning. Kolon, lever och sköldkörtel är lämpliga för negativ kontrollvävnad. Mångfalden av olika celltyper, som förekommer i de flesta vävnadssnitt, ger interna negativa kontrollsiter (detta måste verifieras av användaren). Normala bröstgångar kan användas som interna negativa kontroller. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden eller i den interna negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga och testet göras om. Icke-specifikt negativt kontrollreagens: Använd det medföljande negativa kontrollreagenset istället för den primära antikroppen med ett snitt av varje patientprov för att utvärdera ickespecifik färgning och åstadkomma en bättre tolkning av specifik färgning på antigenplatsen. Inkuberingsperioden för negativt kontrollreagens bör motsvara inkuberingsperioden för den primära antikroppen. Analysverifikation: Före användning av en antikropp eller färgningssystem i en diagnostisk procedur bör användaren verifiera antikroppens specificitet genom att testa den med en serie interna vävnader med kända immuncytokemiska prestandaegenskaper som representerar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurer som tidigare beskrivits i det här avsnittet av bipacksedeln och till kvalitetskontrollkrav i CAP Certification Program for Immunohistochemistry och/eller CLSI (före detta NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Dessa kvalitetskontrollprocedurer bör upprepas för varje ny sats med antikroppar eller när analysparametrarna ändras. Bröstcarcinom med kända HER2-proteinfärgningsintensiteter från 0 3+ och negativa vävnader, t. ex. tjocktarm, lever eller sköldkörtel är lämpliga för analysverifiering. Färgningstolkning - Bröst För bestämning av överexpression av HER2-protein bör endast färgningsintensiteten och mönstret för membranet utvärderas med användning av den skala som anges i Tabell 2. Utvärdering av objektglas ska utföras av en patolog med användning av ett ljusmikroskop. För utvärdering av immuncytokemisk färgning och poängsättning är ett objektiv med 10x förstoring lämpligt. Användning av ett objektiv med x förstoring är användbart för konfirmering av intensiteten. Cytoplasmisk färgning bör anses som icke-specifik färgning och ingår inte i bedömningen av membran-färgningsintensitet (8). För att underlätta differentieringen av 0, 1+, 2+ och 3+ färgning, se Dakos HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer för representativa bilder av färgningsintensiteter. Endast prover från patienter med invasivt bröstcarcinom bör poängsättas. I fall med carcinoma in situ och invasivt carcinom i samma prov ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Tabell 2. Kriterier för cellmembransfärgningsintensitet. Färgningsmönster Frånvaro av färgning eller membranfärgning observeras i mindre än 10 % av tumörcellerna. En svagt/knappt märkbar membranfärgning detekteras i mindre än 10 % av tumörcellerna. Cellerna färgas endast i delar av deras respektive membran En svag till måttlig fullständig membranfärgning observeras i mer än 10 % av tumörcellerna. En stark, fullständig membranfärgning observeras i mer än 10 % av tumörcellerna Poäng (rapport till behandlande läkare) Bedömning av överexpression av HER2- -protein (rapport till behandlande läkare) Negativt Negativt Svagt positiv Starkt positiv ( ) P04087SE_K / s. 15/51

16 HercepTest tolkas som negativt för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ färgningsintensitet), svagt positiv (2+ färgningsintensitet), och starkt positiv (3+ färgningsintensitet). HercepTest är inte avsett att tillhandahålla prognostisk information till patienten och läkaren och har inte validerats för detta ändamål. Bröstcancer Objektglasen bör undersökas för varje färgningskörning i den ordning som anges i Tabell 3, för att fastställa färgningskörningens validitet och möjliggöra semikvantitativ bedömning av färgningsintensiteten hos provvävnaden. Tabell 3. Ordningsföljd vid utvärdering av objektglas Preparatavläsningsordning Logisk grund 1. Kontrollpreparat innehållande de tre cellinjerna Förekomst av 3+ brun cellmembranfärgning (i kanten) i 3+ Control Cell Line SK-BR-3, partiell brun kant i 1+ Control Cell Line MDA-175 och ingen färgning i 0 Control Cell Line MDA- 231 påvisar en giltig analys Avbruten och osammanhängande membranfärgning förekommer i ett litet till moderat antal celler i den svagt positiva 1+ Control Cell Line MDA-175. Punktformig immunofärgning detekteras också i Golgi-området i cytoplasman i den här cellinjen. Närvaro av brun färgning i 0-kontrollcellinjen MDA-231 (negativ för HER2-proteinfärgning) indikerar att icke-specifik färgning förekom under analysen. Analysresultat kan vara ogiltiga på grund av överfärgning 2. Positiv kontrollvävnad Närvaro av brun membranfärgning bör observeras. Färgning av cytoplasman och negativa vävnader bör inte vara mer än Negativ kontrollvävnad FRÅNVARO av specifik färgning av den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik membranfärgning inträffar i negativt kontrollvävnadsobjektglas bör resultat med patientprov anses som ogiltiga 4. Patientvävnad som färgats med negativt kontrollreagens Frånvaro av specifik membranfärgning verifierar den specifika märkningen av målantigen av den primära antikroppen Annan mörk eller brun färgning i cytoplasman av det prov som behandlats med det negativa kontrollreagenset, som bindväv, leukocyter, erytrocyter eller nekrotisk vävnad, bör anses som icke-specifik bakgrundsfärgning och bör rapporteras under kommentardelen på datarapportbladet 5. Patientvävnad som färgats med användning av den primära antikroppen När HER2-proteinöveruttryck detekteras i provet visas det som en brun kant lokaliserad på cellmembranet i tumörceller behandlade med den primära antikroppen 1. Kontrollpreparat (medföljer): Kontrollpreparatet, som färgats med HercepTest, bör undersökas först för att säkerställa att alla reagenser fungerar korrekt. Närvaron av en brun (3,3 -diaminobensidin, DAB) reaktionsprodukt på cellmembranet indikerar en positiv reaktivitet. Närvaro av periferisk, brun cellmembranfärgning (kantning) i 3+ kontrollcellinjen SK-BR-3, partiell brun kantning i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, och ingen färgning i 0 kontrollcellinjen MDA-231, indikerar en giltig analys. Om någon av kontrollcellinjerna är utanför dessa kriterier ska alla resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. 2. Positiv kontrollvävnad: Den positiva kontrollvävnaden bör undersökas därefter. Detta preparat verifierar att fixeringsmetoden och epitopåtervinningsprocessen är effektiva. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultaten eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt (26). Färgning bör observeras i tumörvävnad som brun cellmembranfärgning. Brun färgning av cytoplasman och negativa vävnader i provet bör inte motsvara mer än 1+ färgningsintensitetspoäng. ( ) P04087SE_K / s. 16/51

17 Bröstcancer 3. Negativ kontrollvävnad: Det negativa kontrollvävnadsobjektglaset bör undersökas efter den positiva kontrollvävnaden för att verifiera den specifika märkningen av målantigenet med den primära antikroppen. Frånvaron av specifik färgning i den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativa kontrollvävnad, men detta måste verifieras av användaren. Observera att en svag reaktion (0 1+ färgningsintensitet) kan observeras i normal epitelvävnad. Möjliga negativa kontrollvävnader innefattar: kolon, lever och sköldkörtel. Icke-specifik färgning, om sådan är närvarande, kommer att ha ett diffust utseende. Sporadisk färgning av bindvävnad kan också observeras i snitt från överdrivet formalinfixerade vävnader Patientvävnad: Undersök patientproverna som färgats med HercepTest sist. Positiv färgningsintensitet bör fastställas inom ramen för all icke-specifik bakgrundsfärgning med det negativa kontrollreagenset. Liksom med alla immuncytokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte detekterades, inte att antigenen var frånvarande i de analyserade cellerna/vävnaden. Se Sammanfattning och förklaring, Begränsningar, och Prestandaegenskaper för specifik information angående HercepTest immunreaktivitet. Ytterligare rekommendationer för tolkning av HercepTest -färgning De flesta metastatiska bröstcarcinom, som testats för överexpression av HER2-protein, ges en poäng på 0 eller 3+. Även om majoriteten av dessa fall är entydiga kan en liten del av de återstående 1+ och 2+ proven vara svårare att tolka. Använd följande riktlinjer för tolkning av HercepTest -färgning i ert laboratorium. Utvärdera kontrollcellinjerna för att validera analysprestandan. Utvärdera de positiva och negativa kontrollpreparaten. En hematoxylin- och eosin- (H&E) färgning av vävnadsproven rekommenderas för den första utvärderingen. (Tumören kanske inte är uppenbar när man betraktar provet som färgats med HercepTest. Ett H&E-färgat objektglas krävs för att patologen ska verifiera förekomst av tumör.) HercepTest TM bör utföras på ett hopparat snitt (seriellt snitt) från samma paraffinblock av provet. Utvärdera snitten som färgats för överexpression av HER2-protein först med låg förstoringseffekt. Majoriteten av positiva fall kommer att vara uppenbara vid låg förstoring med låg effekt. Väl konserverade och välfärgade områden hos provet bör inte användas för att fastställa procentvärdet positiva tumörceller. I allmänhet bör de flesta fall vara uppenbara vid låg förstoring. Om bestämning mellan 1+/2+ gränslinjefall är svårt vid låg förstoring är poängen vanligen 1+. Använd objektiv med x förstoring vid verifiering av membranfärgning. Om de flesta tumörceller uppvisar fullständig membranfärgning är färgningen antingen 2+ eller 3+. Gå till 20 40x förstoring för att konfirmera poängen. I de flesta 3+-fallen färgas minst 80 % av tumörcellerna och membranfärgningen är intensiv. Om provet är nära gränsvärdet på 10 % positiva tumörceller, rekommenderas att minst 100 tumörceller räknas för att fastställa delen färgade celler. Om en fullständig membranfärgning vid svag till måttlig intensitet förekommer i mer än 10 % av tumörcellerna är poängen för provet 2+. Detta åtföljs vanligen av ofullständig membranfärgning av de flesta återstående tumörcellerna. Om mindre än 10 % av tumörcellerna har fullständig periferisk membranfärgning, trots att andra tumörceller kan uppvisa en ofullständig membranfärgning, är poängen 1+. Om mindre än 10 % av tumörcellerna har fullständig eller ofullständig periferisk membranfärgning, är poängen 0. ( ) P04087SE_K / s. 17/51

18 Begränsningar - Bröst Bröstcancer Allmänna begränsningar 1. Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialutbildning vid val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, beredning av IHC-preparaten och tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, värmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan ge artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. 4. Den kliniska tolkningen av positiv färgning, eller frånvaron av densamma, måste utvärderas inom ramen för den kliniska anamnesen, morfologin och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av all färgning eller frånvaro av färgning, måste kompletteras med morfologiska undersökningar och korrekta kontroller, såväl som andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog, som är förtrogen med antikropparna, reagenserna och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under övervakning av en patolog, som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och tillförsäkrar att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (27). 6. Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnadstyper. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenexpression i neoplasmer eller andra patologiska vävnader (28). Kontakta Dakos serviceavdelning med dokumenterad oförväntad reaktion. 7. Falskt positiva resultat kan observeras på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. Detta kan även orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C) (28). 8. Färgningsproceduren bör utföras vid en omgivande temperatur på C. Produktspecifika begränsningar 1. Antigenen, som är närvarande i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, utsätts för degradering över tiden. Fastställ kontrollpreparatresultaten i samband med kontrollpreparatets utgångsdatum. Negativ färgning av MDA-175 cellerna kanske endast indikerar att kontrollpreparatet har degraderats. Kontrollobjektglasen måste förvaras vid 2 8 C. 2. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover bör färgas inom 4-6 veckor av montering av vävnader på objektglas när de förvaras i rumstemperatur (20 25 C) (29). 3. För optimala och reproducerbara resultat kräver HER2-proteinet värmeinducerad epitopåtervinning när vävnader rutinmässigt fixeras (neutralbuffrat formalin eller Bouins fixativ) och paraffininbäddas. Denna förbehandling behöver fullgöras i början av hela färgningsprocessen. Se Provförberedning-avsnitt, Behandling av vävnader före färgning för instruktioner. 4. Värmeinducerad epitopåtervinning av HER2-protein bör endast göras med ett kalibrerat vattenbad. Andra uppvärmningsmetoder har testats och ger inga reproducerbara resultat. 5. Ersätt inte kitreagenser med reagenser med andra satsnummer eller med reagenser från andra tillverkare. Det enda undantaget är tvättbufferten som kan ersättas med Dako Wash Buffer, kodnr S3006. ( ) P04087SE_K / s. 18/51

19 Bröstcancer 6. Falska resultat kan erhållas från utvärdering av cytoplasmisk färgning. Beakta endast intensiteten av cellmembranfärgningen vid tolkning av resultat. 7. Färgade kontrollpreparat bör endast användas för validering av färgningskörningen och bör inte användas som en riktlinje för att poängsätta färgningsreaktionen i vävnadssnitt. 8. Starkt fokal färgning (3+), dvs. hot spots, kan ibland observeras. Detta kan vara resultatet av ojämn fixering och/eller behandling av vävnad. Immunfärgning av ett andra vävnadsblock från samma prov rekommenderas. 9. Användning av HercepTest på prover som fixerats i andra fixativ än neutralbuffrat formalin eller Bouins fixativ, har inte validerats. 10. Normalt epitel i bröstvävnad bör färga mellan 0 och 1+. Om högre färgning av normalt epitel än 1+ observeras bör testet göras om. Observera att normalt tonsill- och esofagusepitel kan färga upp till 2+ intensitet. Prestandaegenskaper - Bröst Bakgrund: Den kliniska prövningen (CTA), som användes för att identifiera patienter för kliniska prövningar med Herceptin, gjordes i undersökande syfte och är inte längre tillgänglig. HercepTest utvecklades för att tillhandahålla ett jämförbart alternativ till CTA. Säkerheten och effektiviteten med Herceptin utvärderades i en randomiserad kontrollerad klinisk prövning och en stor, öppen prövning (se produktbladet för Herceptin ). Alla patienter, som utvaldes för kliniska prövningar med Herceptin, uppvisade överexpression av HER2- protein genom immuncytokemisk testning, som utfördes med CTA vid ett centralt laboratorium. Patienter var lämpliga för Herceptin -behandling om deras tumör hade 2+ eller 3+ nivåer av HER2-proteinöveruttryck (baserat på en 0 3+ skala, där 3+ representerar den högsta nivån). Undergruppsanalys av resultaten från dessa undersökningar antyder att patienter vars vävnader är starkt positiva (3+) för överexpression av HER2-protein, kan ha större behållning av Herceptin än patienter vars vävnader är svagt positiva (2+). Graden av överexpression av HER2-protein är potentiellt en viktig prediktor av effekten av Herceptin -behandling. Eftersom ingen av patienterna i Herceptin -undersökningarna utvaldes med användning av HercepTest, är korrelationen mellan graden av positivitet och sannolikheten av klinisk fördel av Herceptin-behandling okänd. Jämförande undersökningar Två undersökningar utfördes för att karakterisera HercepTest. 1) Jämförelse med den kliniska prövningen (CTA). 2) Precision vid jämförelse med fem ytterligare analyser. Jämförelse med den kliniska prövningen (CTA) HercepTest jämfördes med den CTA som användes för att identifiera kvalificerade patienter för Herceptin -terapi, med användning av 274 HER2-proteinpositiva (2+ eller 3+) och samma antal HER2-proteinnegativa vävnadsprover med bröstcancer. Tabell 4 visar resultaten i ett 2 x 2 diagram, där 0 och 1+ betraktades som negativa och 2+ och 3+ var positiva. Tabell 4. En 2 x 2 överensstämmelse för HercepTest med avseende på Clinical Trial Assay (antal prover). Klinisk prövning Positivt Negativt Totalt HercepTest Positivt Negativt Totalt Konkordans: 79 % (76 82 %) 95 % konfidensintervall. ( ) P04087SE_K / s. 19/51

20 Bröstcancer Den totala binära konkordansen mellan HercepTest och CTA var 79 % (431/548), med ett tvåsidigt 95 % konfidensintervall på 76 82%. Tjugoen procent (21 %) av resultaten var oeniga mellan dessa båda metoder. HercepTest -resultat rapporteras med en 0 3+ skala som tolkas som negativt för HER2- proteinöveruttryck (0 och 1+ färgningsintensitet), svagt positivt (2+ färgningsintensitet) och starkt positivt (3+ färgningsintensitet). Tabell 5. En 3 x 3 överensstämmelse för HercepTest och Clinical Trial Assay. Klinisk prövning Totalt HercepTest Totalt Denna 3 x 3 framställning av konkordansundersökningen indikerar att en 3+ avläsning med HercepTest högst sannolikt skulle motsvara ett positivt resultat med CTA, vilket skulle ha uppfyllt inträdeskriterierna för prövningen med Herceptin (2+ eller 3+). Ett fynd av 2+ på HercepTest korrelerade inte lika väl med CTA-resultaten. Cirka 42 % (53/126) av HercepTest 2+ resultaten var negativa med CTA (0 1+), vilket inte skulle ha medgivit deltagande i de kliniska prövningarna med Herceptin. Precision HercepTest testades även på två mikroskopglas innehållande paraffininbäddade vävnadssnitt från 168 brösttumörer. Dessa tumörer hade tidigare karakteriserats med fem olika metoder för bestämning av HER2-genamplifiering och överexpression av HER2-protein, inklusive egen Southern blot, fluorescens in situ-hybridisering (FISH) för amplifiering av DNA, Northern blot RNA-analys, Western blot och immuncytokemi (ICC) på frysta vävnader (29). Resultaten visas i Tabell 6. Tabell 6. Jämförelse mellan HercepTest och kombinerade resultat (OE) från genförstärkning och HER2-proteinöveruttryckstest. Referens OE-klassificering + - Totalt HercepTest Totalt Positiv överensstämmelse: 43/69 = 62 % Negativ överensstämmelse: 99/99 = 100% Resultaten indikerade en 85 % (142/168) nivå av överensstämmelse (95 % konfidensintervall på 78 89%) mellan positiviteten (2+ och 3+) och negativiteten (0 och 1+) färgningsintensitet med HercepTest. Inga av proverna som var negativa med de fem olika metoderna var positiva med HercepTest, medan de kombinerade resultaten för de fem olika metoderna visade ett större antal positiva fall. Reproducerbarhet Reproducerbarhet inom körning: Reproducerbarhet inom körningar testades i ett laboratorium med fem prover av olika ICC färgningsintensitetspoäng. Varje prov kördes i triplikat i ett maskerat, randomiserat format. Detta protokoll användes med automatisk färgning. Alla prover gav 100 % reproducerbara resultat. ( ) P04087SE_K / s. 20/51

21 Bröstcancer Reproducerbarhet mellan körningar: Reproducerbarheten mellan körningar testades vid tre laboratorier under fyra dagar med fem prover med olika färgningsintensitetspoäng, som randomiserats och maskerats med användning av automatisk metodologi. Utmärkt reproducerbarhet noterades för positiva kontra negativa resultat (0 och 1+ kontra 2+ och 3+) förutom två prover i ett laboratorium, som varierade mellan 1+ och 2+. Reproducerbarheten var 100 % för 2+ och 3+ proverna. Reproducerbarhet mellan laboratorier: Reproducerbarheten mellan laboratorier testades vid tre geografiskt åtskilda laboratorier med 40 identiskt randomiserade och maskerade prover med olika ICC-färgningsintensitetspoäng. Färsksnittade preparat skickades till alla testlaboratorier för automatiserad färgning och bedömning av en patolog. Den procentuella överensstämmelsen mellan laboratorierna var från 83 % till 90 % vid en tvådelad positiv/negativ bestämning där 0 och 1+ var negativa och 2+ och 3+ var positiva för överexpression av HER2- protein. Jämfört med de resultat som erhölls vid referenslaboratoriet som utfört CTA, var 12,5 % (15/120) av jämförande resultat motsägande mellan negativa (0 eller 1+) och positiva (2+ eller 3+) bestämningar. Ytterligare 10 % (12/120) var motsägande mellan 2+ och 3+ poäng. Immunreaktivitet Tabell 7 innehåller en sammanfattning av HercepTest immunreaktivitet med den rekommenderade panelen av normala vävnader: Alla vävnader formalinfixerades, paraffininbäddades och färgades med HercepTest enligt instruktionerna i bipacksedeln. Tabell 7. Sammanfattning av HercepTest normal vävnadsreaktivitet. Vävnadstyp (nr Testad) Binjure (3) Benmärg (3) Hjärna/cerebellum (3) Hjärna/cerebrum (3) Bröst (3) Cervix uteri (3) Kolon (3) Esofagus (3) Hjärta (3) Njure (3) Lever (3) Lunga (3) Mesotelceller (3) Äggstock (3) Bukspottkörtel (3) Bisköldkörtel (3) Perifer nerv (3) Hypofys (3) Prostata (3) Spottkörtel (3) Skelettmuskel (3) Hud (3) Tunntarm (3) Mjälte (3) Mage (3) Testis (3) Tymus (3) Sköldkörtel (3) Tonsill (3) Livmoder (3) Positiv färgning av vävnadselement och färgningsmönster Bröstkörtel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet) Tubuli i njurmedulla (3 av vävnader, 1 2+ i 5 50 % av celler, cytoplasmisk Prostatakörtel/gångar (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 50 % av celler, cytoplasmisk) Svettkörtlar (1 av 3 vävnader, 1+, 30 % av celler, cytoplasmisk) Cylinderepitel, yta (1 av 3 vävnader, 2+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Epitel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Skivepitel (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 80 % av celler) Den rapporterade färgningen i alla vävnader var membran, om inte annat anges. Alla tre prover av varje vävnadstyp hade samma färgningsintensitet om inget annat anges. ( ) P04087SE_K / s. 21/51

22 Bröstcancer Felsökning - Bröst Se Felsökningsavsnittet i Dakos tidigare refererad manual (19) för hjälpåtgärder eller kontakta Dakos serviceavdelning för att rapportera ovanlig färgning. Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder 1. färgning av objektglas 2. Svag färgning av objektglas 1a. Programmeringsfel. Reagenser används inte i rätt ordning 1b. Reagensvialer laddades inte på rätt platser i reagensställ 1c. Otillräckligt med reagens i reagensvial 1d. Natriumazid i tvättlösning 1e. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan leda till förlust av synlig HER2- immunreaktivitet. 2a. Otillräcklig epitopåtervinning 2b. Otillräckliga inkubationstider för reagens 2c. Olämplig fixeringsmetod används 2d. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan orsaka en signifikant minskning av synlig HER2-immunreaktivitet 2e. Otillräcklig reagensvolym applicerad. 1a. Kontrollera programmeringstabell för att kontrollera att färgningskörningen programmerades på rätt sätt 1b. Kontrollera reagenskartan för att kontrollera rätt plats på reagernsvialer 1c. Se till att tillräckligt med reagens är laddat i reagensvialerna före start av körning. Se reagenskartan för nödvändiga volymer 1d. Använd färsk tvättbuffert i kitet 1e. Vävnadssnitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torka vid 37 C över natten eller vid 60 C i maximalt en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2a. Verifiera att epitopåtervinningslösningen når upp till C i hela 40 minuter och låt den svalna i ytterligare 20 minuter 2b. Granska färgningsprocedurens instruktioner 2c. Se till att patientvävnad inte fixeras för mycket eller att ett alternativt fixativ inte används 2d. Vävnadssnitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torkas vid 37 C över natten eller vid 60 C i högst en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2e. Kontrollera vävnadssnittets storlek (22 mm x 22 mm) och applicerad reagensvolym. ( ) P04087SE_K / s. 22/51

23 Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder Bröstcancer 3. För mycket bakgrundsfärgning på objektglas 4. Vävnad lossnar från objektglas 3a. Paraffin har inte tagits bort tillräckligt 3b. Stärkelsetillsatser används vid montering av snitt till objektglas 3c. Objektglas är inte noggrant sköljda 3d. Snitt torkade under färgningsprocedur 3e. Snitt torkade vid laddning av Autostainer 3f. Olämplig fixeringsmetod används 3g. Icke-specifik bindning av reagenser till vävnad 4a. Användning av felaktigt objektglas 3a. Använd färska klarningslösningar och följ proceduren som beskriven i avsnitt B.1 3b. Använd inte stärkelsetillsatser för att fästa snitten vid objektglasen. Många tillsatser är immunoreaktiva 3c. Se till att Autostainer är rätt primad före körning. Kontrollera att det finns tillräckligt med buffert för hela körningen. Använd färska buffert- och tvättlösningar 3d. Verifiera att lämplig reagensvolym appliceras på objektglasen. Se till att Autostainer körs med stängd huv och inte utsätts för mycket värme eller drag 3e. Se till att snitt är fuktiga med buffert vid laddning och före körningsstart 3f. Se till att ett godkänt fixativ använts. Alternativt fixativ kan orsaka för mycket bakgrundsfärgning 3g. Kontrollera fixeringsmetod för provet och förekomst av nekros 4a. Använd silaniserade objektglas, som Dako Silanized Slides, Kod S3003, SuperFrost Plus eller poly-l-lysin-belagda objektglas 5. För stark specifik färgning 5a. Olämplig fixeringsmetod används 5a Se till att endast godkända fixativ och fixeringsmetoder används 6. Svag färgning av 1+ kontrollobjektglasets cellinje 5b. Användning av olämplig värmekälla för epitopåtervinning, t.ex. förångare, mikrovågsugn eller autoklav 5c. För lång inkubationstid för reagens 5d. Olämplig tvättlösning används 6a. Felaktigt epitopåtervinningsprotokoll har följts 6b. reaktion med substrat- 5b. Se till att endast vattenbad används vid epitopåtervinningssteget 5c. Granska färgningsprocedurens instruktioner 5d. Använd endast tvättbufferten som rekommenderas för kitet 6a. Sänk ned objektglas i förvärmd epitopåtervinningslösning. Få tillbaka temperaturen för epitopåtervinningslösningen till C och förvärm i hela 40 minuter 6b. Se till att hela 10 minuters ( ) P04087SE_K / s. 23/51

24 Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder kromogen lösning (DAB) Bröstcancer inkubationstid används. Se till att endast en droppe av DABkromogen tillsätts till 1 ml DABbuffrat substrat 7. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid uppvärmning 8. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid förvaring (före uppvärmning) 6c. Degradering av kontrollobjektglas 7. Lösningen blir grumlig när den värms upp 8. Lösningen har förvarats på felaktigt sätt eller också har lösningens utgångsdatum passerats 6c. Kontrollera kitets utgångsdatum och kitets förvaringsförhållanden utanför förpackningen 7. Detta är normalt och påverkar inte färgningen 8. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden på förpackningens utsida. Kassera epitopåtervinningslösningen OBS! Om problemet inte kan härröras till någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna korrigeringsåtgärden inte löser problemet, kontakta Dakos serviceavdelning för vidare assistans. Ytterligare information om färgningstekniker och provförberedning kan hittas i Dakos tidigare refererade Handbook (19) (tillänglig från Dako), Atlas of Immunohistology (30) och Immunoperoxidase Techniques. A practical approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087SE_K / s. 24/51

25 Magcancer Sammanfattning och förklaring - Mage Bakgrund: Den humana HER2-genen, (även kallad ERBB2 ellerneu) kodar ett protein som ofta kallas HER2-protein eller p185 HER2. HER2-proteinet är ett membranreceptortyrosinkinas med homologi med den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1 8). HER2-proteinet är en normal komponent, som uttrycks av flera olika epitelialcelltyper. 8 Överexpression av HER2-proteinet och amplifiering av HER2-genen i magcancer har påvisats i ett flertal olika studier (32). HER2-positivitet kan detekteras hos cirka 20 % av patienterna genom antingen IHC eller FISH (32). Förkliniska in vitro- och in vivo-studier har påvisat att trastuzumab (Herceptin ) är effektiv i olika magcancermodeller vilket således leder till att flera kliniska studier startas (32-36). I en fas III-studie BO18255, ToGA-prövningen, randomiserades HER2-positiva patienter med lokalt framskriden cancer som inte går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen för att få 5-FU eller capecitabine och cisplatin, antingen enbart eller i kombination med trastuzumab. En statistiskt signifikant ökning av total överlevnad (OS) observerades hos patienter som fick en kombinerad behandling bestående av trastuzumab och kemoterapi (37, 38). Trastuzumab är en humaniserad monoklonal antikropp, som binder med hög affinitet till HER2-proteinet och har visat sig hämma proliferationen av humana tumörceller som överuttrycker HER2-protein in vitro och in vivo (33-36). Egenskaper 3803 patienter har screenats för HER2-status för medverkan i ToGA-studien. I denna studie uppmättes både överexpression av HER2-protein genom IHC (HercepTest, Dako) och HER2-genförstärkning genom FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). Giltiga testresultat erhölls i 3665 prover med antingen IHC- eller FISH-tester och i 3280 prover med båda testerna. Resultaten från ToGA-studien visade att 22,1 % av patienterna med långt framskriden magcancer var HER2-positiva enligt IHC eller FISH enligt definitionen av ToGA HER2 urvalskriterier (38). Se bipacksedeln för Herceptin för ytterligare information om användning av HercepTest vid bedömningen av patienter för vilka trastuzumab-behandling övervägs. Procedurens princip - Mage HercepTest innehåller reagenser som krävs för att utföra en tvåstegs immunocytokemisk färgningsprocedur för rutinmässigt bearbetade paraffininbäddade prover. Efter inkubering med den primära kanin-antikroppen mot humant HER2-protein, använder denna sats en bruksfärdig Visualization Reagent baserad på dextranteknik. Denna reagens består av både sekundära anti-kaninimmunglobulinmolekyler från get och pepparrotsperoxidasmolekyler bundna till en gemensam dextranpolymerryggrad, vilket sålunda eliminerar behovet av sekventiell applicering av länkantikropp och peroxidaskonjugerad antikropp. Korsreaktion av visualiseringsreagenset med humana immunoglobuliner och kalvfosterserum har avlägsnats genom absorption i fast fas. Den enzymatiska konverteringen av det därefter tillsatta kromogenet resulterar i att en synlig reaktionsprodukt bildas på antigenplatsen. Provet kan därefter motfärgas och förses med täckglas. Resultaten tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollpreparat som innehåller tre formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+ tillhandahålls för att validera färgningskörningarna. Färgningsintensiteten hos dessa cellinjer har korrelerats med antalet receptorer per cell. HercepTest, Kod nr K5207, är tillämpligt för automatiserad färgning med Autostainer. ( ) P04087SE_K / s. 25/51

26 Magcancer Reagenser - Mage Medföljande material Det uppräknade materialet nedan är tillräckligt för 50 tester (50 objektglas inkuberade med primärantikropp mot HER2-protein och 50 objektglas inkuberade med motsvarande negativt kontrollreagens). Antalet tester baseras på användning av 200 µl per vävnadssnitt (22 mm x 22 mm) av vialnr 1, 2, 3 och 4 och av substrat-kromogenlösningen (DAB). Kitet innehåller tillräckligt med material för maximalt 15 individuella färgningskörningar. Vialnr Kvantitet Beskrivning 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Peroxidas-blockeringsreagens: 3 % väteperoxid innehållande 15 mmol/l natriumazid (NaN3). Anti-humant kanin-her2-protein: Bruksfärdig affinitetsisolerad antikropp. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, innehållande stabiliserande protein. Immunogen: Syntetiskt C-terminalt fragment (intracytoplasmisk del) av HER2-proteinet, bundet till keyhole limpet hemocyanin. Specificitet: HER2-protein. Reningsmetod: Antikroppen affinitetsisoleras med användning av en immobiliserad HIER2-proteinpeptid. Visualiseringsreagens: Dextranpolymer konjugerad med pepparrotsperoxidas och affinitetsisolerade antikaninimmunoglobuliner från get. Levereras i Tris/HCl-buffert innehållande stabiliserande protein och ett antimikrobiellt medel. Negativt kontrollreagens: Immunglobulinfraktion av normalt kaninserum vid en ekvivalent proteinkoncentration som antikroppen mot HER2-protein. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, innehållande stabiliserande protein. DAB-buffrat substrat: Substratbuffertlösning, ph 7,5, innehållande < 0,1 % väteperoxid, stabilisatorer, förstärkare och antimikrobiellt medel. DAB-kromogen: 5 % 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid kromogenlösning. Epitopåtervinningslösning (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citratbuffert med antimikrobiellt medel. Tvättbuffert (10x): Tris/HCl-buffert med ett rengöringsmedel och ett antimikrobiellt agens. ( ) P04087SE_K / s. 26/51

27 3 x 5 objektglas Magcancer Kontrollobjektglas: Varje kontrollpreparat innehåller snitt av tre formalinfixerade, paraffininbäddade bröstcancercellinjer, som representerar olika nivåer av expression av HER2-protein. MDA-231 (0), MDA-175 (1+), och SK-BR-3 (3+). Kontrollpreparaten har värmebehandlats för att snitten ska fästa bättre vid objektglasen. Eventuell ytterligare värmebehandling av kontrollpreparaten, som utförs för att förbättra snittens vidhäftning till objektglasen, kan äventyra färgningsresultaten. OBS! Alla reagenser, inklusive epitopåtervinningslösning och tvättbuffert, formuleras specifikt för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras utom för tvättbufferten, där Dako Kod S3006 kan användas. Ytterligare erforderligt material som ej ingår Ammoniumhydroxid, 15 mol/l spätt till 37 mmol/l Motfärg: Hematoxylin, som det vattenbaserade Mayer's Hematoxylin, Dako Kod S3301 (se INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING, A.4) Täckglas Destillerat eller avjoniserat vatten (tvättvatten) Torkugn, som kan bibehålla 60 C eller lägre Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (4 40x objektivförstoring) Monteringsmedium, som t.ex. Dako Faramount, Kod S3025 eller Glycergel, Kod C0563 Positiva och negativa vävnader att använda som processkontroller (se avsnittet om Kvalitetskontroll) Objektglas, SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagda objektglas eller Dako Silanized Slides, Kod S3003 (se Provförberedning) Färgningskyvetter eller -bad Timer (kapabel till 2 40 minuters intervaller) Vattenbad med lock (kapabel att bibehålla epitopåtervinningslösning vid C) Xylen, toluen eller xylensubstitut K5207 har anpassats för användning med Autostainer Immunostaining System, Kod S3400. Se användarmanualen för Autostainer för nödvändiga Autostainer-komponenter. ( ) P04087SE_K / s. 27/51

28 Magcancer Förvaring - Mage Förvara vid 2 8 C. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som är tryckt på förpackningen. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som anges i produktbladet (14a,14b). Observera att kontrollobjektglas också måste förvaras vid 2 8 C. Det finns inga tydliga tecken som tyder på instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller köras simultant med patientprover. Om oförväntad färgning upptäcks som inte kan förklaras av variationer i laboratorieutföranden och ett problem med HercepTest misstänks, kontakta omedelbart Dakos serviceavdelning. Provförberedning - Mage Biopsier, excisioner eller resektioner som tagits från adenocarcinomprover i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen måste hanteras så att vävnaden bevaras för immuncytokemisk färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling bör användas för alla prover (15). Vid testning av små biopsiprover måste man säkerställa att tumörmorfologin är intakt och att det finns tillräckligt många tumörceller för IHCutvärdering. Om en HercepTest -analys utförs på ett biopsiprov, bör flera (7-8) biopsier från olika delar av tumören analyseras för att man ska uppnå en tillförlitlig bestämning av HER2-statusen. Paraffininbäddade snitt Endast vävnad bevarad i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddning lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis göras till 3 4 mm tjocka block och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Biopsiproverna fixerades i 6-8 timmar i ToGA-prövningen (se (37) för studiereferens). Vävnader dehydreras därefter i en serie med alkohol och xylen, följt av en infiltration av smält paraffin vid en temperatur på högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader som uttrycker HER2-protein kommer att vara stabila länge före snittning och montering på objektglas om de förvaras kallt (15 25 C) (15, 16). I USA kräver Cl inical Laboratory Improvement Act, 1988 i 42 CFR (b) att Laboratoriet måste behålla färgade objektglas i minst tio år från undersökningsdatum och provblock i minst två år från undersökningsdatum (16). Vävnadsprover ska skäras i snitt på 4 5 µm, monteras på objektglas och lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar (eller tills de är torra), vid 37 C över natten eller vid 60 C i en timme. VARNING! För hög värme i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller förlust av den specifika membran-associerade HER2-immunreaktiviteten (17). För att bevara antigeniciteten bör snitt som monterats på objektglas (SuperFrost Plus, Poly-Llysine eller silaniserade objektglas) färgas inom 4 6 veckor efter snittning, vid förvaring vid rumstemperatur (20 25 C) (18). Objektglas som krävs fö r HER2-proteinutvärdering och verifiering av tumörförekomst bör förberedas samtidigt. Minst fem objektglas rekommenderas, ett objektglas för tumörförekomst, två objektglas för HER2-proteinutvärdering (ett för inkubation med vialnr 2 och ett för inkubation med vialnr 4) och två objektglas för backup. Användning av HercepTest TM på avkalkade vävnader har inte kontrollerats och rekommenderas inte. Se Dakos Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) och litteraturhänvisningarna 15 och 16 för ytterligare information om provpreparation. Bearbetning av vävnader före färgning En specifik epitopåtervinningsmetod i 10 mmol/l citratbuffert måste användas för optimal analysprestanda. Epitopåtervinningslösningen medföljer HercepTest -satsen. Denna metod inbegriper uppvärmning av vävnadssnitt monterade på objektglas som nedsänks i 10 mmol/l citratbuffert (20) i ett kalibrerat vattenbad kapabelt att hålla epitopåtervinningslösningen vid nödvändig temperatur (95 99 C). Laboratorier lokali serade på höga platser bör bestämma den bästa metoden för att hålla den nödvändiga vattenbadstemperaturen. Epitopåtervinningen ( ) P04087SE_K / s. 28/51

29 Magcancer måste utföras i ett vattenbad. Andra uppvärmningsmetoder har testats och ger inga reproducerbara resultat. Påbörja färgningsproceduren omedelbart efter epitopåtervinning. Avvikelse från den beskrivna proceduren kan påverka resultaten. Försiktighetsåtgärder - Mage 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Vial 1, peroxidas-blockeringsreagens, innehåller 3 % väteperoxid. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 4. Vial 6, DAB-kromogen, innehåller 5-<10% bifenyl-3,3',4,4'- tetrayltetraammoniumtetraklorid och är märkt: H350 H341 P201 P280 Fara P308 + P313 P405 P501 Kan orsaka cancer. Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. Inhämta särskilda instruktioner före användning. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (SDS). 5. Vial 8, tvättbuffert, innehåller 5-<10% 2-amino-2-(hydroximetyl)propan-1,3-diolhydroklorid och 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxolan. Kan ge allergisk reaktion. Wash Buffer (10x) är märkt: Varning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 6. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3 ), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Vid kassering, spola med stora mängder vatten för att undvika att metallazider ackumuleras i rören (21, 22). 7. Vial 2, 3 och 4 innehåller material av animaliskt ursprung. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 8. Kontrollglas och prover, före och efter fixering, samt alla material som exponerats för dessa, bör hanteras som potentiellt smittbärande och kasseras med lämpliga försiktighetsåtgärder (23). Pipettera aldrig reagenser med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagenser och prover. Om reagenserna kommer i kontakt med känsliga områden, tvätta med stora mängder vatten. ( ) P04087SE_K / s. 29/51

30 Magcancer 9. Minimera mikrobiell kontamination av reagenser genom att undvika icke-specifik färgning. 10. Andra inkubationstider, temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. För lång torkning i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller förlust av den specifika membran-associerade HER2-immunreaktiviteten (17). 11. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i minskad antigenfärgning. 12. Alla reagenser, inklusive epitopåtervinningslösning och tvättbuffert, formuleras specifikt för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras utom för tvättbufferten, där Kod S3006 kan användas. 13. Visualiseringsreagens och DAB-kromogen kan påverkas negativt om de utsätts för höga ljusnivåer. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, såsom direkt solljus. 14. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Se materialsäkerhetsdatabladet (SDS) för ytterligare information. 15. Rester av paraffin kan leda till falska negativa resultat. 16. För korrekt tolkning av resultaten av HercepTest på färgade biopsiprover från adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, rekommenderas ett kluster om minst 5 färgade tumörceller. Ett kluster om minst 5 färgade tumörceller består av 5 länkade HER2-färgade tumörceller. 17. På grund av magcancerbiopsiprovernas heterogena natur är det viktigt att utföra HER2 IHC-analyserna på flera delar (7-8) av biopsier från olika regioner på tumören för att få fram ett tillförlitligt resultat. 18. Användning av andra reagensvolymer än de som rekommenderas kan leda till förlust av synlig HER2-immunreaktivitet. Vävnadssnitt större än 22 mm x 22 mm kräver 2-3 x 200 µl reagens, applicerat på 2-3 automatiserade applikationsområden. 19. Det rekommenderas att mer än ett vävnadsblock med resektat av magcancer testas när provet uppvisar en hög grad av heterogenitet (41). INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Mage A. Reagensförberedning Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: A.1 Epitopåtervinningslösning Späd en tillräcklig kvantitet av vial 7 (epitopåtervinningslösning x 10) 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten för färgningsproceduren som planeras. Oanvänd spädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den spädda lösningen om den är grumlig. A.2 Tvättbuffert Späd en tillräcklig kvantitet av vial 8 (tvättbuffert x 10) 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten för tvättstegen. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en m ånad. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. Autostainer är programmerad för att skölja vävnadssnitt efter peroxidas-blockeringsreagenset och substrat-kromogenlösningen. Observera att för dessa sköljsteg kan antingen destillerat (eller avjoniserat) vatten eller tvättbuffert användas. Alla andra sköljsteg kräver användning av tvättbuffert. A.3 Substrat-kromogenlösning (DAB) Bered substrat-kromogenlösning genom att tillsätta 11 droppar (25 30 µl per droppe) DABkromogen från flaska 6 till en flaska 5 innehållande DAB-buffrat substrat (11 ml) och blanda. Förberedd substrat-kromogenlösning (DAB) är stabil i ungefär fem dagar när den förvaras vid ( ) P04087SE_K / s. 30/51

31 2 8 C. Denna lösning bör grundligt blandas före använ dning. Eventuell utfällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. OBS! Färgen på DAB-kromogen i vial 6 kan variera från klar till ljust blåbrun. Det här påverkar inte produktens prestanda. Späd enligt riktlinjerna i den här bipacksedeln. Tillsats av överflödigt DAB-kromogen till DAB-buffrat substrat resulterar i försämring av den positiva signalen. Magcancer ( ) P04087SE_K / s. 31/51

32 Magcancer A.4 Motfärg DAB-färgningsreaktionens färgade slutprodukt är olöslig i alkohol och vatten. Använd en hematoxylin-kontrastfärg och justera hematoxylin-färgningsintensiteten till en liknande nivå som visas i Dakos HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer. Hematoxylin, antingen alkohol- eller vattenbaserad, som Dako Mayers Hematoxylin, Kod S3301, kan användas. Följ hematoxylin-kontrastfärgning med en noggrann sköljning i destillerat eller avjoniserat vatten och sänk därefter ned vävnadsobjektglas i ett bad med 37 mmol/l ammoniakvatten (se avsnitt B.2, steg 3). Ammoniakvatten (37 mmol/l) förbereds genom blandning av 2,5 ml av 15 mol/l (koncentrerad) ammoniumhydroxid med 1 Liter destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänt 37 mmol/l ammoniakvatten kan förvaras i rumstemperatur (20 25 C) i en flaska med hårt påskruvat lock i upp ti ll 12 månader. A.5 Monteringsmedel Icke vattenhaltigt, pemanent monteringsmedium rekommenderas. Vattenhaltig montering är emellertid också acceptabelt. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, färdig för bruk, Kod S3025 eller Glycergel Mounting Medium, Kod C0563, rekommenderas för vattenhaltig montering. Lös upp Glycergel genom uppvärmning till ungefär 40 (±5) C före användning. B. Färgningsprocedur utförd på Autostainer B.1 Proceduranmärkningar Användaren bör läsa dessa instruktioner noggrant och känna till alla komponenter och funktion före användning (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser bör ha antagit rumstemperatur (20 25 C) före immunofärgning. På samma sätt bör alla inkubationer utföras i rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitt torka medan objektglas laddas på Autostainer och under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Om färgningsproceduren avbryts kan glasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av primärantikroppen i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C) utan att färgningsresultatet påverkas. Avparaffinisering och rehydrering: Före färgning måste vävnadsobjektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Undvik ofullständigt avlägsnande av paraffin. Kvarlämnat inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglas i xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Slå av vätskeöverskott och placera objektglas i absolut etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Slå av vätskeöverskott och placera objektglas i 95 % etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i destillerat eller avjoniserat vatten i minst 30 sekunder. Påbörja färgningsproceduren som beskriven i avsnitt B.2, steg 1, Epitopåtervinning. Xylen- och alkohollösningar ska bytas efter 40 objektglas. Toluen eller xylen-substitut, som Histoclear, kan användas i stället för xylen. OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer denna sats har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra analysresultaten ogiltiga för användning vid urval av patienter för Herceptin -terapi. ( ) P04087SE_K / s. 32/51

33 B.2 Färgningsprotokoll Utförd i rumstemperatur, C. Magcancer Steg 1: Epitopåtervinning Fyll färgningskärl, t.ex.coplin-kärl, med den spädda epitopåtervinningslösningen (se INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärl med epitopåtervinningslösning i vattenbad. Värm upp vattenbadet och epitopåtervinningslösningen till C. Efter uppvärmning blir epitopåtervinnningslösningen grumlig. Täck kärlen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda epitopåtervinningslösningen i färgningskärlen. ÅTERFÖR TEMPERATUREN PÅ VATTENBADET OCH EPITOPÅTERVINNINGSLÖSNINGEN TILL C. Inkubera i 40 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Låt objektglas svalna i epitopåtervinningslösningen i 20 (±1) minuter i rumstemperatur. Håll ut epitopåtervinningslösningen och skölj snitt i tvättbuffert (se INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING, avsnitt A.2). Lägg snitten i tvättbufferten i 5 20 minuter efter epitopåtervinningen och före färgningen för optimal prestanda. OBS! Epitopåtervinningslösningen är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Autostainer-procedur 1. Använd Autostainer-genererad karta med HercepTest -autoprogram för nödvändiga programtider och reagensvolymer (se punkt 4 nedan för specifika volymer). 2. Placera Autostainer-reagensvialer i Autostainerns reagensställ i enlighet med den datorgenererade reagenskartan. 3. Ladda objektglas på Autostainern i enlighet med den datorgenererade objektglaskartan. 4. Ställ in programmet och påbörja HercepTest -programmet. Följande är en beskrivning av programkörningen: Skölj 200 µl peroxidas-blockeringsreagens - 5 minuter Skölj 200 µl primärt anti-her2-protein (eller negativt kontrollreagens) - 30 minuter Skölj 200 µl visualiseringsreagens - 30 minuter Skölj Skölj Byt 200 µl substrat-kromogenlösning (DAB) - 10 minuter Skölj objektglas i avjoniserat vatten efter substrat-kromogensteget OBS! Autostainer maskinvaruversion 01 sköljer objektglas i buffert. Därför måste objektglas sköljas med avjoniserat vatten efter att de tagits bort från Autostainern. ( ) P04087SE_K / s. 33/51

34 Steg 3: Kontrastfärgning (instruktionerna är tillämpliga på hematoxylin) Ta bort objektglas från Autostainern och kontrastfärga i hematoxylin som beskrivet nedan. Sänk ned objektglas i ett hematoxylin-bad. Inkubera i 2 5 minuter, beroende på styrkan hos använt hematoxylin. Skölj försiktigt i ett destillerat eller avjoniserat vattenbad. Se till att återstående hematoxylin har avlägsnats. Magcancer Valfritt: Doppa objektglas tio gånger i ett bad med 37 mmol/l ammoniakvatten (se avsnitt A.4). Skölj objektglas försiktigt i ett destillerat eller avjoniserat vattenbad i 2 5 minuter. OBS! Beroende på inkubationslängden och styrkan hos det hematoxylin som används, kommer kontrastfärgningen att ge en blek till mörk blåfärgning av cellkärnor. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. Steg 4: Montering Icke vattenhaltigt, permanent monteringsmedium rekommenderas. Vattenhaltigt monteringsmedel är emellertid också acceptabelt. Prover kan monteras och förses med täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedium som Dako Faramount, Kod S3025 eller Glycergel, Kod C0563. OBS! Objektglasen kan avläsas när så är lämpligt. Viss blekning förekommer emellertid om objektglasen täcks med ett vattenhaltigt monteringsmedium och utsätts för starkt ljus under en period på en vecka. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekning en. Kvalitetskontroll - Mage Avvikelser i vävnadsfixering, behandling och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt med regelbundna egna kontroller utöver användningen av kontrollpreparaten från Dako. För USA, se kvalitetskontrollriktlinjer från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se också CLSI (före detta NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24) och referens 25 för ytterligare information. Tabell 8. Ändamålet för daglig kvalitetskontroll. Vävnad: Fixerade och behandlade som patientprover Positiv kontroll: Vävnader eller celler som innehåller målantigen som ska detekteras (kan finnas i patientvävnad). Den ideala kontrollen är svagt positivt färgande vävnad eftersom denna är mest känslig för antikropps- eller antigendegradering. Specifik antikropp och sekundär antikropp Kontrollerar alla stegen i analysen. Validerar reagenser och procedurer som används för HER2-proteinfärgning Icke-specifik antikropp* eller buffert plus samma sekundära antikropp som används med specifik antikropp Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Negativ kontroll: Vävnader eller celler som förväntas vara negativa (kunde lokaliseras i patientvävnad eller positiv kontrollvävnad) Detektion av oavsiktlig korsreaktivitet mellan antikropp och celler/cellulära komponenter Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Patientvävnad Detektion av specifik färgning Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Kontrollpreparat tillhandahålls av Dako Färgningsprocedur endast för kontroller * Serum från samma art som den specifika antikroppen, men inte riktade mot samma målantigen. För att detektera icke-specifik antikroppsbindning, t.ex. bindning av Fc-delen av antikroppen genom vävnaden. ( ) P04087SE_K / s. 34/51

35 Magcancer Kontrollpreparat (medföljer): Vart och ett av de medföljande kontrollpreparaten innehåller tre pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+. Ett objektglas bör färgas i varje färgningskörning. Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. Positiv kontrollvävnad: Kontroller bör vara färska autopsi-/biopsi-/kirurgiska prover, som fixerats, behandlats och inbäddats så snart som möjligt på samma sätt som patientprovet (proverna). Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt preparerad vävnad och korrekt färgningsteknik. En positiv kontrollvävnad för varje sats testförhållanden bör inkluderas i varje färgningskörning. De positiva kontrollvävnaderna ska ge svag positiv färgning så att de kan detektera små förändringar i den primära antikroppens sensitivitet. Kontrollpreparaten som levereras med detta system eller prover som behandlats annorlunda än patientprover validerar endast reagensprestanda och verifierar inte vävnadspreparationen. Använd tidigare fastställd HER2 protein2+ -överuttryckande vävnad från adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, som idealisk positiv kontrollvävnad. OBS! Kända positiva kontrollvävnader bör endast användas för att övervaka korrekt prestanda av behandlade vävnader och testreagenser, INTE som ett hjälpmedel för att formulera en specifik diagnos av patientprover. Om positiva kontrollvävnader inte uppvisar riktig positiv färgning bör resultaten med testproverna anses som ogiltiga. Negativ kontrollvävnad: Använd en negativ kontrollvävnad (som är känt HER2 - proteinnegativ), som fixerats, behandlats och inbäddats på samma sätt som patientproverna, med varje färgningskörning för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppen och för att ge en indikation på specifik bakgrundsfärgning. Kolon, lever och sköldkörtel är lämpliga för negativ kontrollvävnad. Mångfalden av olika celltyper, som förekommer i de flesta vävnadssnitt, ger interna negativa kontrollsiter (detta måste verifieras av användaren). Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga. Icke-specifikt negativt kontrollreagens: Använd det medföljande negativa kontrollreagenset istället för den primära antikroppen med ett snitt av varje patientprov för att utvärdera ickespecifik färgning och åstadkomma en bättre tolkning av specifik färgning på antigenplatsen. Inkuberingsperioden för negativt kontrollreagens bör motsvara inkuberingsperioden för den primära antikroppen. Analysverifikation: Före användning av en antikropp eller färgningssystem i en diagnostisk procedur bör användaren verifiera antikroppens specificitet genom att testa den med en serie interna vävnader med kända immuncytokemiska prestandaegenskaper som representerar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurer som tidigare beskrivits i det här avsnittet av bipacksedeln och till kvalitetskontrollkrav i CAP Certification Program for Immunohistochemistry och/eller CLSI (före detta NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Dessa kvalitetskontrollprocedurer bör upprepas för varje ny sats med antikroppar eller när analysparametrarna ändras. Adenocarcinom i magen inklusive den gastroesofageala förbindelsen med kända HER2-proteinfärgningsintensiteter från 0-3+ och negativa vävnader, t.ex. kolon, lever eller sköldkörtel, är lämpliga för analysverifiering. ( ) P04087SE_K / s. 35/51

36 Magcancer Färgningstolkning - Mage För bestämning av överexpression av HER2-protein bör endast färgningsintensiteten och mönstret för membranet utvärderas med användning av den skala som anges i Tabell 9. Utvärdering av objektglas ska utföras av en patolog med användning av ett ljusmikroskop. För utvärdering av immuncytokemisk färgning och poängsättning är ett objektiv med 10x förstoring lämpligt. Användning av ett objektiv med 5 40x förstoring är användbart för bekräftelse av intensiteten. Cytoplasmisk färgning bör anses som icke-specifik färgning och ingår inte i bedömningen av membran-färgningsintensitet (8). För hjälp med differentieringen av 0, 1+, 2+ och 3+ färgning, se Dakos HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer för representativa bilder på färgningsintensiteter och -mönster. Endast prover från patienter med adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, ska poängsättas. I fall med intestinal metaplasi och gastriskt adenocarcinom i samma prov ska endast den gastriska adenocarcinomkomponenten poängsättas. För tolkning av HercepTest -färgade biopsier rekommenderas ett kluster med minst 5 färgade tumörceller. Ett kluster om minst 5 färgade tumörceller består av 5 länkade HER2-färgade tumörceller. Tabell 9. Tolkning och poängsättning av HER2-immohistokemisk färgning Poäng Kirurgiskt prov Färgningsmönster Biopsiprov Färgningsmönster Bedömning av överexpression av HER2-protein 0 reaktivitet eller ingen membranös reaktivitet i < 10 % av tumörceller reaktivitet eller ingen membranös reaktivitet i någon (eller < 5 klustrade) tumörcell Negativt 1+ En svag/knappt märkbar membranös reaktivitet i 10 % av tumörcellerna; cellerna är reaktiva i endast en del av deras membran Tumörcellkluster ( 5 celler) med en svag/knappt märkbar membranös reaktivitet oberoende av antalet färgade tumörceller Negativt 2+ En svag till måttlig fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet i 10 % av tumörcellerna. Tumörcellkluster ( 5 celler) med en svag till måttlig fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet oberoende av antalet färgade tumörceller Osäkert 3+ En stark fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet i 10 % av tumörcellerna. Tumörcellkluster ( 5 celler) med en stark fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet oberoende av antalet färgade tumörceller Positivt Riktlinjer baserade på Hofmann et al. (40). HercepTest tolkas som negativt för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ poäng), svagt positiv (2+ poäng), och starkt positiv (3+ poäng). HercepTest är inte avsett att tillhandahålla prognostisk information till patienten och läkaren och har inte validerats för detta ändamål. Objektglasen bör undersökas för varje färgningskörning i den ordning som anges i Tabell 10, för att fastställa färgningskörningens validitet och möjliggöra semikvantitativ bedömning av färgningsintensiteten hos provvävnaden. ( ) P04087SE_K / s. 36/51

37 Magcancer Tabell 10. Ordningsföljd vid utvärdering av objektglas Preparatavläsningsordning Logisk grund 1. Kontrollpreparat innehållande de tre cellinjerna Förekomst av 3+ brun cellmembranfärgning (i kanten) i 3+ Control Cell Line SK-BR-3, partiell brun kant i 1+ Control Cell Line MDA-175 och ingen färgning i 0 Control Cell Line MDA-231 påvisar en giltig analys Avbruten och osammanhängande membranfärgning förekommer i ett litet till moderat antal celler i den svagt positiva 1+ Control Cell Line MDA-175. Punktformig immunofärgning detekteras också i Golgi-området i cytoplasman i den här cellinjen. Närvaro av brun färgning i 0-kontrollcellinjen MDA-231 (negativ för HER2-proteinfärgning) indikerar att icke-specifik färgning förekom under analysen. Analysresultat kan vara ogiltiga på grund av överfärgning 2. Positiv kontrollvävnad Närvaro av brun membranfärgning bör observeras. Färgning av cytoplasman och negativa vävnader bör inte vara mer än Negativ kontrollvävnad FRÅNVARO av specifik färgning av den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik membranfärgning inträffar i negativt kontrollvävnadsobjektglas bör resultat med patientprov anses som ogiltiga 4. Patient-vävnad som färgats med negativt kontrollreagens Frånvaro av specifik membranfärgning verifierar den specifika märkningen av målantigen av den primära antikroppen Annan mörk eller brun färgning i cytoplasman av det prov som behandlats med det negativa kontrollreagenset, som bindväv, leukocyter, erytrocyter eller nekrotisk vävnad, bör anses som icke-specifik bakgrundsfärgning och bör rapporteras under kommentardelen på datarapportbladet 5. Patient-vävnad som färgats med användning av den primära antikroppen När HER2-proteinöveruttryck detekteras i provet visas det som en brun kant lokaliserad på cellmembranet i tumörceller behandlade med den primära antikroppen 1. Kontrollpreparat (medföljer): Kontrollpreparatet, som färgats med HercepTest, bör undersökas först för att säkerställa att alla reagenser fungerar korrekt. Närvaron av en brun (3,3 -diaminobensidin, DAB) reaktionsprodukt på cellmembranet indikerar en positiv reaktivitet. Närvaro av periferisk, brun cellmembranfärgning (kantning) i 3+ kontrollcellinjen SK-BR-3, partiell brun kantning i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, och ingen färgning i 0 kontrollcellinjen MDA-231, indikerar en giltig analys. Om någon av kontrollcellinjerna är utanför dessa kriterier ska alla resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. 2. Positiv kontrollvävnad: Den positiva kontrollvävnaden bör undersökas därefter. Detta preparat verifierar att fixeringsmetoden och epitopåtervinningsprocessen är effektiva. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultaten eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt (26). Färgning bör observeras i tumörvävnad som brun cellmembranfärgning. Brun färgning av cytoplasman och negativa vävnader i provet bör inte motsvara mer än 1+ färgningsintensitetspoäng. ( ) P04087SE_K / s. 37/51

38 Magcancer 3. Negativ kontrollvävnad: Det negativa kontrollvävnadsobjektglaset bör undersökas efter den positiva kontrollvävnaden för att verifiera den specifika märkningen av målantigenet med den primära antikroppen. Frånvaron av specifik färgning i den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativa kontrollvävnad, men detta måste verifieras av användaren. Observera att en svag reaktion (0 1+ färgningsintensitet) kan observeras i normal epitelvävnad. Möjliga negativa kontrollvävnader innefattar: kolon, lever och sköldkörtel. Icke-specifik färgning, om sådan är närvarande, kommer att ha ett diffust utseende. Sporadisk färgning av bindvävnad kan också observeras i snitt från överdrivet formalinfixerade vävnader Patientvävnad: Undersök patientproverna som färgats med HercepTest sist. Positiv färgningsintensitet bör fastställas inom ramen för all icke-specifik bakgrundsfärgning med det negativa kontrollreagenset. Liksom med alla immuncytokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte detekterades, inte att antigenen var frånvarande i de analyserade cellerna/vävnaden. Se Sammanfattning och förklaring, Begränsningar, och Prestandaegenskaper för specifik information angående HercepTest immunreaktivitet. Ytterligare rekommendationer för tolkning av HercepTest -färgning Adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, som testats för överexpression av HER2-protein, poängsätts från 0 till 3+. Medan 0 och 3+ fallen är entydiga kan en liten del av de återstående 1+ och 2+ proverna vara svårare att tolka. Använd följande riktlinjer för tolkning av HercepTest -färgning i ert laboratorium. Utvärdera kontrollcellinjerna för att validera analysprestandan. Utvärdera de positiva och negativa kontrollpreparaten. En hematoxylin- och eosin- (H&E) färgning av vävnadsproven rekommenderas för den första utvärderingen. (Tumören kanske inte är uppenbar när man betraktar provet som färgats med HercepTest. Ett H&E-färgat objektglas krävs för att patologen ska verifiera förekomst av tumör.) HercepTest TM bör utföras på ett ihopparat snitt (seriellt snitt) från samma paraffinblock av provet. Utvärdera snitten som färgats för överexpression av HER2-protein först med låg förstoringeffekt. Majoriteten av positiva fall kommer att vara uppenbara vid låg förstoring med låg effekt. För 1+ fallen använd ett objektiv med 40x förstoring för att verifiera membranfärgningen. För 2+ fallen använd ett objektiv med 10 20x förstoring för att verifiera membranfärgningen. Kirurgiskt prov Väl konserverade och välfärgade områden hos provet bör inte användas för att fastställa procentvärdet positiva tumörceller. Om de flesta tumörceller uppvisar fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning är färgningen antingen 2+ eller 3+. Om en fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning vid stark intensitet förekommer i 10 % eller fler av tumörcellerna i kirurgiska prover är poängen för provet 3+. Om en fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning vid svag till måttlig intensitet förekommer i 10 % eller fler av tumörcellerna i kirurgiska prover är poängen för provet 2+. Om 10 % eller fler av tumörcellerna i kirurgiska prover, som färgats i endast en del av deras membran, har en svag/knappt märkbar intensitet är poängen för provet 1+. Om mindre än 10 % av tumörcellerna i kirurgiska prover har fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning, eller endast färgning i en del av deras membran, är poängen 0 Om ingen färgning observeras är poängen för det kirurgiska provet 0. ( ) P04087SE_K / s. 38/51

39 Biopsiprov Magcancer Ett kluster om minst 5 färgade tumörceller består av 5 länkade HER2-färgade tumörceller. Om det finns ett tumörcellkluster med minst 5 färgade tumörceller med en stark, fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning, är poängen för biopsiprovet 3+ oberoende av antalet färgade tumörceller. Om det finns ett tumörcellkluster med minst 5 färgade tumörceller med en svag till måttlig, fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning, är poängen för biopsiprovet 2+ oberoende av antalet färgade tumörceller. Om det finns ett tumörcellkluster med minst 5 färgade tumörceller med en svag/knappt märkbar membranfärgning och cellerna är endast färgade i en del av sina membran, är poängen för biopsiprovet 1+ oberoende av antalet färgade tumörceller. Om ingen färgning observeras är poängen för biopsiprovet 0. Om membranfärgning (oavsett färgningens intensitet) observeras i färre än 5 tumörceller i kluster är poängen för biopsiprovet 0. Begränsningar - Mage Allmänna begränsningar 1. Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialutbildning vid val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, beredning av IHC-preparaten och tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, värmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan ge artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. 4. Den kliniska tolkningen av positiv färgning, eller frånvaron av densamma, måste utvärderas inom ramen för den kliniska anamnesen, morfologin och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av all färgning eller frånvaro av färgning, måste kompletteras med morfologiska undersökningar och korrekta kontroller, såväl som andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog, som är förtrogen med antikropparna, reagenserna och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under övervakning av en patolog, som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och tillförsäkrar att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (27). Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnadstyper. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenexpression i neoplasmer eller andra patologiska vävnader (28). Kontakta Dakos serviceavdelning med dokumenterad oförväntad reaktion. 6. Falskt positiva resultat kan observeras på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. Detta kan även orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C) (28). 7. Färgningsproceduren bör utföras vid en omgivande temperatur på C. ( ) P04087SE_K / s. 39/51

40 Magcancer Produktspecifika begränsningar 1. Antigenen, som är närvarande i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, utsätts för degradering över tiden. Fastställ kontrollpreparatresultaten i samband med kontrollpreparatets utgångsdatum. Negativ färgning av MDA-175 cellerna kanske endast indikerar att kontrollpreparatet har degraderats. Kontrollobjektglasen måste förvaras vid 2 8 C. 2. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover bör färgas inom 4-6 veckor av montering av vävnader på objektglas när de förvaras i rumstemperatur (20 25 C) (29). 3. För optimala och reproducerbara resultat kräver HER2-proteinet värmeinducerad epitopåtervinning när vävnader rutinmässigt fixeras (neutralbuffrat formalin) och paraffininbäddas. Denna förbehandling behöver fullgöras i början av hela färgningsprocessen. Se Provförberedning-avsnitt, Behandling av vävnader före färgning för instruktioner. 4. Värmeinducerad epitopåtervinning av HER2-protein bör endast göras med ett kalibrerat vattenbad. Andra uppvärmningsmetoder har testats och ger inga reproducerbara resultat. 5. Ersätt inte kitreagenser med reagenser med andra satsnummer eller med reagenser från andra tillverkare. Det enda undantaget är tvättbufferten som kan ersättas med Dako Wash Buffer, Kod S Falska resultat kan erhållas från utvärdering av cytoplasmisk färgning. Beakta endast intensiteten av cellmembranfärgningen vid tolkning av resultat. 7. Färgade kontrollpreparat bör endast användas för validering av färgningskörningen och bör inte användas som en riktlinje för att poängsätta färgningsreaktionen i vävnadssnitt. 8. Starkt fokal färgning (3+), dvs. hot spots, kan ibland observeras. Detta kan vara resultatet av ojämn fixering och/eller behandling av vävnad. Immunfärgning av ett andra vävnadsblock från samma prov rekommenderas. 9. Användning av HercepTest på prover som fixerats i andra fixativ än neutralbuffrat formalin har inte validerats. 10. Observera att normalt tonsill- och esofagusepitel kan färga upp till 2+ intensitet. 11. Användning av icke hela magcancerprover och tolkning av artefaktuell färgning runt en biopsikant ska undvikas. Prestandaegenskaper - Mage Bakgrund: Säkerheten och effektiviteten av trastuzumab (Herceptin ) har påvisats i en klinisk studie (ToGA-prövningen) (38, 39). Studien var utformad som en öppen, randomiserad, multicenter fas III-studie av HER2-positiva patienter med långt framskriden lokal cancer som inte går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen. I ToGA-prövningen definierades HER2- positivitet som antingen IHC-positiv (3+), (HercepTest, Dako) och/eller positiv genom HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Efter inklusion i studien randomiserades patienterna för att få kemoterapi (5-FU eller capecitabine och cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Den primära slutpunkten i studien var total överlevnad (OS). I studien randomiserades sammanlagt 594 patienter och 584 patienter erhöll studieläkemedlet och inkluderades i FAS (Full Analyses Set) (full analysuppsättning). För den primära slutpunkten visade sig kombinationen av kemoterapi plus trastuzumab vara statistiskt överlägsen jämfört med behandling med endast kemoterapi. OS- ( ) P04087SE_K / s. 40/51

41 Magcancer medeltalet ökade från 11,1 till 13,8 månader (p=0,0046) med ett riskförhållande på 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Kaplan-Meier-kurvorna för OS visas i figur 1. Elulemuse tõenäosus 1,0 0,9 0,8 0,7 Logaritmiline astaktest P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 aeg (kuudes) Järelejäänute arv Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp ravirühm Fluoro/Cisp Figur 1. Kaplan-Meier-kurva för OS (n=584). Tras/Fluoro/Cisp Utforskande analyser utfördes när datan väl var tillgänglig, och som ett resultat av detta definierades två nya HER2-undergrupper baserat på IHC-poängsättning: Grupp 1 ( grupp med lågt HER2- uttryck ): Grupp 2 ( grupp med högt HER2- uttryck ): IHC 0/FISH+ och IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ och IHC 3+ inklusive IHC 3+(FISH+ eller FISH- eller FISH inget resultat) (n=446) När den primära analysen om OS upprepades post hoc för gruppen med högt HER2- uttryck) (n=446) noterades en större fördel med den kombinerade behandlingen. OSmedeltalet för patientgruppen som hade fått kemoterapi plus trastuzumab ökade till 16,0 månader jämfört med 11,8 månader för patienter som endast fick kemoterapi. Riskförhållandet för denna analys minskade till 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan- Meier-kurvorna för OS för gruppen med högt HER2-uttryck visas i figur 2. ( ) P04087SE_K / s. 41/51

42 Magcancer Elulemuse tõenäosus 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 aeg (kuudes) Järelejäänute arv Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp 11,8 16,0 ravirühm Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 2. Kaplan-Meier-kurvorna för OS för gruppen med högt HER2-uttryck (n=446). ToGA-prövningen har visat att kombinationen av IHC- och FISH-testning är förutsägbar för effekten av den kombinerade behandlingen med kemoterapi och trastuzumab, men utforskande post hoc-analyser verkar indikera att det för patienter med högre nivåer av HER2-proteinuttryck (IHC2+/FISH+ och IHC3+) ger bättre fördelar. Detta kan förklaras av det faktum att proteinet utgör målet för trastuzumab. Ytterligare information om ToGA-prövningen finns i bipacksedeln för Herceptin. Reproducerbarhet Reproducerbarhet inom körning: Reproducerbarhet inom körningar testades i ett laboratorium med 3 prover med olika IHC-färgningspoäng. Varje prov kördes tredubbelt. Detta protokoll användes med automatisk färgning. Alla prover gav 100 % reproducerbara resultat. Reproducerbarhet inom körningar testades i ett laboratorium med 11 prover av olika IHC-färgningsintensitetspoäng. Varje prov kördes tredubbelt. Detta protokoll användes med manuell färgning. Alla prover gav 100 % reproducerbara resultat. Reproducerbarhet inom och mellan laboratorier: HercepTest -analys av 60 olika gastriska cancerprover från områden i magen eller den gastroesofageala förbindelsen som representerade kirurgiska resektioner och biopsier utfördes under fem icke på varandra följande dagar på tre olika studiekliniker. De 60 proverna i studien var jämnt fördelade över de tre HER2-statuskategorierna. Totalt 2040 HER2-poängsättningar utfördes av sex patologer. Överensstämmelsen från dag till dag (negativa, tvetydiga, positiva) varierade från 83,1 % till 98,3 %. Vid 47 av 60 möjliga jämförelser var överensstämmelsen 90,0 % eller högre. I Tabell 1 visas specifika exempel på jämförelserna dag för dag med en genomsnittlig överensstämmelse på 91,2 %, 92,5 % och 92,5 % för de tre klinikerna. Överensstämmelsen mellan de olika klinikerna var 82,7 %, 75,0 % respektive 88,0 % vid parvisa klinikjämförelser (se tabell 12). Enligt Fischers exakta test skiljde sig resultaten inte åt mellan klinikerna. Överensstämmelsen mellan observatörer för patologerna på de olika klinikerna var 88,0 %, 83,6 % respektive 81,0 % för de tre studieklinikerna (tabell 13). ( ) P04087SE_K / s. 42/51

43 Magcancer Sammanfattningsvis uppvisade HercepTest -analyserna av magcancerproverna på de tre studieklinikerna en god överensstämmelse mellan observationerna avseende dagar, kliniker och observatörer. Tabell 11. Överensstämmelse dag för dag i procent - en undergrupp av 12 av 60 jämförelser Observatör 1 Observatör 2 Genomsnittlig Överensstämmelse CI95 LL 1 Överensstämmelse CI95 LL 1 överensstämmelse Klinik 1 Dag 1 jämfört med dag 2 85,0 74,4 93,3 84,9 91,2 Dag 3 jämfört med dag 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Klinik 2 Dag 1 jämfört med dag 2 95,0 87,3 83,1 72,0 92,5 Dag 3 jämfört med dag 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Klinik 3 Dag 1 jämfört med dag 2 90,0 80,5 91,7 82,7 92,5 Dag 3 jämfört med dag 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95 % nedre gräns för konfidensintervall. ( ) P04087SE_K / s. 43/51

44 Magcancer Tabell 12. Övergripande överensstämmelse mellan klinikerna i procent Klinik 1 jämfört med klinik 2 Klinik 1 jämfört med klinik 3 Klinik 2 jämfört med klinik 3 Dag 1 jämfört med dag 1 Dag 2 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 3 Dag 4 jämfört med dag 4 Dag 5 jämfört med dag 5 Dag 1 jämfört med dag 1 Dag 2 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 3 Dag 4 jämfört med dag 4 Dag 5 jämfört med dag 5 Dag 1 jämfört med dag 1 Dag 2 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 3 Dag 4 jämfört med dag 4 Dag 5 jämfört med dag 5 1 CI95 LL: 95 % nedre gräns för konfidensintervall. Överensstämmelse CI95 LL 1 Genomsnittlig överensstämmelse 83,3 72,4 85,0 74,4 85,0 74,4 81,7 70,5 78,3 66,7 80,0 68,6 73,3 61,2 78,3 66,7 68,3 55,9 75,0 63,0 88,3 78,5 86,7 76,4 90,0 80,5 86,7 76,4 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 Tabell 13. Överensstämmelse mellan olika observatörer i procent Överensstämmelse CI 95 LL 1 Genomsnittlig överensstämmelse Klinik 1 Dag 1 91,7 82,7 Dag 2 91,7 82,7 Dag 3 93,3 84,9 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 80,0 68,6 Klinik 2 Dag 1 86,4 76,0 Dag 2 83,3 72,4 Dag 3 83,3 72,4 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 81,7 70,5 Klinik 3 Dag 1 80,0 68,6 Dag 2 78,3 66,7 Dag 3 80,0 68,6 Dag 4 78,3 66,7 Dag 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95 % nedre gräns för konfidensintervall. 88,0 83,6 81,0 ( ) P04087SE_K / s. 44/51

45 Magcancer Immunreaktivitet Tabell 14 innehåller en sammanfattning av HercepTest immunreaktivitet med den rekommenderade panelen av normala vävnader: Alla vävnader formalinfixerades, paraffininbäddades och färgades med HercepTest enligt instruktionerna i bipacksedeln. Tabell 14. Sammanfattning av HercepTest normal vävnadsreaktivitet. Vävnadstyp (nr Testad) Positiv färgning av vävnadselement och färgningsmönster Binjure (3) Benmärg (3) Hjärna/cerebellum (3) Hjärna/cerebrum (3) Bröst (3) Cervix uteri (3) Kolon (3) Esofagus (3) Hjärta (3) Njure (3) Lever (3) Lunga (3) Mesotelceller (3) Äggstock (3) Bukspottkörtel (3) Bisköldkörtel (3) Perifer nerv (3) Hypofys (3) Prostata (3) Spottkörtel (3) Skelettmuskel (3) Hud (3) Tunntarm (3) Mjälte (3) Mage (3) Testis (3) Tymus (3) Sköldkörtel (3) Tonsill (3) Livmoder (3) Bröstkörtel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet) Tubuli i njurmedulla (3 av vävnader, 1 2+ i 5 50 % av celler, cytoplasmisk Prostatakörtel/gångar (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 50 % av celler, cytoplasmisk) Svettkörtlar (1 av 3 vävnader, 1+, 30 % av celler, cytoplasmisk) Cylinderepitel, yta (1 av 3 vävnader, 2+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Epitel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Skivepitel (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 80 % av celler) Den rapporterade färgningen i alla vävnader var membran, om inte annat anges. Alla tre prover av varje vävnadstyp hade samma färgningsintensitet om inget annat anges. ( ) P04087SE_K / s. 45/51

46 Magcancer Felsökning - mage Se Felsökning-avsnittet i Dakos tidigare refererad manual (19) för hjälpåtgärder eller kontakta Dakos-serviceavdelning för att rapportera ovanlig färgning. Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder 1. färgning av objektglas 1a. Programmeringsfel. Reagenser används inte i rätt ordning 1a. Kontrollera programmeringstabell för att kontrollera att färgningskörningen programmerades på rätt sätt 2. Svag färgning av objektglas 1b. Reagensvialer laddades inte på rätt platser i reagensställ 1c. Otillräckligt med reagens i reagensvial 1d. Natriumazid i tvättlösning 1e. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan leda till förlust av synlig HER2- immunreaktivitet. 2a. Otillräcklig epitopåtervinning 2b. Otillräckliga inkubationstider för reagens 2c. Olämplig fixeringsmetod används 2d. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan orsaka en signifikant minskning av synlig HER2-immunreaktivitet 2e. Otillräcklig reagensvolym applicerad. 1b. Kontrollera reagenskartan för att kontrollera rätt plats på reagernsvialer 1c. Se till att tillräckligt med reagens är laddat i reagensvialerna före start av körning. Se reagenskartan för nödvändiga volymer 1d. Använd färsk tvättbuffert i kitet 1e. Vävnads-snitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torkas vid 37 C över natten eller vid 60 C i maximalt en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2a. Verifiera att epitopåtervinningslösningen uppnår C i hela 40 minuter och låt den svalna i ytterligare 20 minuter 2b. Granska färgningsprocedurens instruktioner 2c. Se till att patientvävnad inte fixeras för mycket eller att ett alternativt fixativ inte används 2d. Vävnadssnitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torkas vid 37 C över natten eller vid 60 C i högst en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2e. Kontrollera vävnadssnittets storlek (22 mm x 22 mm) och applicerad reagensvolym. ( ) P04087SE_K / s. 46/51

47 Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder 3. För mycket bakgrundsfärgning på objektglas 3a. Paraffin har inte tagits bort tillräckligt Magcancer 3a. Använd färska klarningslösningar och följ proceduren som beskriven i avsnitt B.1 4. Vävnad lossnar från objektglas 5. För stark specifik färgning 3b. Stärkelsetillsatser används vid montering av snitt till objektglas 3c. Objektglas är inte noggrant sköljda 3d. Snitt torkade under färgningsprocedur 3e. Snitt torkade vid laddning av Autostainer 3f. Olämplig fixeringsmetod används 3g. Icke-specifik bindning av reagenser till vävnad 4a. Användning av felaktigt objektglas 5a. Olämplig fixeringsmetod används 5b. Användning av olämplig värmekälla för epitopåtervinning, t.ex.förångare, mikrovågsugn eller autoklav 5c. För lång inkubationstid för reagens 5d. Olämplig tvättlösning används 3b. Använd inte stärkelsetillsatser för att fästa snitten vid objektglasen. Många tillsatser är immunoreaktiva 3c. Se till att Autostainer är rätt primad före körning. Kontrollera att det finns tillräckligt med buffert för hela körningen. Använd förska buffert- och tvättlösningar 3d. Verifiera att lämplig reagensvolym appliceras på objektglasen. Se till att Autostainer körs med stängd huv och inte utsätts för mycket värme eller drag 3e. Se till att snitt är fuktiga med buffert vid laddning och före körningsstart 3f. Se till att ett godkänt fixativ använts. Alternativt fixativ kan orsaka för mycket bakgrundsfärgning 3g. Kontrollera fixeringsmetod för provet och förekomst av nekros 4a. Använd silaniserade objektglas, som Dako Silanized Slides, Kod S3003, SuperFrost Plus eller poly-l-lysin-belagda objektglas 5a Se till att endast godkända fixativ och fixeringsmetoder används 5b. Se till att endast vattenbad används vid epitopåtervinningssteget 5c. Granska färgningsprocedurens instruktioner 5d. Använd endast tvättbufferten som rekommenderas för kitet ( ) P04087SE_K / s. 47/51

48 Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder 6. Svag färgning av 1+ kontrollobjektglasets cellinje 6a. Felaktigt epitopåtervinningsprotokoll har följts Magcancer 6a. Sänk ned objektglas i förvärmd epitopåtervinningslösning. Få tillbaka temperaturen för epitopåtervinningslösningen till C och förvärm i hela 40 minuter 7. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid uppvärmning 8. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid förvaring (före uppvärmning) 6b. reaktion med substratkromogen lösning (DAB) 6c. Degradering av kontrollobjektglas 7. Lösningen blir grumlig när den värms upp 8. Lösningen har förvarats på felaktigt sätt eller också har lösningens utgångsdatum passerats 6b. Se till att hela 10 minuters inkubationstid används. Se till att endast en droppe av DAB-kromogen tillsätts till 1 ml DAB-buffrat substrat 6c. Kontrollera kitets utgångsdatum och kitets förvaringsförhållanden utanför förpackningen 7. Detta är normalt och påverkar inte färgningen 8. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden på förpackningens utsida. Kassera epitopåtervinningslösningen OBS! Om problemet inte kan härröras till någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna korrigeringsåtgärden inte löser problemet, kontakta Dakos serviceavdelning för vidare assistans. Ytterligare information om färgningstekniker och provförberedning kan hittas i Dakos tidigare refererade Handbook (19) (tillänglig från Dako), Atlas of Immunohistology (30) och Immunoperoxidase Techniques. A practical approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087SE_K / s. 48/51

49 Referenser 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti-p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4: Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides, Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; ( ) P04087SE_K / s. 49/51

50 25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78: Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04087SE_K / s. 50/51

51 Symbolförklaringar Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod Faropiktogram enligt GHS (se avsnittet för försiktighetsåtgärder) In vitro diagnostisk medicinsk apparat Ömtåligt, hanteras varsamt Används före Faropiktogram enligt GHS (se avsnittet för försiktighetsåtgärder) Se anvisningar för användning Innehållet räcker till <n> tester Tillverkare Tillverkad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax Distribuerad i USA av Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/ Gratisnummer: 800/ Orderinformation Tel. 800/ Fax Teknisk Service: Tel. 800/ HercepTest och Herceptin är varumärken som tillhör Genentech, Inc., under licenser som innehas av Dako Denmark A/S och F. Hoffmann-La Roche Ltd. ( ) P04087SE_K / s. 51/51