PD-L1 IHC 22C3 pharmdx indikeras som stöd för identifiering av NSCLC-patienter för behandling med KEYTRUDA (pembrolizumab).

Transkript

1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK tester för användning med Autostainer Link 48 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx är en kvalitativ immunhistokemisk analys som använder Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 avsedd för upptäckt av PD-L1-protein i formalinfixerad, paraffininbäddad (FFPE) icke-småcellig lungcancervävnad (NSCLC) med hjälp av EnVision FLEX visualiseringssystem på Autostainer Link 48. PD-L1-proteinuttryck bestäms med Tumor Proportion Score (TPS), som är en procentandel av livsdugliga tumörceller som uppvisar partiell eller komplett membranfärgning. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx indikeras som stöd för identifiering av NSCLC-patienter för behandling med KEYTRUDA (pembrolizumab). Sammanfattning och förklaring Bindning av PD-1-liganderna PD-L1 och PD-L2 till receptor PD-1 på T-celler inhiberar proliferation av T-celler och cytokinproduktion. Uppreglering av PD-1-ligander förekommer i vissa tumörer och signaleringen genom den här reaktionsvägen kan bidra till att inhibera aktiva T-cellers immunövervakning av tumörer. KEYTRUDA är en humaniserad monoklonal antikropp som binder till PD-1-receptorn och blockerar interaktionen med PD-L1 och PD-L2 och lösgör banmedierad PD-1-inhibering av immunsvaret, inklusive immunsvar mot tumörer. I syngena mustumörmodeller resulterade blockering av PD-1-aktivitet i minskad tumörtillväxt (1). Procedurprincip PD-L1 IHC 22C3 pharmdx innehåller optimerad reagens och det protokoll som krävs för att slutföra en IHC-färgningsprocedur av FFPEvävnadsprover med Autostainer Link 48. Efter inkubering med den primära monoklonala antikroppen till PD-L1 eller NCR (Negative Control Reagent) inkuberas vävnadsprov med en Linker-antikropp till värdarten för den primära antikroppen och inkuberas därefter med en färdig visualiseringsreagens som består av sekundära antikroppsmolekyler och pepparrotsperoxidasmolekyler sammankopplade med en stomme av dextranpolymer. Enzymkonverteringen av den tillagda kromogenen resulterar i en fällning bestående av en synlig reaktionsprodukt vid antigenen. Färgen på den kromogena reaktionen modifieras av en kromogen förbättringsreagens. Vävnadsprovet kan därefter kontrastfärgas och förses med täckglas. Resultat tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Medföljande material Varje sats innehåller 19,5 ml med PD-L1 primär antikropp (cirka 3 µg/ml proteinkoncentration) och innehåller reagens för att utföra 50 tester i upp till 15 separata körningar. Materialet nedan räcker för 50 tester (50 objektglas inkuberade med Primary Antibody till PD- L1 och 50 objektglas inkuberade med motsvarande Negative Control Reagent, sammanlagt 100 objektglas). Antalet tester baseras på användningen av 2 x 150 µl per objektglas för varje reagens förutom DAB+ och Target Retrieval Solution. Satsen innehåller material för högst 15 individuella färgningskörningar. Kvantitet Beskrivning 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Buffrad lösning innehållande väteperoxid, rengöringsmedel och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonal mus-anti-pd-l1 (IgG 1 ) i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Kontroll-IgG-antikropp från monoklonal mus i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Sekundär musantikropp mot musimmunglobuliner i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran bundet med peroxidasmolekyler och sekundär getantikroppsmolekyler mot kanin- och musimmunglobuliner i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och ett antimikrobiellt medel. P03928SE_03/SK / s. 1/14

2 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Buffrad lösning innehållande väteperoxid och ett antimikrobiellt medel. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin tetrahydroklorid i organisk lösning. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Kopparsulfat i vatten. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Buffrad lösning, ph 6,1, innehållande rengöringsmedel och ett antimikrobiellt medel. 15 objektglas PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-kontrollobjektglas KONTROLLOBJEKTGLAS Varje objektglas innehåller snitt av två pelleterade och paraffininbäddade cellinjer fixerade i formalin: NCI-H226* med moderat PD-L1-proteinuttryck och MCF-7 med negativt PD-L1-proteinuttryck. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negativt NCI-H226: PD-L1-positivt * Dr. AF Gazdar och Dr. JD Minna vid NIH uppmärksammas för deras bidrag till utvecklingen av NCI-H226 (ATCC-nummer: CRL-5826 ) (2). Obs! All inkluderad reagens är specifikt formulerade för användning av den här satsen. För att testet ska fungera enligt specifikationen kan inga utbyten göras, förutom EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x (kod K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmdx har tagits fram särskilt för användning med Autostainer Link 48. Se användarhandböckerna för Autostainer Link 48 och PT Link för mer information. Material som behövs men inte ingår PT Link förbehandlingsmodul (kod PT100/PT101) Autostainer Link 48 (kod AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (kod K8007) Hematoxylin (kod K8008) Destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) Timer Positiva och negativa vävnader för processkontroll (se avsnittet Kvalitetskontroll) Mikroskopobjektglas: Dako FLEX IHC objektglas för mikroskop (kod K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus laddade objektglas Täckglas Permanent monteringsmedium och hjälpreagens krävs för monteringstäckglas Ljusmikroskop (4x 40x objektivförstoring) Försiktighetsåtgärder 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det kastas bort så att inte metallazider ackumuleras i avloppet (3). 4. Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker och Visualization Reagent innehåller material med animaliskt ursprung. 5. Vävnadsprover och alla substanser utsatta för dem, både före och efter fixering, ska hanteras som om de kan överföra infektion och kasseras med rätt försiktighetsåtgärder (4). 6. Inkuberingstider, temperaturer eller metoder förutom de särskilt föreskrivna, kan ge felaktiga resultat. 7. Reagens har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan leda till sämre antigenfärgning. 8. Visualization Reagent, Liquid DAB+ Chromogen och förberedd DAB+ Substrate-Chromogen Solution kan påverkas negativt om de utsätts för starkt ljus. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, som direkt solljus. 9. Paraffinrester kan leda till falska negativa resultat. 10. Användning av reagensvolymer andra än rekommenderade kan resultera i utebliven synlig PD-L1 immunreaktivitet. 11. Resultat från en liten studie visade ett liknande dynamiskt omfång av PD-L1-uttryck i primära och metastatiska vävnadsprovpar av NSCLC. Det är möjligt att det kan finnas olikheter mellan PD-L1-uttryck i primära tumörer jämfört med metastatiska förekomster hos samma patient. 12. Stora snitt av vävnadsprov kan behöva 3 x 150 µl av reagens. P03928SE_03/SK / s. 2/14

3 13. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämpliga arbetsprocedurer, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i säkerhetsdatabladet (SDS). 14. Använd lämplig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 15. Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala, statliga och överstatliga föreskrifter. 16. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. Fara DAB+ Chromogen: 1 5 % bifenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetraklorid H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarhjälp. P405 Förvaras inlåst. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Varning EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5 % citronsyra H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H411 Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P273 Undvik utsläpp till miljön. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj noggrant med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Förvaring Förvara alla komponenter av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, inklusive kontrollobjektglas, mörkt vid 2 8 C när de inte används i med Autostainer Link 48. Använd inte satsen efter utgångsdatumet på utsidan av satsens förpackning. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som specificerats i det här bipacksedeln. Det finns inga tydliga sätt att upptäcka instabilitet hos den här produkten. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt med vävnadsprover från patient. Provberedning Prov måste förberedas så att vävnaden bevaras för IHC-färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling ska användas för alla prover. Paraffininbäddade snitt Paraffininbäddade vävnader fixerade i formalin lämpar sig för användning. Alternativa fixeringsmedel har inte validerats och kan ge upphov till felaktiga resultat. Fixeringstid på timmar i 10 % neutralbuffrat formalin (NBF) rekommenderas, dock har en studie med begränsade prover visat att fixeringstider på timmar i 10 % NBF inte ändrade upptäckt av PD-L1 systematiskt. Fixeringstider på 3 timmar kan resultera i skilda upptäckter av PD-L1. Prover bör blockeras till en tjocklek på 3 eller 4 mm, fixeras i formalin och torkas och klargöras i en serie av alkoholer och xylen, följt av infiltrering med smält paraffin. Paraffintemperaturen får inte överskrida 60 C. FFPE-vävnadsblock som är äldre än 5 år kan resultera i förlust av PD-L1-immunreaktivitet. Vävnadsprover ska snittas i 4-5 µm. Efter sektion ska vävnadsprover monteras på Fisherbrand Superfrost Plus-objektglas eller Dako FLEX IHC-mikroskopobjektglas (kod K8020) och sedan placeras i ugn vid 58 ± 2 C i 1 timme. För att bevara antigenicitet ska vävnadssnitt som monterats på objektglas förvaras mörkt vid 2 8 C (i första hand) eller i rumstemperatur upp till 25 C och färgas inom 6 månader efter sektion. Förhållandena för förvaring och hantering av objektglas bör inte överskrida 25 C efter montering för att säkerställa vävnadens integritet och antigenicitet. Användning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. Reagensberedning Följande reagens måste beredas innan färgning: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x Förbered en tillräcklig mängd 1x Target Retrieval Solution, lågt ph genom att späda Target Retrieval Solution, Low ph, 50x 1:50 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet). ph-värdet för 1x Target Retrieval Solution måste vara 6,1 ± 0,2. Om 1x Target Retrieval Solution har ett ph under 5,9 kan det leda till felaktiga resultat. En 30 ml-flaska med Target Retrieval Solution, Low ph, 50x utspädd 1:50 ger 1,5 L av 1x reagens, tillräckligt för att fylla en PT Link-tank som kan behandla upp till 24 objektglas per gång. Kassera 1x Target Retrieval Solution efter tre användningar och använd inte längre än fem dagar efter spädning. Ytterligare EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x finns tillgängligt under kod K8005. P03928SE_03/SK / s. 3/14

4 EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Förbered en tillräcklig mängd tvättbuffert genom att späda Wash Buffer 20x 1:20 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) för tvättstegen. Förvara inte oanvänd 1x-lösning vid 2 8 ºC längre än en månad. Kassera bufferten om den är grumlig. Se användarhandboken för Autostainer Link 48 för mer information. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x finns tillgängligt som kod K8007. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Lösningen ska blandas ordentligt före användning. Eventuell fällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningens kvalitet. För att förbereda DAB+ Substrate-Chromogen Solution, lägg till 1 droppe Liquid DAB+ Chromogen per ml av DAB+ Substrate Buffer och blanda. Förberedd Substrate-Chromogen är stabil i 5 dagar om den förvaras mörkt vid 2 8 C. Viktigt: Vid användning av en hel flaska DAB+ Substrate Buffer tillsätts 9 droppar DAB+ Chromogen. Trots att det står 7,2 ml på etiketten är det den användbara volymen och tar inte hänsyn till den döda volymen i flaskan. Färgen på Liquid DAB+ Chromogen kan variera mellan klar till brunlila. Detta kommer inte påverka produktens effekt. Späd enligt instruktionerna ovan. Om överflödig Liquid DAB+ Chromogen läggs till DAB+ Substrate Buffer kommer det att resultera i försämrad positiv signal. Färgningsprocedur på Autostainer Link 48-lösningen Procedurnoteringar Före användning ska användaren läsa dessa instruktioner noggrant och vara förtrogen med alla komponenter och all instrumentering (se försiktighetsåtgärder). All reagens ska anta rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. På samma sätt ska alla inkuberingssteg utföras vid rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitt torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa icke-specifik färgning. Alla nödvändiga steg och inkuberingstider är förprogrammerade i programvaran Dako Link. Se användarhandböckerna för Autostainer Link 48 och PT Link för mer information om programmeringsprotokoll och laddning av objektglas och reagens. Obs! Reagens och instruktionerna i det här systemet har utformats för optimalt resultat vid användning av rekommenderade reagens och material. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motstridiga resultat. Färgningsprotokoll Välj färgningsprotokollet PD-L1 IHC 22C3 pharmdx från alternativen på menyn i Dako Link. Alla nödvändiga steg och inkuberingstider är förprogrammerade i Autostainer Link 48. Om lämpliga PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-protokoll inte finns på vår server kontaktar du den lokala tekniska kundtjänsten för att få protokollen. Steg 1: Avparaffinering, rehydrering och procedur för målåtervinning (3-i-1) Ytterligare information finns i användarhandboken för PT Link. Ställ in PT Links (kod PT100/PT101) förvärmning och nedkylning till 65 C. Ställ in värme till 97 C i 20 minuter. Fyll PT Link-tankarna med 1,5 L med Target Retrieval Solution, Low ph, 1x arbetslösning för att täcka vävnadssnitten. Förvärm Target Retrieval Solution till 65 C. Sänk ned Autostainer-ställ med monterade FFPE-vävnadssnitt i förvärmd Target Retrieval Solution, Low ph, (1x arbetslösning) i PT Link-tanken. Inkubera i 20 minuter vid 97 C. När målåtervinningsinkuberingen har slutförts och temperaturen sänkts till 65 C tas Autostainer-ställen med objektglasen bort från PT Link-tanken och Autostainer-ställen med objektglas placeras omedelbart i en tank (t.ex. PT Link Rinse Station, kod PT109) innehållande spädd, rumstempererad tvättbuffert (kod K8007). Lämna de inkuberade objektglasen i spädd, rumstempererad tvättbuffert i 5 minuter. Steg 2: Färgningsprocedur Efter avparaffinering, rehydrering och procedur för målåtervinning (3-i-1) placeras Autostainer-ställen med objektglas på Autostainer Link 48. Instrumentet kommer att utföra färgningsprocessen genom att applicera nödvändiga reagens, övervaka inkuberingstiden och skölja objektglasen mellan reagens. Reagenstiderna är förprogrammerade i programvaran Dako Link. Steg 3: Kontrastfärg Objektglasen ska kontrastfärgas i 5 minuter med Hematoxylin (Link) (kod K8008). Inkuberingstiden med hematoxylin är förprogrammerad i protokollet. Steg 4: Montering Icke-vattenhaltigt, permanent monteringsmedium krävs. Obs! Blekning av färgade objektglas kan förekomma beroende på flera faktorer, inklusive, men inte begränsat till, kontrafärgning, monteringsmaterial och metoder, samt förvaringsförhållandena för objektglasen. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur för att minimera blekning (20 25 C). Kvalitetskontroll Reagens i PD-L1 IHC 22C3 pharmdx har kvalitetskontrollerats genom immunhistokemi med den målåtervinning och de färgningsprocedurer som anges ovan. Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för vävnadsfixering, bearbetning och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till signifikanta avvikelser i resultatet. Kvalitetskontroller ska ingå i varje färgningskörning. Kvalitetskontrollerna specificeras i tabell 1 and innefattar: ett H&E-färgat patientvävnadsprov, positiva och negativa kontrollvävnader från laboratoriet och objektglas med kontrollcellinje från Dako (5). För USA: se riktlinjerna för kvalitetskontroll från P03928SE_03/SK / s. 4/14

5 CAP:s (College of American Pathologists) ackrediteringsprogram för immunhistokemi. Se även riktlinjerna för CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry (5, 6, 7) för ytterligare information. Analysverifiering Före initial användning av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur bör användaren verifiera analysens funktion genom att testa den på en serie av vävnader från laboratorium med kända IHC-egenskaper som motsvarar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurerna som redovisas i kvalitetskontrollavsnittet ovan. Kvalitetskontrollprocedurerna bör upprepas för varje ny antikroppslot eller vid ändringar av analysparametrarna. Felsökningsalternativ för eventuella problem, deras orsaker och föreslagna korrigeringsåtgärder beskrivs i tabell 10. Poängtolkning - NSCLC Alla livsdugliga tumörceller på hela objektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Minst 100 livsdugliga tumörceller måste finnas i det PD-L1-färgade objektglaset för att provet ska anses vara adekvat för PD-L1-utvärdering. För att framgångsrikt poängsätta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx färgade prover är det viktigt att lämpliga celler utvärderas, att korrekt cellplats identifieras och att färgningens intensitet tolkas på rätt sätt. Utvärdering av objektglas bör utföras av en patolog med hjälp av ett ljusmikroskop. För utvärdering av den immunhistokemiska färgningen och poängsättningen lämpar sig 10 40x objektivförstoring. Eventuell märkbar membranfärgning av tumörcellsfärgning bör inkluderas i poängsättningen. Poängsätt partiell eller komplett cellmembranfärgning ( 1+) som märks distinkt från cytoplasmisk färgning. Cytoplasmisk färgning bör anses icke-specifik och omfattas inte i utvärderingen av färgintensiteten. Normala celler och tumörassocierade immunceller som infiltrerande lymfocyter eller makrofager ska inte inkluderas i poängen för bestämningen av PD-L1-positivitet. Tumörprover färgade med NCR måste ha 0 specifik färgning och 1+ bakgrundsfärgning. TPS (Tumor Proportion Score) är en procentandel av livsdugliga tumörceller som uppvisar komplett eller partiell membranfärgning ( 1+). Provet bör anses PD-L1-positivt om TPS 1 % av de livsdugliga tumörcellerna uppvisar membranfärgning med olika intensitet (dvs. 1+). För varje färgningskörning ska objektglasen undersökas i den ordning som anges i tabell 1 för att bestämma färgningskörningens validitet och möjliggöra utvärdering av vävnadsprovets färgning. Se PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Interpretation Manual för ytterligare instruktioner. Ytterligare rekommendationer för tolkning av färgning med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx 1. För att verifiera cellmembranfärgning används 10 40x objektivförstoring. 2. Olika icke-målelement, som tumörassocierade immunceller (t.ex. makrofager) och stroma, kan även färgas positivt för PD-L1 men bör inte inkluderas i poängsättningen. Tabell 1. Rekommenderad ordning för utvärdering av objektglas Prover Förklaring Krav 1. H&E (från laboratorium) En hematoxylin- och eosinfärgning (H&E) av vävnadsprovet utvärderas först för att bedöma vävnadens histologi och bevarandekvalitet. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx och H&E-färgning bör utföras på seriesnitt från samma paraffinblock som provet. Minst 100 livsdugliga tumörceller måste finnas för att provet ska anses vara adekvat för PD-L1-utvärdering. Vävnadsproverna ska vara intakta, välbevarade och ska bekräfta tumörtypen. 2. Objektglas med kontrollcellinje (från Dako) Objektglas med kontrollcellinje färgad med PD-L1 primär antikropp från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx bör undersökas för att se till att alla reagens fungerar korrekt. Objektglaset med kontrollcellinje innehåller den PDL1-positiva cellinjepelleten och den PD-L1- negativa cellinjepelleten. Ett objektglas med kontrollcellinje ska färgas med Primary Antibody till PD-L1 i varje färgning. NCI-H226 (PD-L1-positiv kontrollcellinje) acceptanskriterier: Cellmembransfärgning av 70 % av celler vid 2+ normal färgningsintensitet. Icke-specifik färgning < 1+ intensitet. MCF-7 (PD-L1-negativ kontrollcellinje) acceptanskriterier: Ingen specifik färgning. Icke-specifik färgning < 1+ intensitet. Notera att färgning av fåtal celler i cellpelleten MCF-7 kan förekomma. Följande acceptanskriterier gäller: förekomst av totalt 10 celler med tydlig plasmamembranfärgning eller cytoplasmisk färgning med 1+ intensitet inom MCF-7-cellpelletens gränser är godtagbart. 3. Objektglas med positiv kontrollvävnad (från laboratorium) Därefter undersöks objektglasen med positiv kontrollvävnad som färgats med både PD-L1 primär antikropp och Negative Control Reagent. Objektglasen verifierar att fixeringsmetoden och epitopåtervinningsprocessen är korrekta. Kända positiva vävnadskontroller bör endast användas för övervakning av korrekt resultat från bearbetade Om ingen av kontrollcellinjerna uppfyller dessa kriterier bör alla resultat med patientproverna anses ogiltiga. Kontrollerna bör vara biopsiprover/kirurgiska prover av samma tumörtyp som patientprovet, fixerade, bearbetade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Använd intakta prover för att tolka färgningsresultat eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt. Vävnaderna som väljs till den positiva vävnadskontrollen bör ge svag till måttlig positiv färgning med PD-L1 för att underlätta upptäckt av små skillnader i analyskänslighet. P03928SE_03/SK / s. 5/14

6 vävnader och testreagens, inte som hjälp i formulering av en specifik diagnos i patientvävnadsprov. Två kontrollobjektglas med positiv vävnad ska inkluderas i varje färgningskörning. Objektglas färgat med PD-L1: närvaro av brun plasmamembranfärgning bör observeras. Icke-specifik färgning bör vara Objektglas med negativ kontrollvävnad (från laboratorium) 5. Objektglas med patientvävnad färgad med Negative Control Reagent 6. Objektglas med patientvävnad färgad med PD-L1 primär antikropp Objektglasen med negativ kontrollvävnad (som är känt PD- L1-negativ) som färgats med både PD-L1 primär antikropp och Negative Control Reagent ska därefter undersökas för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppens märkning av målantigenen. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativ kontrollvävnad, men detta bör verifieras av användaren. Undersök patientprov som färgats med Negative Control Reagent från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Negative Control Reagent använd istället för den primära antikroppen och underlättar tolkningen av specifik färgning vid antigenen. Undersök hela objektglasen med patientvävnad som färgats med PD-L1 primär antikropp från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx sist. Se sammanfattning och förklaring, begränsningar och prestandaegenskaper för specifik information om immunreaktivitet från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Objektglas färgat med Negative Control Reagent: ingen membranfärgning. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Om de positiva vävnadskontrollerna inte uppvisar lämplig positiv färgning bör resultaten från testvävnaderna anses ogiltiga. Kontrollerna bör vara biopsiprover/kirurgiska prover av samma tumörtyp som patientprovet, fixerade, bearbetade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Två kontrollobjektglas med negativ vävnad ska inkluderas i varje färgningskörning. Objektglas färgat med PD-L1: ingen membranfärgning i tumörceller. Ickespecifik färgning bör vara 1+. Objektglas färgat med Negative Control Reagent: ingen membranfärgning. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Om specifik cellmembranfärgning förekommer på objektglasen med negativ kontrollvävnad bör resultat från patientprov anses ogiltiga. Avsaknad av cellmembranfärgning verifierar den specifika märkningen från målantigenen av den primära antikroppen. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Intensiteten av positiv färgning ska bedömas med hänsyn till eventuell ickespecifik färgning som observerats på patientens objektglas med Negative Control Reagent i samma körning. Liksom för alla immunhistokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte upptäcktes, och inte nödvändigtvis att antigenen inte fanns i de celler eller den vävnad som analyserades. Alla livsdugliga tumörceller på hela det PD-L1-färgade patientobjektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Minst 100 livsdugliga tumörceller måste finnas för att provet ska anses vara adekvat för PD-L1-utvärdering. Allmänna begränsningar 1. Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialistutbildning för val att lämpliga reagens, vävnadsurval, fixering, bearbetning och beredning av IHC-objektglasen och tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, nedfrysning, upptining, tvättning, torkning, uppvärmning, sektion eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan orsaka artefakter, antikroppsinfångning eller falska negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3. Överflödig eller ofullständig kontrastfärgning kan leda till inkorrekt tolkning av resultaten. 4. Den kliniska tolkningen av positiv färgning eller avsaknad därav måste utvärderas med hänsyn till klinisk presentation, morfologi och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av färgning eller avsaknad därav måste kompletteras av morfologiska undersökningar eller korrekta kontroller samt andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog som är förtrogen med antikropparna, reagens och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under överinseende av en patolog som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och för att se till att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (7). 6. Reagens kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnadstyper. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenuttryck i neoplasma eller andra patologiska vävnader. Kontakta Dakos tekniska support med dokumenterade oväntade reaktioner. 7. Falskt positiva resultat kan uppstå på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan även orsakas av pseudoperoxidas aktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C) (7). 8. Reagens och instruktionerna som medföljer det här systemet har utformats för bästa möjliga prestanda. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motstridiga resultat. Produktspecifika begränsningar 1. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover ska färgas inom sex månader efter montering av vävnaderna på objektglas om de förvaras mörkt vid 2 8 C (rekommenderas) eller i rumstemperatur upp till 25 C. 2. För optimala och reproducerbara resultat kräver PD-L1-proteinet förbehandling med målåtervinning när vävnaderna är rutinfixerade (neutralbuffrat formalin) och paraffininbäddade. 3. Ersätt inte reagens från olika lotnummer från den här produkten eller från satser från andra tillverkare. Det enda undantaget är EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph 50x, som vid behov finns tillgängligt som kod K8005. P03928SE_03/SK / s. 6/14

7 4. Färgade kontrollcellinjer ska endast användas för validering av färgningskörningen och inte användas för att poängsätta färgreaktionen i vävnadssnitt. 5. Användning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på vävnad med andra fixeringsmedel än formalin har inte verifierats. 6. Användningen av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i finnålsaspirat har inte validerats. Klinisk prestandautvärdering Den kliniska fördelen av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx undersöktes i en multicentrerad, oblindad, randomiserad klinisk studie som utfördes för att utvärdera säkerheten och effektiviteten av KEYTRUDA hos patienter med framskriden NSCLC (9). Patienter var PD-L1-positiva från en klinisk prövningsanalys (CTA) med fortskridande sjukdom efter behandling med cellgiftsbehandling innehållande platina. Patienter med EGFR- eller ALK-genoma tumöravvikelser hade fortskridande sjukdom med FDA-godkänd behandling för avvikelserna innan de fick KEYTRUDA. Patienter randomiserades (1:1:1) för att få 2 mg/kg (n=344) eller 10 mg/kg (n=346) med KEYTRUDA var 3:e vecka eller 75 mg/m 2 med docetaxel var 3:e vecka (n=343). Bedömning av tumörstatus utfördes var 9:e vecka. De primära effektändpunkterna var total överlevnad (OS) och progressionsfri överlevnad (PFS) enligt Response Evaluation Criteria on Solid Tumors version 1.1 (RECIST 1.1), baserat på oberoende blindgranskningar av radiologer. Baserat på CTA deltog totalt NSCLC-patienter i studien. För att utvärdera den kliniska användbarheten av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testades arkiverade kliniska prover retrospektivt i ett referenslaboratorium i USA med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Av de patienterna testades tumörvävnad från 529 patienter retrospektivt med testet PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Vävnadsprover från 413 patienter hade positiva PD-L1-uttryck ( 1 % av livsdugliga tumörceller med membranfärgning oberoende av intensitet) och prover från 94 patienter hade negativt PD-L1-uttryck (< 1 % av livsdugliga tumörceller med membranfärgning oberoende av intensitet). Av dessa 413 patienter med positivt PD-L1-uttryck innehöll prover från 163 patienter höga PD-L1-uttryck ( 50 % av livsdugliga tumörceller med membranfärgning oberoende av intensitet). Överensstämmelsen mellan CTA och PD-L1 IHC 22C3 pharmdx visas i tabell 2. Tabell 2: CTA jämfört med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-överensstämmelse Överensstämmelsevärden CTA jämfört med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx PD-L1 Tröskelvärde Procentuell negativ överensstämmelse (95 % konfidensintervall (CI)) Procentuell positiv överensstämmelse (95 % konfidensintervall (CI)) TPS 1 % 94,5 % (91,4 96,6 %) 80,0 % (76,9 82,8 %) TPS 50 % 98,3 % (97,1 99,0 %) 73,2 % (67,9 77,9 %) Bland randomiserade patienter positiva för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx var demografi och andra baslinjeegenskaper väl balanserade mellan behandlingsarmarna. Medianåldern var 63 år (44 % var 65 år eller mer). Merparten av patienterna var vita (77 %) och män (58 %). ECOG-prestandastatus vid baslinjen var 0 (29 %) eller 1 (71 %). 78 % av patienterna var tidigare/nuvarande rökare. 22 % av patienterna hade skvamös histologi och 69 % hade icke-skvamös histologi. Baslinjen och de demografiska egenskaperna var också väl balanserade mellan pembrolizumab- och docetaxelarmarna i den övergripande kliniska studien. Effektivitetsresultaten sammanfattas i tabell 3. KEYTRUDA uppvisade långvariga kliniska fördelar hos NSCLC-patienter med positivt PD-L1-uttryck med TPS 1 %, vilket förstärktes hos patienter med högt PD-L1-uttryck med TPS 50 % som bestämts med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Fördelarnas magnitud var jämförbar med den i den övergripande kliniska studien. Tabell 3 sammanfattar huvudsakliga effektivitetsmått i den övergripande PD-L1-positiva populationen (TPS 1 %) och i delmängden med högt uttryck av positivt PD-L1 (TPS 50 %) för den övergripande kliniska studien (PD-L1-positiv med CTA) och i populationen som var positiv med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Kaplan-Meier-kurvan för OS (TPS 1 % som bedömts med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx) visas i figur 1. P03928SE_03/SK / s. 7/14

8 Tabell 3: Svar på KEYTRUDA i tidigare behandlade NSCLC-patienter: Övergripande klinisk studie och PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-positiva patienter: PD-L1 TPS 1 % och TPS 50 % Slutpunkt KEYTRUDA 2 mg/kg var 3:e vecka Klinisk PD-L1 IHC prövning 22C3 pharmdx KEYTRUDA 10 mg/kg var 3:e vecka Klinisk PD-L1 IHC prövning 22C3 pharmdx Docetaxel 75 mg/m 2 var 3:e vecka Klinisk PD-L1 IHC prövning 22C3 pharmdx TPS 1 % Antal patienter OS Dödsfall (%) 172 (50 %) 59 (42 %) 156 (45 %) 59 (42 %) 193 (56 %) 67 (51 %) Riskförhållande* 0,71 0,54 0,61 0,57 (0,58, 0,88) (0,37, 0,78) (0,49, 0,75) (0,39, 0,82) p-värde < 0,001 < 0,001 < 0,001 0, Medianvärde i månader 10,4 (9,4, 11,9) 11,8 (9,6, e/t) 12,7 (10,0, 17,3) 12,0 (8,7, e/t) 8,5 (7,5, 9,8) 7,5 (6,3, 9,9) PFS Händelser (%) 266 (77 %) 97 (63 %) 255 (74 %) 103 (73 %) 257 (75 %) 94 (72 %) Riskförhållande* 0,88 0,68 0,79 0,79 (0,73, 1,04) (0,50, 0,92) (0,66, 0,94) (0,59, 1,06) p-värde 0,068 0, ,005 0, Medianvärde i 3,9 4,9 4,0 4,0 4,0 3,8 månader (3,1, 4,1) (4,1, 6,2) (2,6, 4,3) (2,2, 4,6) (3,1, 4,2) (2,2, 4,2) Övergripande svarsandel ORR % 18 % (14, 23) 24 % (17, 32) 18 % (15, 23) 20 % (14, 28) 9 % (7, 13) 5 % (2, 11) TPS 50 % Antal patienter OS Dödsfall (%) 58 (42 %) 18 (32 %) 60 (40 %) 19 (32 %) 86 (57 %) 25 (53 %) Riskförhållande* 0,54 0,45 0,50 0,29 (0,38, 0,77) (0,24, 0,84) (0,36, 0,70) (0,15, 0,56) p-värde < 0,001 0,00541 < 0,001 < 0, Medianvärde i månader 14,9 (10,4, e/t) Ej uppnått (9,3, e/t) 17,3 (11,8, e/t) Ej uppnått (8,3, e/t) 8,2 (6,4, 10,7) 7,2 (4,4, 8,3) PFS Händelser (%) 89 (64 %) 33 (59 %) 97 (64 %) 34 (57 %) 118 (78 %) 33 (70 %) Riskförhållande* 0,58 0,47 0,59 0,41 (0,24, (0,43, 0,77) (0,28, 0,80) (0,45, 0,78) 0,70) p-värde < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0, Medianvärde i månader 5,2 (4,0, 6,5) 5,9 (4,2, 9,0) 5,2 (4,1, 8,1) 4,8 (2,8, e/t) 4,1 (3,6, 4,3) 3,9 (2,0, 4,3) Övergripande svarsandel ORR % 30 % (23, 39) 37 % (25, 52) 29 % (22, 37) 28 % (18, 41) 8 % (4, 13) 4 % (1, 15) * Riskförhållande (KEYTRUDA jämfört med docetaxel) baserat på stratifierad Cox proportional hazard-modell. Baseras på stratifierat log-ranktest. Bedömt med BICR med hjälp av RECIST 1.1. Alla svar var partiella. Baseras på patienter med bästa övergripande svar som bekräftats som komplett eller partiellt svar. P03928SE_03/SK / s. 8/14

9 Figur 1: Kaplan-Meier-diagram för övergripande överlevnad per behandlingsarm (TPS 1 % med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, av Intent to Treat-population) Total överlevnad (%) Docetaxel 75 mg/m² Q3W MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W n med risk Docetaxel 75 mg/m² Q3W Tid i månader MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W Ytterligare robusthetsanalyser utfördes för att ta hänsyn till den potentiella effekten för saknade data på grund av patienter med positivt testresultat för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx men som kanske var negativt med CTA. Patienter med sådana testresultat ingår i ITD-populationen (intended use/intent to diagnose) för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, men de uteslöts från den kliniska prövningen på grund av negativa resultat av CTA-screening. En känslighetsanalys utfördes för att ta hänsyn till dessa saknade data och förstå den rimliga omfattningen av det uppskattade riskförhållandet (HR) baserat på PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i delpopulationerna TPS 1 % och TPS 50 % i ett ITD-ramverk för att verifiera konsekvensen med observerad HR baserat på deltagande med CTA. Resultatet av HR-känslighetsanalysen visade att HR-uppskattningarna är robusta för all underförstådd minskning av behandlingseffekten inom ITD-ramverket. P03928SE_03/SK / s. 9/14

10 Icke-klinisk prestandautvärdering Analytisk sensitivitet/specificitet Analytisk sensitivitet för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testades på 127 unika fall av icke-småcelliga lungcarcinom (NSCLC) FFPE-prover i stadium I till IV med en tillverkad produktionslot. Bedömning PD-L1-uttryck demonstrerade färgning över % positiva tumörceller och färgintensitet 0 3. Normala vävnader: Tabell 4 sammanfattar immunreaktionen från Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 på den rekommenderade panelen med normala vävnader. Plasmamembranfärgning observerades på immunceller och celler av epiteliskt ursprung. Cytoplasmisk färgning noteras i vissa celltyper men registrerades inte som positiv färgning. Alla vävnader formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx enligt instruktionerna i produktbladet. Inga oväntade resultat observerades i de testade celltyperna eller vävnadstyperna. Den observerade färgningen stämde överens med rapporterad litteratur för PD-L1 IHC-uttryck i normala vävnader (10, 11). Tabell 4: Sammanfattning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx normal vävnadsreaktivitet Vävnadstyp (antal testade) Positiv plasmamembranfärgning: Vävnadselement Positiv cytoplasmisk färgning: Vävnadselement Icke-specifik färgning Benmärg (3) 3/3 Megakaryocyter 3/3 Megakaryocyter 0/3 Binjure (3) 0/3 1/3 Medullära celler 0/3 Bisköldkörtel (3) 1/3 Körtelepitel 0/3 0/3 Bröst (3) 0/3 0/3 0/3 Bukspottkörtel (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebellum (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 0/3 Cervix (3) 1/3 Epitel 0/3 0/3 Esofagus (3) 0/3 0/3 0/3 Hud (3) 0/3 0/3 0/3 Hypofys (3) 1/3 Anterior hypofys 1/3 Anterior hypofys 0/3 1/3 Posterior hypofys 1/3 Posterior hypofys Lever (3) 1/3 Makrofager 0/3 0/3 1/3 Heptatocyter Livmoder (3) 0/3 0/3 0/3 Lunga (3) 3/3 Alveolära makrofager 0/3 0/3 Mage (3) 2/3 Lymfocyter 1/3 Magkörtlar 0/3 1/3 Magkörtlar Mesotelceller (2) 0/2 0/2 0/2 Mjälte (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Muskel, hjärta (3) 0/3 0/3 0/3 Muskel, skelett (3) 0/2 0/2 0/2 Nerv, perifer (3) 0/3 1/3 Bindväv/kärl 0/3 Njure (3) 1/3 Tubulär epitel 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 Epitel 0/2 0/2 Sköldkörtel (3) 0/3 0/3 0/3 Spottkörtel (3) 0/3 0/3 0/3 Testikel (3) 0/3 0/3 0/3 Thymus (3) 3/3 Medullär epitel 0/3 0/3 Tjocktarm (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Tonsill (3) 3/3 Kryptepitel 0/3 0/3 2/3 Germinalcentrum (makrofager) Tunntarm (3) 0/3 0/3 0/3 Äggstock (3) 0/3 0/3 0/3 Neoplastiska vävnader: Tabell 5 sammanfattar immunreaktionen från Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 på en panel med neoplastiska vävnader. Plasmamembranfärgning observerades på immunceller och celler av epiteliskt ursprung. Cytoplasmisk färgning noteras i vissa celltyper men registrerades inte som positiv färgning. Alla vävnader formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx enligt instruktionerna i produktbladet. Inga oväntade resultat observerades i de testade tumörproverna. Den observerade färgningen stämde överens med rapporterad litteratur för PD-L1 IHC-uttryck i neoplastisk vävnad (10-13). Tabell 5: Sammanfattning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx neoplastisk vävnadsreaktivitet Tumörtyp Placering PD-L1 positiv/total (N=159) Appendix 0/1 Bröst, DCIS 0/2 Bröst, invasiv duktal 0/7 Bröst, invasiv duktal metastasering till lymfkörtlar 0/1 Adenokarcinom Bukspottkörtel 0/2 Bukspottkörtel, duktal 0/3 Cervix, endocervikal typ 0/1 Esofagus 0/1 Gallblåsa 1/5 GI, metastasering till lunga 0/1 P03928SE_03/SK / s. 10/14

11 Tumörtyp Placering PD-L1 positiv/total (N=159) Huvud och hals, hårda gommen 0/1 Kolon 0/5 Livmoder, endometrium 0/3 Livmoder, klarcell 0/1 Lunga 1/4 Mage, mucinös 0/1 Magsäck 0/6 Prostata 0/5 Sköldkörtel, follikulär 0/1 Sköldkörtel, follikulär-papillär 0/1 Sköldkörtel, papillär 0/3 Spottkörtel/öronspottkörtel 0/2 Tjocktarm, metastasering till lever 0/1 Tjocktarm, mucinös 0/1 Tunntarm 0/2 Äggstock 0/1 Äggstock, endometrioid 0/1 Äggstock, mucinös 0/1 Äggstock, serös 0/1 Ändtarm 0/4 Adrenokortikalt karcinom Binjure 0/1 Astrocytom Cerebrum 0/3 Basalcellskarcinom Hud 0/1 Embryonalt karcinom Testikel 0/1 Ependymom Hjärna 0/1 Feokromocytom Binjure 0/1 Glioblastom Hjärna 0/1 Hepatoblastom Lever 0/1 Hepatocellulärt karcinom Lever 0/5 Kolon 0/1 Interstitialom Tunntarm 0/1 Ändtarm 0/1 Karcinom Öron, näsa, hals 0/1 Kondrosarkom Ben 0/1 Kordom Bäckenhåla 0/1 Leiomyosarkom Mjuk vävnad, bröstvägg 0/1 Urinblåsa 0/1 Lymfom Anaplastisk stor cell Lymfkörtel 0/1 Diffus B-cell Lymfkörtel 0/4 Hodgkin Lymfkörtel 2/2 Icke-Hodgkin Lymfkörtel 1/1 Medulloblastom Hjärna 0/1 Medullärt karcinom Sköldkörtel 0/1 Melanom Näshåla 0/1 Ändtarm 0/1 Meningiom Hjärna 0/2 Mesoteliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Mjuk vävnad, ländryggen 0/1 Njurcellskarcinom Klarcell Njure 0/6 Papillär Njure 0/1 Osteosarkom Ben 0/2 Primitiv neuroektodermal tumör (PNET) Retroperitoneum 0/1 Mjuk vävnad, embryonal 0/1 Rabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Seminom Testikel 0/2 Kolon 0/1 Metastatisk tjocktarmssignetringcellskarcinom till äggstock 0/1 Signetringcellskarcinom Cervix 2/5 Esofagus 0/7 Hud 0/2 Huvud och hals 0/2 Livmoder 0/1 Lunga 1/2 Skivepitelcellskarcinom Metastatisk esofagal skvamöscellskarcinom till lymfkörtel 0/1 Småcelligt karcinom Lunga 0/1 Spermatocytom Testikel 0/2 Synovialsarkom Bäckenhåla 0/1 P03928SE_03/SK / s. 11/14

12 Tumörtyp Placering PD-L1 positiv/total (N=159) Tymom Mediastinum 1/1 Ö-cellstumör Bukspottkörtel 0/1 Övergångsepitelkarcinom Njure 0/1 Urinblåsa 0/6 Repeterbarhet/extern reproducerbarhet Repeterbarhet och extern reproducerbarhet för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx har utvärderats av Dako och tre externa testplatser. Prestandadata finns i tabell 6 9. I repeterbarhetsstudierna hos Dako bestämdes negativ procentuell överensstämmelse (NPA), positiv procentuell överensstämmelse (PPA) och övergripande överensstämmelse (OA) vid tröskelvärdena 1 % och 50 % enligt tabell 6 och 7. Eftersom repeterbarhetsstudierna påvisade 100 % överensstämmelse beräknades konfidensintervallen med Wilson Score-metoden, baserat på antalet oberoende parvisa jämförelser. I de externa repeterbarhetsstudierna bestämdes medelvärde för negativ procentuell överensstämmelse (ANA), medelvärde för positiv procentuell överensstämmelse (APA) och övergripande procentuell överensstämmelse (OA) vid tröskelvärdena 1 % och 50 % enligt tabell 8 och 9. Medelvärdesöverensstämmelser beräknades eftersom ingen naturlig referens finns för reproducerbarhetsparametrar som plats och observatör. Konfidensintervaller för medelvärdesöverensstämmelser beräknades med en percentilbootstrapmetod. (Observera att repeterbarhetsstudierna inte analyserades med bootstrapkonfidensintervall eftersom den inte kan beräknas med data utan diskordans.) Tabell 6: Repeterbarhet för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testad på en plats ( 1 %) Repeterbarhetsstudie Diagnostiskt stopp Studieutformning Mellan instrument 1 % Alla 16 NSCLC-prover (8 PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades på alla sex Autostainer Link 48- instrument. Mellan operatörer 1 % Alla 16 NSCLC-prover (8 PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades av sex analytiker med ett Autostainer Link 48-instrument. Mellan dagar 1 % Alla 16 NSCLC-prover (8PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades på sex icke efterföljande dagar med ett Autostainer Link 48-instrument. Mellan loter 1 % Alla 16 NSCLC-prover (8 PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades med tre upprepningar och tre reagensloter med ett Autostainer Link 48- instrument. Inom körningar 1 % Alla 16 NSCLC-prover (8 PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades med sex upprepningar inom en körning med ett Autostainer Link 48-instrument. Inom dagar 1 % Alla 16 NSCLC-prover (8PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades i två körningar, upprepade under tre dagar, med ett Autostainer Link 48-instrument. % överensstämmelse NPA 100 % (91,2 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 100 % (91,0 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 100 % (91,2 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 98,6 % (96,0 100 %) PPA 98,6 % (95,7 100 %) OA 98,6 % (95,8 100 %) NPA 100 % (91,2 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 100 % (91,0 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA = negativ procentuell överensstämmelse (Negative Percent Agreement), PPA = positiv procentuell överensstämmelse (Positive Percent Agreement), OA = övergripande överensstämmelse (Overall Agreement) Tabell 7: Repeterbarhet för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testad på en plats ( 50 %) Repeterbarhetsstudie Diagnostiskt stopp Studieutformning Mellan instrument 50 % Alla 16 NSCLC-prover (10 PD-L1-negativa och 6 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades på alla sex Autostainer Link 48- instrument. Mellan operatörer 50 % Alla 16 NSCLC-prover (10 PD-L1-negativa och 6 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades av sex analytiker med ett Autostainer Link 48-instrument. Mellan dagar 50 % Alla 16 NSCLC-prover (10 PD-L1-negativa och 6 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades på sex icke efterföljande dagar med ett Autostainer Link 48-instrument. Mellan loter 50 % Alla 16 NSCLC-prover (8 PD-L1-negativa och 8 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades med tre upprepningar och tre reagensloter med ett Autostainer Link 48- instrument. Inom körningar 50 % Alla 16 NSCLC-prover (10 PD-L1-negativa och 6 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades med sex upprepningar inom en körning med ett Autostainer Link 48-instrument. % överensstämmelse NPA 100 % (92,9 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) NPA 100 % (92,7 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) NPA 100 % (92,9 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) NPA 100 % (92,6 100 %) PPA 100 % (92,6 100 %) OA 100 % (96,2 100 %) NPA 100 % (92,9 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) P03928SE_03/SK / s. 12/14

13 Repeterbarhetsstudie Diagnostiskt stopp Studieutformning Inom dagar 50 % Alla 16 NSCLC-prover (10 PD-L1-negativa och 6 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades i två körningar, upprepade under tre dagar, med ett Autostainer Link 48-instrument. % överensstämmelse NPA 100 % (88,3 100 %) PPA 100 % (82,4 100 %) OA 100 % (92,4 100 %) NPA = negativ procentuell överensstämmelse (Negative Percent Agreement), PPA = positiv procentuell överensstämmelse (Positive Percent Agreement), OA = övergripande överensstämmelse (Overall Agreement) Tabell 8: Reproducerbarhet för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testad på tre externa platser ( 1 %) Reproducerbarhetsstudie Diagnostiskt stopp Studieutformning Mellan platser 1 % Alla 36 NSCLC-prover (16 PD-L1-negativa och 20 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades under fem icke efterföljande dagar. Analys mellan platser utfördes mellan tre platser med totalt parvisa jämförelser. Inom platser 1 % Alla 36 NSCLC-prover (16 PD-L1-negativa och 20 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades under fem icke efterföljande dagar på tre olika studieplatser. Analys inom platser utfördes på tre platser med totalt parvisa jämförelser. Mellan observatörer 1 % Poängsättning av 62 NSCLC-prover (28 PD-L1- negativa och 34 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck, färgade med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx utfördes av tre patologer, en på varje studieplats, på tre icke efterföljande dagar. Analys mellan observatörer utfördes mellan tre platser med totalt parvisa jämförelser. Bland observatörer 1 % Poängsättning av 62 NSCLC-prover (28 PD-L1- negativa och 34 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck, färgade med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx utfördes av tre patologer, en på varje studieplats, på tre icke efterföljande dagar. Analys bland observatörer utfördes på tre platser med totalt 558 parvisa jämförelser. % överensstämmelse ANA 94,8 % (90,3 98,4 %) APA 95,5 % (91,2 98,7 %) OA 95,2 % (90,8 98,6 %) ANA 96,2 % (94,1 97,5 %) APA 96,7 % (95,0 97,9 %) OA 96,5 % (95,2 97,4 %) ANA 85,8 % (79,3 91,8 %) APA 88,2 % (82,2 93,3 %) OA 87,1 % (81,0 92,6 %) ANA 93,7 % (90,0 96,1 %) APA 94,8 % (91,6 96,7 %) OA 94,3 % (92,0 95,9 %) ANA = medelvärde för negativ överensstämmelse (Average Negative Agreement), APA = medelvärde för positiv överensstämmelse (Average Positive Agreement), OA = övergripande överensstämmelse (Overall Agreement) Tabell 9: Reproducerbarhet för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testad på tre externa platser ( 50 %) Reproducerbarhetsstudie Diagnostiskt stopp Studieutformning Mellan platser 50 % Alla 36 NSCLC-prover (21 PD-L1-negativa och 15 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades under fem icke efterföljande dagar. Analys mellan platser utfördes mellan tre platser med totalt parvisa jämförelser. Inom platser 50 % Alla 36 NSCLC-prover (21 PD-L1-negativa och 15 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck testades under fem icke efterföljande dagar på tre olika studieplatser. Analys inom platser utfördes på tre platser med totalt parvisa jämförelser. Mellan observatörer 50 % Poängsättning av 62 NSCLC-prover (30 PD-L1- negativa och 32 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck, färgade med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx utfördes av tre patologer, en på varje studieplats, på tre icke efterföljande dagar. Analys mellan observatörer utfördes mellan tre platser med totalt parvisa jämförelser. Bland observatörer 50 % Poängsättning av 62 NSCLC-prover (30 PD-L1- negativa och 32 PD-L1-positiva) med olika PD-L1 IHC-uttryck, färgade med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx utfördes av tre patologer, en på varje studieplats, på tre icke efterföljande dagar. Analys bland observatörer utfördes på tre platser % överensstämmelse ANA 90,3 % (84,4 95,2 %) APA 85,2 % (75,6 92,9 %) OA 88,3 % (81,4 94,3 %) ANA 91,9 % (88,8 94,8 %) APA 87,6 % (82,5 92,2 %) OA 90,2 % (86,3 93,7 %) ANA 92,6 % (87,8 96,7 %) APA 92,8 % (88,1 96,8 %) OA 92,7 % (88,1 96,8 %) ANA 96,4 % (94,0 98,5 %) APA 96,5 % (94,3 98,6 %) OA 96,4 % (94,3 98,6 %) med totalt 558 parvisa jämförelser. ANA = medelvärde för negativ överensstämmelse (Average Negative Agreement), APA = medelvärde för positiv överensstämmelse (Average Positive Agreement), OA = övergripande överensstämmelse (Overall Agreement) P03928SE_03/SK / s. 13/14