Catalyzed Signal Amplification (CSA) System För användning med primära musantikroppar

Transkript

1 Catalyzed Signal Amplification (CSA) System För användning med primära musantikroppar Kod K ml Begränsad användarlicens Denna produkt distribueras och säljs till slutanvändaren i enlighet med en licens från NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. för användning av slutanvändaren i manuell eller automatiserad behandling endast på Dako instrumentutrustning för mikroskopobjektglas eller annat supportmaterial (andra än mikroarrayer och biochips) som innehåller cell- eller vävnadsprov för undersökning av dessa prover under mikroskop (inklusive automatiserad bildtagning och analyssystem) i syfte att detektera målnukleinsyror eller proteiner. Inköp innebär inte rättighet att återsälja eller överföra denna produkt, varken som en fristående produkt eller som en del av en annan produkt. All annan användning av denna produkt än licensierad användning utan uttrycklig skriftlig tillåtelse från NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. är strängt förbjuden. CSA-systemet ger uttryck åt teknologi som utvecklats av och licensierats från NEN Life Science Products, Inc. (U.S. patentnummer 5,196,306). Denna produkt är också licensierad under U.S. patentnummer 4,684,609. Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dessa instruktioner gäller Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, Peroxidase (CSA System, HRP). Detta system är avsett för användning med primära antikroppar från mus för identifiering av antigener genom ljusmikroskopi i normala och patologiska formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader. Detta system kan även användas med primära antikroppar från kanin med CSA Rabbit Link (kod K1498). Sammanfattning och förklaring Procedurprinciper Medföljande reagenser CSA System, HRP är en extremt känslig immunhistokemisk (IHC) färgningsprocedur med en signalamplifikationsmetod baserad på peroxidaskatalyserad utfällning av en biotinylerad fenolblandning 1 som följs av en sekundär reaktion med streptavidinperoxidas. I proceduren detekteras först en primär musantikropp med en biotinylerad sekundär antikropp. Sedan får ett streptavidinbiotinperoxidaskomplex bindas till den biotinylerade sekundära antikroppen via dess streptavidin. Nästa steg utnyttjar den bundna peroxidasen för att katalysera utfällning på provet av en biotinylerad fenol, vilket resulterar i en amplifikation av antalet biotinmolekyler tillgängliga för bindning till nästa reagens, streptavidinperoxidas. Färgning slutförs med hjälp av diaminobenzidin/väteperoxid som kromogen/substrat. Jämförelser med standardmärkta streptavidinbiotinmetoder (LSAB) har visat att CSA System, HRP är ca. 50 gånger större i sensitivitet. Denna procedur resulterar i hög signalamplifikation, som medger detektering av extremt små mängder målantigen. De tekniker som används i detta system är baserade på avidinbiotin och peroxidasmetodologier. Proven inkuberas först med Peroxidase Block i 5 minuter för att dämpa endogen peroxidasaktivitet. Proven inkuberas sedan i 5 minuter med ett proteinblock för att dämpa ospecifik bindning av efterföljande reagenser, och inkuberas sedan med en lämpligt karakteriserad och spädd primär musantikropp eller negativ kontrollreagens. Detta följs av sekventiella 15 minuters inkubationer med biotinylerad länkantikropp, streptavidinbiotinperoxidaskomplex, amplifikationsreagens och streptavidinperoxidas. Färgning slutförs genom en 5 minuters inkubation med 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB) som resulterar i en brunfärgad utfällning på antigenstället. Följande material, tillräckligt för upp till 150 snitt, ingår i detta system: Mängd Beskrivning Peroxidase Block 3 % väteperoxid i vatten. Protein Block Serumfritt protein i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,015 mol/l natriumazid. Link Antibody Biotinylerade kanin anti-musimmunoglobuliner i Tris-HCI-buffert som innehåller stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 1/9

2 1x1 ml Streptavidinbiotinkomplex, reagens A Streptavidin i PBS-buffert innehållande en antimikrobiell agent. 1x1 ml Streptavidinbiotinkomplex, reagens A Biotin konjugerat till pepparrotsperoxidas i PBS-buffert innehållande en antimikrobiell agent. 1x25 ml Streptavidinbiotinkomplex, spädningsvätska PBS-buffert som innehåller stabiliserande protein och en antimikrobiell agent. Amplifikationsreagens Biotinyltyramid och väteperoxid i PBS innehållande stabiliserande protein och antimikrobiell agent. Streptavidinperoxidas Streptavidin konjugerad till pepparrotsperoxidas i PBS innehållande stabiliserande protein och en antimikrobiell agent. 10 Substrattabletter, DAB kromogen Varje tablett innehåller 10mg 3,3 -diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB) förpackad med torkmedel. 1x6 ml Substrat, Tris-buffertkoncentrat Tris-HCl-buffertkoncentrat. 1x2 ml Substrat, väteperoxid 0,8 % väteperoxid i vatten. Tillbehör 1 5 ml kalibrerat provrör med lock för användning i preparationen av streptavidinbiotinkomplex 1 Substratbehållare 110 ml kalibrerat provrör med lock för användning i beredningen av `````````````````substratkromogen reagens 1 Pincett Material som fordras, men inte medföljer För optimala färgningsresultat med CSA System, HRP (kod K1500), rekommenderas användning av CSA Ancillary System (kod K1499). Detta system inkluderar Target Retrieval Solution, Tris Buffered Saline with Tween 20, Biotin Blocking System och Antibody Diluent with Background Reducing Components. För färgning med primära antikroppar från kanin rekommenderas användning av CSA Rabbit Link (kod K1498) som ersättning för medföljande Link Antibody. Biotin Blocking System (kod X0590 eller i K1499) Kontrollvävnad, positiv och negativ Kontrastfärg, som Mayers hematoxylin eller Lillies Modified Mayers Hematoxylin (kod S3309) Monteringsmedia, som Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025) Primära antikroppar och negativa kontrollreagenser Primär antikroppsspädningsvätska, som Antibody Diluent with Background Reducing Components (kod S3022 eller i K1499) Objektglas, Poly-L-Lysine coated or Silanized Slides (kod S3003) Tvättbuffertlösning, som TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20), 10x Concentrate (kod S3306 eller i K1499) ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 2/9

3 Tillvalsmaterial som fordras, men inte medföljer Ammoniumhydroxid, 0,037 mol/l Target retrieval-lösning, som Target Retrieval Solution (kod S1699, S1700 eller i K1499) Vattenbad (som kan hålla C), ångkokare eller autoklav för utförande av target retrieval Försiktighetsåtgärder 1. För professionella användare. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är synnerligen giftig i ren form. Vid produktkoncentration kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det kastas, så att azider inte ackumuleras i avloppet. 2,3 3. Använd inte reagenser efter utgångsdatum för föreskriven förvaringsmetod. Om reagenserna förvaras under andra än specificerade förhållanden, måste dessa verifieras av användaren. 4. Använd inte reagenser från andra satsnummer eller från satser från andra tillverkare. 5. Enzymer och substratkromogener kan påverkas negativt om de utsätts för starkt ljus. Förvara inte satsdelarna eller utför färgning i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. 6. Andra inkubationstider eller temperaturer än de som anges, kan ge felaktiga resultat. Sådana ändringar måste godkännas av användaren. 7. Bär lämplig personskyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 8. Oanvänd lösning bör kastas enligt lokala, statliga och federala bestämmelser. 9. Säkerhetsdatablad finns tillgängliga för professionella användare på begäran. 10. Som med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta procedurer användas vid hanteringen. Varning Streptavidin Biotin Complex Diluent: 10-30% Glycerol H320 Orsakar ögonirritation. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Varning Amplification Reagent: 10-30% Glycerol H320 Orsakar ögonirritation. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Fara DAB Chromogen Tablets: 10-30% borsyra, 5-10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kan orsaka cancer. H360 Kan skada fertiliteten eller det ofödda barnet. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. H335 Kan orsaka irritation i luftvägarna. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P281 Använd föreskriven personlig skyddsutrustning. P271 Används endast utomhus eller i väl ventilerade utrymmen. P261 Undvik att inandas ångor. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P304 + P340 + P312 VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att han eller hon vilar i en ställning som underlättar andningen. Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. P405 P501 Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Varning Substrate Buffer Concentrate: 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H315 Irriterar huden. ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 3/9

4 P280 P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID HUDKONTAKT: Tvätta med mycket tvål och vatten. Ta av nedstänkta kläder. Nedstänkta kläder ska tvättas innan de används igen. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Förvaring Reagenser från CSA System, HRP ska förvaras i 2 8 C. Får ej frysas. Använd inte efter det utgångsdatum som står på reagensflaskorna och satsetiketten. Förändringar i utseendet hos reagensen, som t.ex. utfällning, kan indikera instabilitet eller försämring. I sådana fall bör reagenserna inte användas. Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos dessa produkter. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt med patientprover. Kontakta Dako tekniska support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och problem med satsen misstänks. Provberedning Reagensberedning Före IHC-färgning måste vävnaderna fixeras och behandlas. Fixering förhindrar autolys och röta av använda vävnader, bevarar antigenicitet, förhöjer brytningsindex av vävnadsbeståndsdelarna och höjer motståndet mot vävnadsbehandling hos cellulära element. Vävnadsbehandling inkluderar dehydrering, klarnande av dehydreringsmedel, infiltration av inbäddade medier, inbäddande och delning av vävnader. De vanligaste fixativen för IHC-vävnadspreparat diskuteras i de allmänna instruktionerna för immunhistokemisk färgning. Dessa är endast riktlinjer. Optimala procedurer måste bestämmas och verifieras av användaren. Nedanstående reagenser bör beredas före färgning. Tvättbuffertlösning Undersökningar har visat att 0,05 mol/l Tris-HCl ph 7,6, innehållande 0,3 mol/l NaCl och 0,1% Tween 20 (kod S3306 eller i K1499), betydligt underlättar i reduceringen av bakgrundsfärgning. Dess användning anbefalles. Vävnadssnitt bör sköljas med TBST och inkuberas i rumstemperatur i minst tre minuter i minst ett färskt bad med TBST mellan varje reagenssteg i CSA System, HRP-protokoll. För ytterligare hämmande av bakgrundsfärgning bör vävnadssnitt inkuberas i fem minuter i tre färska bad med TBST mellan varje reagenssteg. Tvättbufferten får inte innehålla natriumazid eftersom detta inaktiverar pepparrotsperoxidasen och resulterar i negativ färgning. Förvara oanvänd buffert i 2 8 C. Kasta bufferten om den är grumli g till utseendet. Destillerat vatten kan användas för sköljning av peroxidasblock, substratkromogen och kontrastfärg. Primär antikropp/negativ kontrollreagens Om så önskas kan primär antikropp och negativ kontrollreagens spädas ytterligare med Antibody Diluent with Background Reducing Components (kod S3022 eller i K1499). Streptavidinbiotinkomplex Bered streptavidinbiotinkomplexet minst 30 minuter före användning. Det beredda streptavidinbiotinkomplexet är stabilt i upp till två veckor i 2 8 C. Varje 1 ml av beret t streptavidinbiotinkomplex räcker till upp till 10 snitt. STEG 1 Beroende på hur många objektglas som ska färgas, överför man tillräckligt många 1 ml alikvoter av buffert från flaska 7 (streptavidinbiotinkomplex spädningsvätska) i det medföljande 5 ml kalibrerade provröret. STEG 2 Tillsätt för varje 1 ml buffert en droppe (40 µl) från flaska 5 (streptavidinbiotinkomplex, reagens A) och en droppe (40 µl) från flaska 6 (streptavidinbiotinkomplex, reagens B) och blanda. Bered minst 30 minuter före användning Det 5 ml kalibrerade provröret som medföljer systemet kan återanvändas. Skölj grundligt provröret med destillerat vatten efter varje användning. Substratkromogen lösning Substratkromogen lösning som innehåller väteperoxid kan förvaras i ungefär åtta timmar efter beredning. Lösning som inte används efter denna tid, bör kastas. Resterande DAB-lösning som inte innehåller väteperoxid kan förvaras i mörker i upp till fem dagar i 2 8 C, eller längre i 20 C. För att bereda mer substratk romogen lösning, värm till rumstemperatur och tillsätt väteperoxid efter behov. STEG 1 Låt flaska 10 (substrattabletter) uppnå rumstemperatur före öppnandet. STEG 2 Häll 10 droppar från flaska 11 (tris-buffertkoncentrat) i det kalibrerade 10 ml provröret och destillerat vatten till 10 ml-markeringen och blanda. STEG 3 Använd pincett för att överföra en substrattablett till de 10 ml av spädd Tris-buffert. Stäng tablettbehållaren ordentligt. Sätt lock på provröret och skaka eller snurra för att lösa upp tabletten. ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 4/9

5 STEG 4 2 ml substratkromogen lösning räcker till upp till 20 snitt. Överför med användning av engångspipett lämplig mängd DAB-lösning (i 2 ml steg) till substratbehållaren, tillsätt en droppe (40 ml) från flaska ``````````````12 (substratväteperoxid) för varje 2 ml DAB-lösning, tryck på pipettspetsen och blanda. Anm.: För att förhindra kontaminering, vidrör inte pipettspetsen med fingrarna. Pipettspetsen bör hanteras med handskar vid införande och uttagning. Det kalibrerade 10 ml provröret och substratbehållaren som medföljer systemet kan återanvändas. Skölj provröret och substratbehållaren grundligt med destillerat vatten efter varje användning. Kontrastfärg Den färgade slutprodukten av färgningsreaktionen är alkohollöslig och kan användas med alkohol- eller vattenbaserade kontrastfärger som Mayers hematoxylin. Efter kontrastfärgning med hematoxylin, skölj ordentligt i destillerat vatten och doppa objektglasen i ett bad av 0,037 mol/l ammoniak eller liknande blåningsmedel. Monteringsmedier Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025) rekommenderas för vattenmontering. Objektglas kan även monteras permanent med användning av icke-vattenbaserat permanent monteringsmedium. Paraffininbäddat provpreparat Allmänna kommentarer Före IHC-färgning måste vävnader fixeras och behandlas. Vävnadsbehandling inkluderar dehydrering, klarnande av dehydreringsmedel, infiltration av inbäddade medier, inbäddning och delning av vävnader. Optimala procedurer måste bestämmas och verifieras av användaren. (För specifik information angående vävnadsfixering och behandling, se referenser 5 och 6.) Vävnadsantigeners överlevnad för immunologisk färgning kan bero på fixativets typ och koncentration, på fixeringstiden och på storleken hos det vävnadsprov som ska fixeras. Det är viktigt att bibehålla optimala, standardiserade fixeringsförhållanden då detta är möjligt för att uppnå reproducerbar färgning. Där så är möjligt, rekommenderas användning av tunnare prover kopplade med kortare fixeringstider. Förlängd exponering för fixativ kan resultera i maskering av antigener och bidra till reducerad färgning. Efter fixering dehydreras vävnader med hjälp av graderad alkohol, klarnas med xylen eller xylenersättning och infiltreras med paraffinvax. Vävnaden bäddas sedan in med paraffinvax i formar eller kassetter, vilket underlättar vävnadsdelningen. För att reducera denaturering av antigener, bör vävnader inte utsättas för högre temperaturer än 60 C under behandling. Vävnadsblock kan förvaras eller delas vid slutförandet av inbäddningen. Rätt fixerade och paraffininbäddade vävnader håller sig obegränsat om de förvaras kallt. Färgningsprocedur Montering av vävnadssnitt Placera delade vävnader skurna från paraffininbäddade block på rena objektglas. Dehydrera i ugn i en eller två timmar i 60 C eller mindre eller låt lufttorka i 1 5 till 24 timmar. För bättre adhesion av vävnadssnitt under IHCfärgningsprocedurer föreslås användning av poly-l-lysin-belagda objektglas, laddade objektglas eller Silanized Slides (kod S3003). Användning av Silanized eller laddade objektglas anbefalles för färgningsprocedurer som fordrar target retrieval. Objektglas med paraffininbäddade vävnadssnitt kan håller sig obegränsat om de förvaras kallt. Anmärkningar om procedurenanvändning av nedanstående färgningsprotokoll rekommenderas för CSA System, HRP. Detta protokoll kräver 15 minuters inkubationer för stegen 3 till 7 och resulterar i en extremt hög sensitivitet. I de fall där sådan hög sensitivitet inte önskas kan en alternativ procedur utföras genom att ersätta 10 minuters inkubationer för steg 3 till 7. Alla reagenser bör värmas till rumstemperatur (20 25 C) före immunofärgning. Likaledes bör alla inkub ationer utföras i rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan visa ökad ospecifik färgning. Täck objektglas som utsätts för drag. Om förlängda inkubationer används, placera vävnaderna i fuktig omgivning. För minskning av ospecifik bakgrundsfärgning bör vävnadssnitten sköljas med TBST och inkuberas i rumstemperatur i minst 3 minuter i minst ett färskt bad av TBST mellan varje reagenssteg i CSA System, HRP protokoll, inklusive Biotin Blocking System protokollsteg. För ytterligare hämmande av bakgrundsfärgning, bör vävnadssnitt inkuberas i fem minuter i tre färska bad med TBST mellan varje reagenssteg. Deparaffinering av vävnadssnitt Före färgning måste vävnadsobjektglas deparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedel och sedan återhydratiseras. Undvik ofullständigt avlägsnande av paraffin. Resterande inbäddningsmedier resulterar i ökad ospecifik färgning. Proteolytisk digestion och target retrieval ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 5/9

6 Formaldehyd är känd för att framkalla konformistiska ändringar i antigenmolekylerna genom att bilda intermolekylära tvärkopplingar. Överflödig formalinfixering kan maskera antigena ställen och minska specifik färgning. I standard-ihc-procedurer kan dessa ställen visas med proteolytisk digestion av vävnad före immunfärgning. Anm.: Användning av proteolytisk predigestion kan resultera i hög bakgrundsfärgning med detta system. Target retrieval är ett godkänt alternativ till predigestion och resulterar i en svag ökning av bakgrundsfärgning samtidigt med en betydande ökning i specifik färgning med många primärantikroppar. För att avgöra om förbehandling med target retrieval är motiverad, se specifikationsbladet som medföljer med varje primärantikropp. För vissa primära antikroppar är denna procedur nödvändig. Target retrieval-proceduren innebär dämpning av vävnadssnitt monterade på objektglas i lösning (Target Retrieval Solution, kod S1699, S1700 eller i K1499) och upphettning före IHC-färgning. Skölj grundligt med 0,05 mol/l Tris-HCI och fortsätt med färgningsproceduren. Anm.: Fettvävnader kan lossna från poly-l-lysinbelagda objektglas under target retrieval. Silaniserade eller laddadeobjektglas är att föredra för användning med target retrieval. Blockering av endogen avidinbindande aktivitet (endogent biotin) I konventionella avidinbiotintekniker kan utvärderingen av specifik färgning hindras av förekomsten av endogent biotin. Detta är ett stort bekymmer med CSA System, HRP på grund av dess höga sensitivitet. Endogent biotin bör rutinmässigt blockeras genom sekventiell applicering av avidin och biotin. Biotin Blocking System (kod X0590 eller i K1499) har formulerats att vara kompatibelt med CSA System, HRP. Färgningsprotokoll STEG 1 PEROXIDASBLOCK Knacka av överflödig vätska. Använd en luddfri vävnad (som t.ex. Kimwipe eller gasbinda) och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all resterande vätska och för att hålla reagenserna inom det föreskrivna området. Applicera tillräckligt mycket väteperoxid från flaska 1 för att täcka provet. Inkubera i 5 (±1) minuter. Skölj försiktigt med destillerat vatten eller buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte flödet direkt på vävnaden) och placera i färskt buffertbad i minst tre minuter. Anm.: Användning av 0,05 mol/l Tris-HCl ph 7,6, som innehåller 0,3 moll NaCl och 0,1 % Tween 20 rekommenderas som tvätt- och badbuffert. STEG 2 PROTEINBLOCK Knacka av överflödig vätska och torka av objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt många droppar från flaska 2 (Protein Block) för att täcka provet. Inkubera i 5 (±1) minuter. SKÖLJ INTE AV PROTEINBLOCKET. STEG 3 PRIMÄRANTIKROPP ELLER NEGATIV KONTROLLREAGENS Knacka av överflödigt proteinblock och torka av objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt mycket primärantikropp eller negativ kontrollreagens för att täcka provet. Inkubera 15 (±1) minuter om inget annat anges i specifikationsbladet för primärantikroppen. Skölj försiktigt med TBST buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte flödet direkt på vävnaden) och placera i upp till tre färska TBST buffertbad i 3-5 minuter vardera. Om färgningsproceduren måste avbrytas, kan objektglasen förvaras i ett buffertbad efter inkubationen av primärantikroppen (steg 3) eller länkantikroppen (steg 4) i upp till en timme i rumstemperatur (20 25 C) utan att påverka färgningen. STEG 4 LÄNKANTIKROPP Torka objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt många droppar från flaska 4 (länkantikropp) för att täcka provet. Inkubera i 15 (±1) minuter. Skölj objektglaset i steg 3. Placera i upp till tre färska TBST buffertbad i 3-5 minuter vardera. För användning med primärantikroppar från kanin, använd CSA Rabbit Link (kod K1498) istället för medföljande länkantikropp. STEG 5 STREPTAVIDINBIOTINKOMPLEX Torka av objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt många droppar av det beredda streptavidinbiotinkomplex för att täcka provet. Inkubera i 15 (±1) minuter. Skölj objektglasen som tidigare. Placera i upp till tre färska TBST-buffertbad i 3-5 minuter vardera. STEG 6 AMPLIFIKATIONSREAGENS Torka av objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt många droppar från flaska 8 (amplifikationsreagens) för att täcka provet. ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 6/9

7 Inkubera i 15 (±1) minuter. Skölj objektglaset som tidigare. Placera i upp till tre färska TBST buffertbad i 3-5 minuter vardera. STEG 7 STREPTAVIDINPEROXIDAS Torka av objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt många droppar från flaska 9 (streptavidinperoxidas) för att täcka provet. Inkubera i 15 (±1) minuter. Skölj objektglaset som tidigare. Placera i upp till tre färska TBST buffertbad i 3-5 minuter vardera. STEG 8 SUBSTRATKROMOGEN LÖSNING Torka av objektglaset som tidigare. Applicera tillräckligt mycket av den beredda substratkromogena lösningen för att täcka provet (se avsnittet Reagensberedning). Inkubera i 5 (±1) minuter. Skölj försiktigt med destillerat vatten från en tvättflaska (rikta inte flödet direkt på vävnaden). SamLa substratkromogent avfall i en behållare för farligt material för korrekt avfallshantering. STEG 9 HEMATOXYLINKONTRASTFÄRG (valfritt) Doppa objektglasen i ett bad av hematoxylin som t.ex. kod S3309. Inkubationslängd beror på styrkan hos använt hematoxylin. Skölj försiktigt i bad med destillerat vatten. Doppa objektglasen 10 gånger i ett bad av 0,037 mol/l ammoniak eller liknande blåningsmedel. Skölj objektglaset i ett bad med destillerat eller avjoniserat vatten i 2-5 minuter. STEG 10 MONTERING Prov kan monteras och täckas med ett vattenbaserat monteringsmedium som t.ex. Faramount (kod S3025) eller Glycergel (kod C0563). Kvalitetskontroll Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarlaboratoriet kan framkalla betydande variationer i resultaten, vilket nödvändiggör regelbundet utförande av interna kontroller.se referenser 8 till 10 för utförligare information om kvalitetskontroll. Detaljerad information om sensitivitet och immunoreaktivitet återfinns i specifikationsbladet för varje primärantikropp. Positiv kontrollvävnad Kända positiva kontrollvävnader bör användas för granskning av korrekt utförande av behandlade vävnader och testreagenser. Om de positiva kontrollvävnaderna inte uppvisar positiv färgning, bör resultaten med testproven anses ogiltiga. Negativ kontrollreagens Använd negativ kontrollreagens i stället för primärantikroppen med ett snitt av varje testprov för att utvärdera ospecifik färgning och medge bättre tolkning av specifik färgning på antigenstället. Om antikroppspaneler används på seriella vävnadssnitt, kan de negativt färgade områdena på ett objektglas fungera som negativ/ ospecifik bindande bakgrundskontroll för andra antikroppar. För hjälplösningar för avvikande testresultat, se Felsökning. Färgningstolkning Positiv kontrollvävnad bör undersökas först för att säkerställa att alla reagenser fungerar ordentligt. Förekomst av en brunfärgad slutprodukt på stället för målantigen indikerar positiv reaktivitet. Om de positiva kontrollvävnaderna inte uppvisar positiv färgning, skall resultaten med testproven anses ogiltiga. Om ospecifik färgning förekommer, har den prickliknande eller diffust utseende. Den höga sensitiviteten hos detta system beror på dess höga nivå av signalamplifikation; eventuell ospecifik bakgrundsfärgning förstärks också. Av detta skäl rekommenderas användning av negativa kontrollreagenser på ett snitt av varje kontroll och testprov som hjälp i tolkningen av färgning (se Begränsningar för utförligare diskussion om ospecifik färgning). Sporadisk ljus färgning av bindväv kan ses i snitt från överdrivet formalinfixerade vävnader. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultat. Nekrotiska eller degenererade celler färgar ofta ospecifikt. Falskt positiva resultat kan ses på grund av icke-immunologisk bindning av reagenser till vävnadssnitt. Produktspecifika begränsningar Endogent immunoglobulin, som finns i humana vävnadsprov, kan uppvisa olika nivåer av korsreaktivitet med sekundära antiimmunoglobulinantikroppar. Den sekundära antikroppen som används i detta system är ett starkt renat biotinylerat F(ab )2 fragment från kanin anti-mus-igg (heavy och light chain-specifik). Denna antikropp har i stor utsträckning absorberats med normalt humant serum för att reducera korsreaktivitet. På grund av hög sensitivitet hos detta system kan korsreaktivitet till endogena immunoglobuliner emellertid fortfarande detekteras i vissa prover. Bakgrundsfärgning på grund av endogen immunoglobulin känns bäst igen i den negativa kontrollen som färgning runt blod och lymfkärl, i bindväv och i extravaskulära vävnadsutrymmen. Vissa typer av epitel, speciellt de som associeras med matsmältningsorganet, kan också uppvisa endogena immunoglobuliner. Färgning på grund av endogena immunoglobuliner förstärks också vid användning av target retrieval-metoder. Av denna anledning fordras användning av lämpliga negativa kontrollreagenser och vävnader för tolkning av all positiv färgning där förekomst av endogen immunoglobulin misstänks. ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 7/9

8 Endogen, avidinbindande aktivitet har konstaterats i frysta snitt av lever (hela leverknutor) och njure (cylinderepitel), så väl som i frysta och formalinfixerade lymfvävnader. 11 Rutinmässig användning av Biotin Blocking System (kod X0590 eller i K1499) rekommenderas för att minska ospecifik färgning på grund av endogen, avidinbindande aktivitet. Endogen peroxidas eller pseudoperoxidasaktivitet kan finnas i hemoproteiner som hemoglobin, myoglobin, cytokrom och katalas samt i eosinofiler. 12,13 Denna aktivitet kan hämmas genom att inkubera proven med Peroxidase Block (Flaska 1 av CSA System, HRP) i fem minuter före applicering av primärantikropp. Vävnader som innehåller hepatit B ytantigen (HBsAg) kan uppvisa ospecifik färgning med pepparrotsperoxidas. 14 Normala/Icke-immuna sera från samma djurkälla som de sekundära antisera som används i blockeringsstegen kan orsaka falskt negativa eller falskt positiva resultat på grund av auto-antikroppar eller naturliga antikroppar. Använd inte denna sats på musvävnad. Den antimusimmunoglobulinlänksantikropp som ingår i denna sats reagerar med musimmunoglobuliner endogena i musvävnad och resulterar i hög bakgrund. Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Ingen färgning av något objektglas. 2. Svag färgning av alla objektglas. 3. För mycket bakgrundsfärgning i alla objektglas. 1a. Reagenser används ej i rätt ordning. 1b. Natriumazid i buffertbad. 2a. Snitten behåller för mycket lösning efter tvättbadet. 2b. Objektglasen inte inkuberade tillräckligt länge med antikroppar eller substrat. 2c. Antigen under undersökning fordrar target retrieval. 3a. Proven innehåller högendogena immunoglobuliner. 3b. Proven innehåller endogen avidinbindande aktivitet (endogent biotin). 3c. Proven innehåller hög endogen peroxidasaktivitet. 1a. Granska applicering av reagenser. 1b. Använd färsk, azidfri buffert. 2a. Knacka försiktigt av överflödig lösning före torkning runt snittet. 2b. Granska rekommenderade inkubationstider. 2c. Utför target retrieval. 3a. Jämför noggrant testvävnaden med den negativa reagenskontrollvävnaden för skillnader. 3b. Applicera Biotin Blocking System. 3c. Använd längre inkubationstid av peroxidasblock. 3d. Paraffinet ofullständigt avlägsnat. 3e. Objektglasen inte korrekt sköljda 3 f. Snabbare än normalt substrat reaktion på grund av t.ex. onödigt hög rumstemperatur. 3g. Snitten torkade under färgningsprocedur. 3d. Använd färska xylen- eller toluenbad. Om flera objektglas färgas samtidigt, bör det andra xylenbadet innehålla färsk xylen. 3e. Använd färska lösningar i buffertbad och tvättflaskor. TBST rekommenderas. Inkubera snitt i upp till tre färska TBST buffertbad i 35 minuter vardera. 3f. Använd kortare inkubationstid med substratkromogen lösning. 3g. Använd fuktkammare. Torka bara av tre till fyra objektglas åt gången före applicering av reagens. 3h. Ickespecifik bindning av reagenser till vävnadssnitt. 3i. Ickespecifik bindning av reagenser till vävnadssnitt. 3h. Använd längre inkubationstid av proteinblock. 3i. Späd primärantikroppen i spädningsantikropp. OBS: Om problemet inte kan tillskrivas någon av ovannämnda orsaker, eller om föreslagen korrigeringsåtgärd inte löser problemet, kontakta Dako tekniska support för assistans. Ytterliga information om färgningstekniker och provpreparation finns i Handbook Immunochemical Staining Methods 6 (tillgänglig hos Dako) och Atlas of Immunohistology. 15 Referenser 1. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. J Immunol Meth 1989; 125: Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, List of substances which may be candidates for further scientific review and possible identification, classification and regulation as potential carcinogens. Fed Reg 1980; 45(157) ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 8/9

9 5. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; Naish SJ (ed). Handbook Immunochemical Staining Methods. Carpinteria: Dako Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase: I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14: Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 10. Herman GE and Alfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Edition 07/15 ( ) P04038SE_01_K1500/ s. 9/9