Histology FISH Accessory Kit Kod K5799

Transkript

1 Histology FISH Accessory Kit Kod K5799 7:e utgåvan För in situ-fluorescenshybridisering (FISH) på formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssnitt. Kitet innehåller reagens som räcker till 20 tester. P04094SE_03/K p. 1/26

2 Innehållsförteckning Avsedd användning... 3 Inledning... 3 Reagens... 3 Medföljande material... 3 Material som behövs, men inte ingår... 4 Försiktighetsåtgärder... 5 Förvaring... 8 Provberedning... 8 Paraffininbäddade snitt... 8 BRUKSANVISNING... 9 A. Reagensberedning... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Etanolserier... 9 A.5 Pepsinlösning... 9 B. Färgningsprocedur B.1 Proceduranteckningar B.2 Behandling av vävnader före färgning B.3 Färgningsprotokoll B.3.a. Färgningsprotokoll för FISH-prober spädda i etylenkarbonat-baserad buffertlösning för hybridisering B.3.b. Färgningsprotokoll för FISH-prober spädda i formamidbaserad buffertlösning för hybridisering Kvalitetskontroll Tolkning av resultat Felsökning Bilaga Bilaga Referenser Förklaring av symboler P04094SE_03/K p. 2/26

3 SVENSKA Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Histology FISH Accessory Kit är avsett för användning vid in situ-fluorescenshybridiserings- (FISH) tekniken på formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssnittsprover. Reagens som medföljer Histology FISH Accessory Kit kan också användas med HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (kod K5731, flaska 3). Om reagens från Dako Histology FISH Accessory Kit (kod K5799) används med reagens från kod K5731 ska anvisningarna på produktbladet för kod K5731 följas. Inledning Histology FISH Accessory Kit innehåller alla nyckelreagens, utom proben, som krävs för att utföra en FISH-procedur på formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. Efter avparaffinering och rehydrering värms proverna upp i Pre-Treatment Solution följt av proteolytisk nedbrytning med användning av Pepsin. Efter uppvärmnings- och proteolytiska förbehandlingssteg appliceras FISHprober som tillhandahålls av användaren och proverna förseglas med Coverslip Sealant, före denaturering och hybridisering. Efter hybridiseringen utförs en stringenttvätt, vilken avlägsnar obundna och icke-specifika FISH-prober före dehydrering med etanol. Slutligen monteras proverna med Fluorescence Mounting Medium innehållande en blå fluorescerande kontrastfärg. Resultaten tolkas med ett fluorescensmikroskop utrustat med lämpliga filter (se Bilaga 1). Reagens Medföljande material Det material som anges nedan räcker till 20 tester (ett test definieras som ett 22 mm x 22 mm målområde). Kitet ger tillräckligt med material för upp till 10 enskilda FISH-körningar (fyra separata körningar, vid användning av pepsinnedsänkningsmetoden). Histology FISH Accessory Kit transporteras på kolsyreis. För att garantera att satsens komponenter inte har utsatts för hög temperatur under transporten bör kolsyreisen fortfarande finnas kvar vid leveransen. Observera att vissa kitkomponenter kan fortsätta vara ofrysta. Det påverkar inte prestandan hos Histology FISH Accessory Kit. Flaska 1 Flaska 2A Flaska 2B Flaska 4 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, koncentrerad 20x MES- (2-[N-morfolino]etansulfonsyra) buffert. Pepsin 4 x 6,0 ml, bruksfärdigt Pepsinlösning, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, koncentrerad 10x Spädningsmedelbuffert, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, koncentrerad x 20 SSC- (saltlösning-natriumcitrat) buffert med tvättmedel Tween-20. P04094SE_03/K p. 3/26

4 Flaska 5 Flaska 6 Artikel 7 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Bruksfärdigt fluorescensmonteringsmedium med 500 μg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x koncentrerad Tris/HCl-buffert. Coverslip Sealant 1 rör Bruksfärdig lösning för borttagbar försegling av täckglas OBS! Allt reagens kan bytas ut mot motsvarande reagens i Dakos HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). Om reagens från Dako Histology FISH Accessory Kit (kod K5799) används med reagens från kod K5731 ska anvisningarna på produktbladet för kod K5731 följas. Material som behövs, men inte ingår Laboratoriereagens Destillerat eller avjoniserat vatten Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitut Laboratorieutrustning Absorberande pappersdukar Justerbara pipetter Kalibrerad partiell immersionstermometer (område C) Täckglas (18 mm x 18 mm eller 22 mm x 22 mm och 24 mm x 50 mm eller 24 mm x 60 mm) Pincett Dragskåp Dako Hybridizer (kod S2450/S2451)* Värmeblock eller hybridiseringsugn* Fuktig hybridiseringskammare* Mikrocentrifug Objektglas, Dako Silanized Slides, kod S3003, poly-l-lysin-belagda objektglas eller superfrost Plusobjektglas Kärl eller bad för färgning Vaggor i metall eller plast Timer (med 0 60 minuters intervall) Vattenbad med lock (som kan hålla 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C och från 95 C till 99 C Mikrovågsugn med avkänningskapacitet om förbehandling utförs med mikrovågsugn** (se Steg 1 i avsnitt B.3.a eller B.3.b. Färgningsprotokoll, Metod B). Mikrovågssäker behållare, lock måste ha hål med en diameter på t.ex. en cm * Värmeblock för nedbrytning (37 (±2) C), värmeblock eller hybridiseringsugn för denaturering (66 (±2) C (B.3.a.) eller 82 (±2) C) (B.3.b.) och fuktig hybridiseringskammare för hybridisering (45 (±2) C) kan användas, men vi rekommenderar Dako Hybridizer, kod S2450/S2451. ** Vattenbad med lock (som kan hålla C) eller en mikroprocessorkontrollerad tryckkammare såsom Dako Pascal, kod S2800, kan användas i stället för en mikrovågsugn. P04094SE_03/K p. 4/26

5 Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI-filter och lämpliga filter för den fluorokrom som används, t.ex. FITC/Texas Red double filter, FITC och Texas Red mono filters för Dako FISH-prober - detaljinformation finns i bilaga 1. Fluorescensmikroskop med 100 watt kvicksilverlampa som ljuskälla bör användas för Dako FISHprober. Inga andra ljuskällor rekommenderas med dessa filter Mikroskopglasfolder (kartongbricka med gångjärnsförsett lock och plats för 20 objektglas eller liknande) Försiktighetsåtgärder 1. För diagnostisk användning in vitro. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Etiketter angående risker/faror krävs inte för flaskan 1. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 4. Flaska 2A, Pepsin, innehåller 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A och <0.1% blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isotiazol-3-on och 2-metyl-2H 2Hisotiazol-3-on, blandning (3:1). Flaska 2A är märkt: Fara H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Kan orsaka allergisk hudreaktion. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 5. Flaska 2B, Pepsin Diluent (10x), innehåller 50-<75% propan-2-ol, and 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Flaske 2B är märkt: Fara H225 H319 H336 P280 P210 P241 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Orsakar allvarlig ögonirritation. Kan göra att man blir dåsig eller omtöcknad. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker elektrisk utrustning, P04094SE_03/K p. 5/26

6 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 ventilationsutrustning, belysningsutrustning och materialhanteringsutrustning. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 6. Flaska 4, Stringent tvättbuffert (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% 2- amino-2-(hydroximetyl)propan-1, 3-diolhydroklorid. Flaska 4 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 7. Flaska 6, Wash Buffer (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% trometamol. Flaska 6 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 8. Artikelt 7, Coverslip Sealant, innehåller 100 % nafta (petroleum), vätebehandlad lätt, och är märkt: Fara H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Kan vara dödligt vid förtäring om det kommer ner i luftvägarna. Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker el-, ventilations-, belysnings- och materialhanteringsutrustning. Undvik utsläpp till miljön. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla P04094SE_03/K p. 6/26

7 P235 P501 nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 9. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (SDS). 10. Vävnadsfixeringsmetoder och provtjocklekar som är annorlunda än de specificerade kan påverka vävnadsmorfologi och/eller signalintensitet. 11. Andra inkuberingstider och temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge dåliga resultat. 12. Reagenset har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i dåliga prestanda. 13. Endast rena färgningskärl ska användas för pepsinnedsänkningsmetoden (steg 2, metod C). P04094SE_03/K p. 7/26

8 Förvaring Förvaras i mörker vid 2 8 C. Alternativt kan allt reagens förvaras i frys. Pepsin (flaska 2A) kan påverkas negativt om det utsätts för värme. Lämna inte denna komponent i rumstemperatur. Fluorescence Mounting Medium (flaska 5) kan påverkas negativt om det utsätts för höga ljusnivåer. Förvara inte denna komponent i ljus. Använd inte kitet efter det utgångsdatum som anges på förpackningen. Användaren måste kontrollera reagensprestanda (1) om reagensets förvaringsförhållanden avviker från vad som specificerats. Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normal vävnad som tidigare fungerat väl med FISH som kontroll av analyskörningen. Kontakta DakoCytomation Technical Services om ett oväntat fluorescensmönster observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara något problem med Histology FISH Accessory kit. Provberedning Prover från biopsier, excisioner eller resektioner måste hanteras så att vävnaden bevaras för FISH-analys. Följ den rekommenderade metoden för vävnadsbearbetning för immuncytokemisk färgning som beskrivs nedan. Ytterligare information finns på sidan (2). Användning av vävnad som exponerats för sur avkalkning för FISH rekommenderas inte (3 6). EDTA som avkalkningsmedel har rapporterats bevara DNA bättre (6) för (F)ISH (3, 4, 7) tekniker. OBS! Prestanda för Dako Histology FISH Accessory har inte validerats på avkalkad vävnad. Paraffininbäddade snitt Endast vävnad som konserverats i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddats lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis blockeras till en tjocklek på 3 4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Vävnaderna dehydreras sedan i en graderad serie av etanol och xylen, följt av infiltrering med smält paraffin vid högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader har en obegränsad hållbarhet före snittning och montering på objektglas om de förvaras korrekt (15-25 C) (2, 8). Andra fixativ är inte lämpliga. Förlängd fixeringstid kan förlänga den inkuberingstid som krävs i nedbrytningssteget med Pepsin. Vävnadsprover ska skäras i snitt på 2 6 µm, insamlas på objektglas från ett vattenbad och sedan lufttorkas. Den optimala tjockleken på vävnadssnitt är 2 3 µm och passar väl för Dako Split Signal FISH-prober. Snitt på 4 6 µm kan användas för andra FISH-tillämpningar. Paraffinet ska smältas vid 60 C i minuter. Snitten ska sedan kylas ned till rumstemperatur (20 25 C) och förvaras vid 2 8 C. Vi rekommenderar att vävnadssnitten monteras på Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-llysin-belagda Superfrost Plus-objektglas. I allmänhet ska prover analyseras inom 6 månader efter snittning med förvaring vid 2 8 C. Om vävnadssnitt förvaras under andra förhållanden än de som specificeras måste dessa förhållanden verifieras av användaren. P04094SE_03/K p. 8/26

9 BRUKSANVISNING A. Reagensberedning Följande reagens bereds lämpligen före färgning: A.1 Pre-Treatment Solution Kristaller kan förekomma i flaska 1, men de löses upp vid rumstemperatur. Kontrollera att inga kristaller finns innan reagenset prepareras. Späd en tillräcklig mängd från flaska 1 (Förbehandlingslösning 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda lösningen om den är grumlig. A.2 Stringent Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd från flaska 4 (Stringent Wash Buffer 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.3 Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd från flaska 6 (Wash Buffer 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.4 Etanolserier Bered tre kärl med 70, 85 och 96 % etanol från en lösning med 96 % etanol. Förvara täckta kärl vid rumstemperatur eller vid 2 8 C och använd lösningarna för högst 200 objektglas. Kassera lösningarna om de ser grumliga ut. A.5 Pepsinlösning En pepsinlösning behövs endast när pepsinnedsänkningsmetoden (B.3.a. och B.3.b, steg 2 metod C) används. Preparera pepsinlösning enligt följande: För en behållare för sex objektglas ska 60 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 48 ml rumstempererat (20 25 C) destillerat eller avjoniserat vatten till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) till behållaren. Sätt på locket på behållaren och stabilisera pepsinlösningen till 37 (±2) C i ett vattenbad. För en behållare för 24 objektglas ska 240 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 192 ml rumstempererat (20 25 C) destillerat eller avjoniserat vatten till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) till behållaren. Sätt på locket på behållaren och stabilisera pepsinlösningen till 37 (±2) C i ett vattenbad. Pepsinlösning som antagit rumstemperatur bör användas inom 5 timmar. P04094SE_03/K p. 9/26

10 B. Färgningsprocedur B.1 Proceduranteckningar Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Försiktighetsåtgärder). Om kitkomponenterna förvaras frysta rekommenderar vi att reagens överförs till 2 8 C dagen innan analysen utförs för att ge korrekt temperaturjämvikt. Allt reagens ska anta jämvikt vid lämplig temperatur före användning. Flaska 1: Den spädda Pre-Treatment Solution ska nå jämvikt vid C om vattenbad används (avsnitt B.3.a eller B.3.b färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod A). Om mikrovågsugn med avkänningskapacitet används för förbehandling (avsnitt B.3.a. eller B.3.b). Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod B) ska spädd Pre- Treatment Solution nå jämvikt vid rumstemperatur C. Flaska 2A: Pepsin ska appliceras vid 2 8 C (avsnitt B.3.a. eller B.3.b. Färgningsprotokoll, steg 2: metod A och B) och alltid hållas kallt. Flaska 2B: Pepsin Diluent (10x) ska appliceras vid 2 8 C (avsnitt B.3.a. eller B.3.b. Färgningsprotokoll, steg 2: Metod C) Flaska 4: Ett kärl med spädd Stringent Wash Buffer ska anta jämvikt vid rumstemperatur och ett annat kärl ska anta jämvikt vid 63 (±2) C (avsnitt B.3.a.) eller 65 (±2) C (avsnitt B.3.b), före användning. Flaska 5: Fluorescence Mounting Medium kan appliceras vid vilken temperatur som helst från 2 25 C. Flaska 6: Spädd Wash Buffer ska anta jämvikt vid rumstemperatur (20 25 C). Artikel 7: Coverslip Sealant kan appliceras vid rumstemperatur (20 25 C). Alla steg måste utföras vid den angivna temperaturen. Proceduren inkluderar dehydreringar följda av torkning av prover. Se till att proverna är fullständigt torra innan nästa steg påbörjas. Låt inte proverna torka under de andra procedurstegen. Om färgningsproceduren måste avbrytas kan objektglasen förvaras i Wash Buffer efter avparaffineringssteget i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C). B.2 Behandling av vävnader före färgning Avparaffinering och rehydrering: Innan proceduren utförs måste vävnadsobjektglasen avparaffineras för att avlägsna parrafin och rehydreras. Se till att paraffinet är fullständigt avlägsnat. Resterande paraffin orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i 96 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i 70 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Skaka av överskottsvätska och placera objektglasen i spädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2) i minst 2 minuter. Påbörja färgningsproceduren så som beskrivs i avsnitt B.3 a. eller B.3.b, steg 1, Förbehandling. Färska xylen- och alkohollösningar bör beredas efter att 200 objektglas har bearbetats. Xylensubstitut kan användas. P04094SE_03/K p. 10/26

11 OBS! Reagenset och anvisningarna som medföljer har utformats för att ge optimala prestanda. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra resultaten ogiltiga. Valfri mognad av prover: Före avparaffinering och rehydrering inkuberar du objektglas vid 60 C i t.ex. 1 timme på ett värmeblock, ett block i en hybridiseringsugn eller Dako Hybridizer. Alternativt kan du inkubera objektglasen vid 37 C i 1 2 dagar följt av 1 timme vid 60 C. Fortsätt med avparaffinering och rehydrering. OBS! Detta steg är valfritt. Detta steg kan minska möjligt bakgrundsbrus. B.3 Färgningsprotokoll Följ en av de två varianterna av färgningsprotokoll, B.3.a eller B3.b. Byt inte ut stegen mellan de två procedurerna: Färgningsprotokoll B.3.a beskriver halvdagsproceduren som ska användas för FISH-prober utspädda i etylenkarbonat-baserad buffertlösning för hybridisering. Färgningsprotokoll B.3.b beskriver 2 dagars-proceduren som ska användas för FISH-prober utspädda i konventionell formamidbaserad buffertlösning för hybridisering. B.3.a.Färgningsprotokoll för FISH-prober spädda i etylenkarbonatbaserad buffertlösning för hybridisering Steg 1: Förbehandling (mikrovågsugn, vattenbad, Pascal) Förbehandling kan utföras antingen med vattenbad enligt metod A) eller med mikrovågsugn med avkänningskapacitet enligt metod B) eller med Pascal-tryckkokare enligt metod C). Metod A: Förbehandling med vattenbad Fyll färgningskärl, t.ex. Coplin-kärl, med spädd Pre-Treatment Solution (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärl med utspädd Pre-Treatment Solution i vattenbad. Hetta upp vattenbadet och Pre-Treatment Solution till C. Mät temperaturen inuti kärlet med en kalibrerad termometer så att du säkert får rätt temperatur. Täck skålarna med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda förbehandlingslösningen i färgningskärlen. Kontrollera temperaturen igen och inkubera i 10 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Ta av locket och låt glasen svalna i Pre- Treatment Solution i 15 minuter vid rumstemperatur. Flytta över glasen till ett kärl med utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.3), i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. OBS! Pre-Treatment Solution är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Metod B: Förbehandling med mikrovågsugn med avkänningskapacitet (rekommenderas) Fyll ett plastkärl med spädd, rumstempererad (20 25 C) Pre-Treatment Solution. Sänk ned de avparaffinerade snitten i Pre-Treatment Solution, täck över kärlet med ett punkterat lock och placera det i mikrovågsugnen. Välj koksensorfunktionen och ett program som kör i 10 minuter efter att kokpunkten har uppnåtts*. Efter 10 minuters inkubering tar du ut kärlet med objektglas ur ugnen, tar bort locket och låter det svalna i 15 minuter i rumstemperatur. Flytta över objektglasen till ett kärl med spädd Wash Buffer och låt dem ligga i blöt i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. P04094SE_03/K p. 11/26

12 * Användning av en mikrovågsugn med avkänningskapacitet betyder att ugnen måste ha en sensor och program som initialt värmer upp Pre-Treatment Solution till kokpunkten och sedan bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) medan nedräkning sker av den förinställda tiden (10 (±1) minuter). Vissa mikrovågsugnar med avkänningskapacitet har kanske inte möjligheten att fritt ställa in nedräkningstid. Om modellen bara har förinställda program ska du se till att välja ett program som bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) under minst 10 (±1) minuter och manuellt stoppa programmet efter 10 (±1) minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Metod C: Förbehandling med Pascal-tryckkammare Häll 500 ml avjoniserat vatten i Pascal-kärlet. Fyll en plastskål med 250 ml Pre-Treatment Solution. Sänk ned de avparaffinerade snitten i Pre-Treatment Solution och placera skålen inuti Pascal-kärlet. Inkubera vid 121 C i 1 minut. Släpp trycket efter kylning till 90 C. Läs Pascalhandboken noggrant för information om korrekt hantering av Pascal-tryckkammare. Ta bort behållaren efter att trycket har evakuerats. Ta av locken och låt glasen svalna i Pre-Treatment Solution i ytterligare 15 minuter i rumstemperatur. Överför objektglasen till ett kärl med spädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Blötlägg snitten vid rumstemperatur i 3 minuter. Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till Steg 2. OBS! Pre-Treatment Solution är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Använd inte en tillsluten, lufttät behållare när du utför förbehandling i en mikrovågsugn eftersom trycket inuti behållaren kommer att öka och kan explodera eller orsaka skada vid öppning. Det är möjligt att använda en objektglashållare av metall om metallhållaren nedsänks i förbehandlingslösningen under hela mikrovågsbehandlingen. Använd inte metall i mikrovågsugnen i några andra fall. Följ anvisningarna från mikrovågsugnens tillverkare. Undvik fortsatt kokning av Pre-Treatment Solution under 10 minuters-inkuberingen. Utför regelbunden temperaturkontroll med hjälp av en kalibrerad termometer för att verifiera korrekta temperaturförhållanden. Steg 2: Pepsin, bruksfärdigt (RTU) eller pepsinlösning Pepsininkubering kan utföras genom direkt applicering av bruksfärdiga pepsindroppar på objektglasen, antingen vid rumstemperatur (20 25 C) (metod A) eller vid 37 C (metod B). Alternativt kan objektglasen doppas i en pepsinlösning och inkuberas vid 37 (±2) C (Metod C). Metod A och metod B: Slå bort överskottsbuffert. Torka noggrant runt provet med hjälp av en luddfri duk (t.ex. ett absorberande papper eller gasväv) för att avlägsna kvarvarande vätska och för att hålla reagenset inom det föreskrivna området. Tillsätt 5 8 droppar (250 µl) kall (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) för att täcka provet. Förvara alltid Pepsin vid 2 8 C. Metod A: Pepsin, bruksfärdigt Inkubering vid C Inkubera i 5-15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). En inkuberingstid på 5 15 minuter är tillräcklig för de flesta prover, men den optimala inkuberingstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort Pepsinet och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Metod B: Pepsin, bruksfärdigt Inkubering vid 37 C Placera provet med Pepsin på ett värmeblock vid 37 C t.ex. Dako Hybridizer och inkubera i 3-5 minuter. En inkuberingstid på 3-5 minuter är tillräcklig för de flesta prover, men den optimala inkuberingstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödigt Pepsin och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer-lösning i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. P04094SE_03/K p. 12/26

13 Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Metod C: Pepsinlösning - Nedsänkning av objektglas i 37 C pepsinlösning Kitet innehåller reagens som är tillräckligt för fyra olika körningar (60 ml pepsinlösning, liten behållare för sex objektglas) eller för en körning (240 ml pepsinlösning, stor behållare för 24 objektglas). Preparera pepsinlösningen enligt vad som beskrivs i avsnitt A.5. Sätt på locket på behållaren och stabilisera pepsinlösningen till 37 (±2) C i ett vattenbad. Kontrollera att temperaturen har stabiliserat sig. Mät temperaturen inuti kärlet med en kalibrerad termometer för att garantera korrekt temperatur. Slå bort överflödig Wash Buffer. Doppa ner objektsglasen i den 37 (±2) C varma pepsinlösningen och inkubera i minuter. En inkuberingstid på minuter är tillräcklig för de flesta prover, men den optimala inkuberingstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödig pepsinlösning och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Steg 3: FISH-prob utspädd i etylenkarbonatbaserad buffertlösning för hybridisering (som tillhandahålls av användaren) OBS! FISH-probmixer i en spädd etylenkarbonbaserad buffertlösning för hybridisering som måste lagras vid en temperatur av -18 C mellan användningstillfällena. Lagring vid -18 C resulterar i en separation av buffertlösningen i två faser. Innan den används ska du se till att den består av endast en fas genom att jämna ut probmixen till rumstemperatur (20 25 C) och sedan blanda till den. Tina upp FISH-probmixen i rumstemperatur (20 25 C) i max. 30 minuter (skyddas mot starkt ljus), låt sedan flaskan rotera ordentligt i en vortexblandare i 15 sekunder i rpm. Använd en lämplig mängd av probmix, t.ex. 10 µl till mitt på vävnadssnittet. Placera omedelbart ett 22 mm x 22 mm täckglas över probmixen och låt den sprida sig jämnt under täckglaset. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor, försök att varsamt få bort dem från vävnaden med hjälp av en pincett. Försegla täckglaset med Coverslip Sealant genom att klämma ut förseglingen runt täckglasets kanter. Låt täckglasförseglingen överlappa täckglas och objektglas så att en försegling bildas runt täckglaset. Se till att Coverslip Sealant täcker alla kanter på täckglaset. Preparera Dako Hybridizer* (kod S2450 eller S2451) för en hybridiseringskörning. Se till att Humidity Control Strips (kod S2452) är mättade och optimala att använda. Starta hybridiseraren och välj ett program som: Denaturerar vid 66 C i 10 minuter följt av hybridisering vid 45 C i minuter. Placera objektglasen i hybridiseraren och se till att locket är ordentligt stängt och starta programmet. Mer information finns i bruksanvisningen för Dako Hybridizer. * Instrument som tillåter förhållanden som liknar de som beskrivs ovan kan användas för denaturering och hybridisering: Placera objektglasen på en plan metall- eller stenyta (värmeblock eller ett block i en hybridiseringsugn) som är föruppvärmd till 66 (±1) C. Denaturera i exakt 10 minuter. Placera glasen i en föruppvärmd fuktad hybridiseringskammare. Täck över kammaren med ett lock och inkubera i 45 (±2) C i minuter. P04094SE_03/K p. 13/26

14 Steg 4: Stringenttvätt Fyll två färgningskärl, t.ex. Coplin-kärl, med utspädd Stringent Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, Avsnitt A.2). En minsta volym på 100 ml eller 15 ml per objektglas i varje kärl rekommenderas. Placera en av färgningsskålarna med utspädd Stringent Wash Buffer vid rumstemperatur i ett dragskåp och den andra i ett vattenbad. Hetta upp vattenbadet och den utspädda Stringent Wash Buffer till 63 (±2) C. Kontrollera att temperaturen har stabiliserat sig. Täck kärlet med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Mät temperaturen inuti vattenbadets kärl med en kalibrerad termometer för att vara säker på att temperaturen är korrekt. Stringent Wash Buffer innehåller rengöringsmedel och kan bli grumlig vid 63 C; detta påverkar inte resultatet. Använd pincett eller handskar och ta ut objektglasen ur hybridiseringskammaren, ta försiktigt bort Coverslip Sealant och täckglaset och placera glasen i det rumstempererade förtvättskärlet, ett i taget. Så snart som alla täckglas har avlägsnats ska objektglasen överföras från det rumstempererade förtvättkärlet till kärlet med 63 (±2) C i vattenbadet. Omedelbart efter att objektglasen överförts till den 63 (±2) C utspädda Stringent Wash Buffer i vattenbadet, ska timern startas. Utför stringenttvätt i exakt 10 minuter. Ta bort objektglasen från den utspädda Stringent Wash Buffer och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten torka helt. Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI (flaska 5) till objektglasets målområde och lägg på ett täckglas. OBS! Glasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om objektsglasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara objektglasen i mörker vid C för att minimera blekning. B.3.b. Färgningsprotokoll för FISH-prober spädda i formamidbaserad buffertlösning för hybridisering DAG 1 Steg 1: Förbehandling (mikrovågsugn, vattenbad, Pascal) Förbehandling kan utföras antingen med vattenbad enligt metod A) eller med mikrovågsugn med avkänningskapacitet enligt metod B) eller med Pascal-tryckkammare enligt metod C). Metod A: Förbehandling med vattenbad Fyll ett färgningskärl med utspädd Pre-Treatment Solution (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärl med utspädd Pre-Treatment Solution i vattenbad. Hetta upp vattenbadet och Pre-Treatment Solution till C. Mät temperaturen inuti kärlet med en kalibrerad termometer så att du säkert får rätt temperatur. Täck kärlen med lock (inga hål) för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de avparaffinerade snitten i den föruppvärmda Pre-Treatment Solution. Kontrollera temperaturen igen, stäng vattenbadets lock inkubera i 10 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Ta bort locket (ta inte bort objektglasen). Låt objektglasen kylas ned i Pre-Treatment Solution i 15 minuter vid rumstemperatur. Överför objektglasen till ett kärl med spädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2) i 3 minuter vid rumstemperatur. P04094SE_03/K p. 14/26

15 Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till Steg 2. Metod B: Förbehandling med mikrovågsugn med avkänningskapacitet (rekommenderas) Fyll en behållare med spädd Pre-Treatment Solution vid rumstemperatur (20 25 C). Sänk ned de avparaffinerade snitten i lösningen och stäng locket. Locket måste ha hål för att trycket ska kunna lätta. Placera behållaren med objektglas i mikrovågsugnen och hetta upp. Före uppvärmning måste du se till att utsidan av behållaren och mikrovågsugnens insida är torra. Inkubera precis under kokpunkten (inte mindre än 95 C) i 10 minuter. Ta bort locket efter inkuberingen (ta inte bort objektglasen). Låt objektglasen svalna i Pre-Treatment Solution i 15 minuter vid rumstemperatur (20-25 C). Objektglasen måste vara täckta med buffert under hela förbehandlingsproceduren. Överför objektglasen till ett kärl med spädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2) i 3 minuter vid rumstemperatur. Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till Steg 2. Metod C: Förbehandling med Pascal-tryckkammare Häll 500 ml avjoniserat vatten i Pascal-kärlet. Fyll ett plastkärl med 250 ml Pre-Treatment Solution. Sänk ned de avparaffinerade snitten i Pre-Treatment Solution och placera kärlet inuti Pascal-kärlet. Inkubera vid 121 C i 1 minut. Släpp trycket efter kylning till 90 C. Läs Pascalhandboken noggrant för information om korrekt hantering av Pascal-tryckkammare. Ta bort behållaren efter att trycket har evakuerats. Ta av locken och låt glasen svalna i Pre-Treatment Solution i ytterligare 15 minuter i rumstemperatur. Överför objektglasen till ett kärl med spädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Blötlägg snitten vid rumstemperatur i 3 minuter. Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till Steg 2. OBS! Pre-Treatment Solution är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Använd inte en tillsluten, lufttät behållare när du utför förbehandling i en mikrovågsugn eftersom trycket inuti behållaren kommer att öka och kan explodera eller orsaka skada vid öppning. Det är möjligt att använda en objektglashållare av metall om metallhållaren nedsänks i förbehandlingslösningen under hela mikrovågsbehandlingen. Använd inte metall i mikrovågsugnen i några andra fall. Följ anvisningarna från mikrovågsugnens tillverkare. Undvik fortsatt kokning av Pre-Treatment Solution under 10 minuters-inkuberingen. Utför regelbunden temperaturkontroll med hjälp av en kalibrerad termometer för att verifiera korrekta temperaturförhållanden. Steg 2: Pepsin, bruksfärdigt (RTU) eller pepsinlösning Pepsininkubering kan utföras genom direkt applicering av bruksfärdiga pepsindroppar på objektglasen, antingen vid rumstemperatur (20 25 C) (metod A) eller vid 37 C (metod B). Alternativt kan objektglasen sänkas ned i en pepsinlösning och inkuberas vid 37 (±2) C (metod C) Metod A och metod B: Slå bort överskottsbuffert. Torka noggrant runt provet med hjälp av en luddfri duk (t.ex. ett absorberande papper eller gasväv) för att avlägsna kvarvarande vätska och för att hålla reagenset inom det nödvändiga området. Applicera 5 8 droppar (250 µl) kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2) och se till att provet täcks. Förvara alltid Pepsin vid 2 8 C. Metod A: Pepsin, bruksfärdigt Inkubering vid C Inkubera i 5 50 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). En inkuberingstid på minuter vid rumstemperatur är tillräckligt för de flesta prover, men användaren bör bestämma optimal inkuberingstid. Slå bort Pepsinet och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till steg 3, FISH-prob eller se Bilaga 2 för optimering av nedbrytningstid (valfritt). Metod B: Pepsin, bruksfärdigt Inkubering vid 37 C P04094SE_03/K p. 15/26

16 Placera prover med pepsin vid 37 C på Dako Hybridizer eller på ett föruppvärmt värmeblock. Inkubera i 2 6 minuter vid 37 C. Detta är tillräckligt för de flesta prover som beretts enligt beskrivningen i avsnittet Provberedning. Optimal inkuberingstid beror på vävnadstyp, vävnadsfixering, provtjocklek, provmognad och bör bestämmas av användaren. Dessa faktorer kan öka den nedbrytningstid som krävs till 7 15 min eller högre. Förstagångsanvändare bör identifiera den optimala nedbrytningstiden genom att testa en representativ vävnad i 1, 3, 6, 12 och 18 minuter. Slå bort Pepsinet och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till steg 3, FISH-prob eller se Bilaga 2 för optimering av nedbrytningstid (valfritt). Metod C: Pepsinlösning - Nedsänkning av objektglas i 37 C pepsinlösning Kitet innehåller tillräckligt med reagens för fyra separata körningar (60 ml pepsinlösning, liten behållare för sex objektglas) eller en enda körning (240 ml pepsinlösning, stor behållare för 24 objektglas). Preparera pepsinlösningen enligt vad som beskrivs i avsnitt A.5. Sätt på locket på behållaren och stabilisera pepsinlösningen till 37 (±2) C i ett vattenbad. Kontrollera att temperaturen har stabiliserat sig. Mät temperaturen inuti kärlet med en kalibrerad termometer för att garantera korrekt temperatur. Slå bort överflödig Wash Buffer. Doppa ner objektsglasen i den 37 (±2) C varma pepsinlösningen och inkubera i minuter. En inkuberingstid på minuter är tillräcklig för de flesta prover, men den optimala inkuberingstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödig pepsinlösning och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till steg 3, FISH-prob eller se Bilaga 2 för optimering av nedbrytningstid (valfritt). OBS! Vi rekommenderar att proceduren i avsnittet Provberedning följs. Vävnad som inte har brutits ned tillräckligt kan resultera i brist på signal eller endast otydliga signaler, ofta med en hög nivå av grön cytosolisk bakgrund Steg 3: FISH-prob (tillhandahålls av användaren) OBS! Om reagens från Dako Histology FISH Accessory Kit (kod K5799) används med reagens från kod K5731 ska anvisningarna på produktbladet för kod K5731 följas. Följande steg ska utföras i ett dragskåp. Fluorokrom-märkta prober kan påverkas negativt om de exponeras för höga ljusnivåer. Utför inte resterande delen av proceduren i starkt ljus, såsom direkt solljus. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.4). Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Applicera en lämplig mängd fluorokrom-märkt prob, t.ex. 10 µl av en Dako FISH-prob, till mitten av vävnadssnittet. Placera omedelbart ett 18 mm x 18 mm (eller 22 mm x 22 mm) täckglas över proben och låt den spridas jämnt under täckglaset. Undvik luftbubblor. Om luftbubblor upptäcks, knacka försiktigt bort dem med en pincett. Försegla täckglaset genom att lägga Coverslip Sealant runt täckglasets kant. Låt täckglasförseglingen överlappa täckglas och objektglas så att en försegling bildas runt täckglaset. Se till att Coverslip Sealant förseglar hela täckglasets kant. Placera objektglas i Dako Hybridizer (kod S2450/S2451) och ställ in denatureringen på 82 C i 5 min och hybridisering på 45 C över natten (14 20 tim) vid användning av Dako FISH-prober. Fortsätt till Dag 2, Steg 4, stringenttvätt. Se handboken för Hybridizer för ytterligare information. OBS! Alternativt kan ett värmeblock, en hybridiseringsugn och hybridiseringskammare användas. Placera objektglaset på en plan metall- eller stenyta (värmeblock eller på ett block i en hybridiseringsugn) föruppvärmd till 82 (±2) C. Denaturera i 5 minuter och kontrollera att temperaturen hos blocket inte sjunker under 80 C. P04094SE_03/K p. 16/26

17 Placera glasen i en föruppvärmd fuktad hybridiseringskammare. Täck kammaren med lock och inkubera över natten (14 20 timmar) vid 45 (±2) C när Dako FISH-prober används. DAG 2 Steg 4: Stringenttvätt Fyll två färgningskärl med utspädd Stringent Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, Avsnitt A.2). En minsta volym på 100 ml spädd Stringent Wash Buffer krävs för 1 6 objektglas i ett kärl. För fler än 6 objektglas ska minst 15 ml buffert per objektglas användas. Placera en av färgningsskålarna med utspädd Stringent Wash Buffer vid rumstemperatur i ett dragskåp och den andra i ett vattenbad. Hetta upp vattenbadet och den utspädda Stringent Wash Buffer till 65 (±2) C. Kontrollera att temperaturen har stabiliserat sig. Täck kärlet med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Mät temperaturen på insidan av kärlet med en kalibrerad termometer för att garantera korrekt temperatur. Ta objektglasen från hybridiseringskammaren. Ta försiktigt bort Coverslip Sealant och täckglaset med en pincett och överför objektglasen till det rumstempererade förtvättade kärlet. Så snart som alla täckglas har avlägsnats ska objektglasen överföras från det rumstempererade förtvättskärlet till kärlet vid 65 (±2) C i vattenbadet. Stäng kärlets lock och sedan vattenbadets lock. Utför stringenstvätt i exakt 10 minuter vid 65 (±2) C. Ta bort glasen från den utspädda Stringent Wash Buffer och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.4). Låt objektglasen lufttorka fullständigt. Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium (flaska 5), med blå fluorescenskontrastfärg, på målområdet på objektglaset och lägg på ett täckglas (t.ex. 24 mm x 50 mm eller 24 mm x 60 mm). Låt mediet fördelas jämn över provet. OBS! Glasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Blekning inträffar om objektglasen exponeras för ljus eller höga temperaturer. Objektglasen förvaras i mörker vid C. Kvalitetskontroll 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. 2. Normal vävnad som tidigare fungerat med FISH bör användas för kontroll av analyskörningen. 3. Normala vävnadsceller bör ha klart synliga fluorescenssignaler som visar att FISH-prober har lyckats hybridiseras till målregionerna. 4. Misslyckad detektion av signaler i normala vävnadsceller tyder på analysfel och resultaten ska anses som ogiltiga. 5. På grund av vävnadssnittning kommer vissa normala celler att ha mindre än det förväntade antalet signaler. 6. Nukleär morfologi måste vara intakt och homogent färgat vid utvärdering med ett DAPI-filter. Ett stort antal spökliknande celler, donut-celler och en i allmänhet dålig kärnmorfologi tyder på för mycket nedbrytning eller denaturering av provet, vilket kan resultera i förlust av signalfragment. Perifer färgning, hål i celler (DAPI-filter) och/eller kraftig grön cytosolisk bakgrundsfärgning vid observation med ett Texas Red/FITC-dubbelfilter kan tyda på för lite nedbrytning, vilket kan resultera i förlust av signaler. Sådana prover ska anses ogiltiga. 7. Skillnader i vävnadsfixering, behandling, och inbäddning i användarens laboratorium kan producera variabilitet i resultaten som gör regelbunden utvärdering av egna kontroller nödvändiga. P04094SE_03/K p. 17/26

18 Tolkning av resultat Granska flera cellområden för att redovisa möjlig heterogenitet. Välj ett område med god fördelning av kärnor. Börja analysen i den övre vänstra kvadranten av det valda området, svep från vänster till höger och räkna antalet signaler inom kärngränsen för varje utvärderad kärna i enlighet med riktlinjerna nedan. Fokusera uppåt och nedåt för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna. Kärnor utan signal ska inte tilldelas något värde. Tag inte med kärnor som kräver subjektiv bedömning. Hoppa över kärnor med svag signalintensitet och icke-specifik eller hög bakgrundsfärgning. Användaren måste bestämma antalet kärnor som ska räknas för varje prob. Undvik områden där de nukleära gränserna är tvetydiga. Begränsningar 1. Den optimala inkuberingstiden för nedbrytning av pepsin kan bero på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste bestämmas och verifieras av användaren. 2. För den avsedda användningen av FISH-proben, se produktbladet för den enskilda FISHproben för motsvarande produktinformation. 3. FISH är en process i flera steg som kräver specialistutbildning för val av lämpliga reagens, val av vävnader, fixering och bearbetning, beredning av FISH-objektglaset samt tolkning av färgningsresultaten. 4. FISH-resultat är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan påverka probhybridiseringen. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 5. För optimala och reproducerbara resultat måste vävnadsobjektglasen fullständigt avparaffineras. Avlägsnandet av paraffin måste utföras i början av färgningsprocessen. (Se bruksanvisningen, avsnitt B.2.) 6. Endast temperaturkalibraterat vattenbad, värmeblock och hybridiseringsugn får användas. Användning av andra typer av utrustning kan medföra avdunstning av probmix under hybridiseringen och måste valideras av användaren. P04094SE_03/K p. 18/26

19 Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 1a. Felaktig nedbrytningstid. 1a. Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används. En förlängning av nedbrytningstiden, t.ex minuter vid 37 C kan hjälpa. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b, steg 2, Felsökning punkt 4d, 4e och Bilaga 2. 1b. Kitet har utsatts för höga temperaturer under transport eller förvaring. 1c. Inkorrekta förbehandlingsförhållanden 1d. Inkorrekta denatureringsförhållanden. 1e. Inkorrekt hybridiseringstemperatur. 1f. Probbufferten avdunstade under hybridiseringen. 1b. Kontrollera förvaringsförhållandena. Kontrollera att kolsyreis fanns närvarande när leveransen togs emot. Kontrollera att flaskorna 2A och 5 har förvarats vid 2-8 C och att flaska 5 har förvarats i mörker. 1c. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. Kontrollera dessutom att inkuberingstiden för nedbrytning har optimerats vid behov, se avsnitt B.3.a eller B.3.b, steg 2. Ju närmare förbehandlingstemperaturen är kokpunkten, desto starkare signaler. Se till att pepsinet hanteras vid korrekt temperatur. Se avsnitt B.1. 1d. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för denaturering har använts. 1e. Hybridisera vid 45 (±2) C när Dako FISH-prober används. 1f. Se till att det är tillräckligt fuktigt i hybridiseringskammaren. Använd Dako Hybridizer (kod S2450/S2451) och Hybridizer Humidity Control Strips (kod S2452). Använd Coverslip Sealant. Se Felsökning punkt 5a och 5b. P04094SE_03/K p. 19/26

20 1g. Inkorrekta förhållanden vid stringenttvätt. 1h. Mikroskopet fungerar inte korrekt - olämpligt filter insatt - olämplig lampa - kvicksilverlampan för gammal - utbrända filter - smutsiga och/eller spruckna kollektorlinser - olämplig immersionsolja 1g. Kontrollera att rekommenderad volym, temperatur och tid för stringenttvätt används och att täckglasen tas bort innan stringenttvätt utförs. 1h. Kontrollera mikroskopet och se till att de använda filtren är lämpliga till de använda fluorokromerna, att de inte är utslitna och att kvicksilverlampan är lämplig och inte har använts för lång tid (se Bilaga 1). Använd lämplig immersionsolja för fluorescens. Kontakta mikroskopförsäljaren vid tveksamhet. 1i. Bleka signaler. 1i. Undvik för lång mikroskopundersökning och minimera exponering för starka ljuskällor. 2. Områden utan signal 2a. För liten probvolym 2a. Se till att probvolymen är tillräckligt stor för att täcka området under täckglaset. 2b. Luftbubblor instängda under probapplicering eller montering. 2b. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor, knacka försiktigt bort dem med en pincett 2c. Dålig avparaffinering. 2c. Se till att paraffin har avlägsnats helt från snitten. Se avsnitt B För mycket bakgrundsfärgning 3a. Felaktig nedbrytningstid. Kraftig grön cytosolisk bakgrund kan tyda på för lite nedbrytning. 3a. Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används. En förlängning av nedbrytningstiden, t.ex minuter vid 37 C kan hjälpa. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b. Steg 2, Felsökning punkt 4e och Bilaga 2. 3b. Snitten har torkat i B.3. 3b. Följ anvisningarna och undvik att objektglasen torkar, om inte annat anges. 3c. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt. 3c. Följ de avparaffinerings- och rehydreringsprocedurer som beskrivs i avsnitt B.2 P04094SE_03/K p. 20/26

21 4. Dålig kärnmorfologi eller svag kärnfärgning 3d. För låg temperatur vid stringenttvätt 3e. Långvarig exponering av hybridiserat snitt för starkt ljus 3f. Utgångna objektglas eller olämpliga objektglas kan orsaka för mycket röd utspridd färgning. 3g. Icke-fluorescerande immersionsolja har blandats med Fluorescence Mounting Medium. 4a. Inkorrekta förbehandlingsvillkor kan resultera i oklart eller grumligt utseende 4b. För lång behandling med Pepsin löser upp vävnaden och resulterar i brist på signaler. 3d. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen vid stringenstvätt används. 3e. Undvik för lång mikroskopundersökning och minimera exponering för starkt ljus. 3f. Använd rekommenderade objektglastyper och se till att de inte är utgångna. Se avsnittet Paraffininbäddade snitt. 3g. Använd stora täckglas vid montering, enligt vad som rekommenderas. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b, steg 5. Detta förhindrar att immersionsoljan blandas med monteringsmedium och undviker autofluorescens och oavsiktligt avlägsnande av täckglas med mikroskopobjektivet. 4a. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. Se även Felsökning punkt 4b e. 4b. Undvik kokning. Se avsnitt B.3, steg 1. Se även Felsökning punkt 4d. 4c. Inkorrekt Pepsinbehandling 4c. Följ de rekommenderade inkuberingstiderna för Pepsin. Se avsnitt B.3 steg 2 och Bilaga 2. Se även Felsökning punkt 1a, 1c 3a, 4d och 4e. 4d. För lång behandling med Pepsin kommer att lösa upp vävnaden och resultera i brist på signaler. För mycket nedbrytning kan göra att spökceller, "donut"-liknande celler och kärnor med en allmänt dålig kärnmorfologi visas. 4d. Förkorta inkuberingstiden för Pepsin. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b, steg 2 och Bilaga 2. Kontrollera att snittjockleken är 2 6 µm. Se även Felsökning punkt 1a, 1c, 4b och 4e. P04094SE_03/K p. 21/26

22 5. Täckglas häftar för mycket fast vid objektglas efter hybridisering och är svåra att ta bort. 6. Hög nivå av grön fluorescens på objektglaset, inklusive områden utan FFPE-vävnad 4e. För kort behandling med Pepsin kan resultera i brist på signaler. För lite nedbrytning kan orsaka kärnorperifer kärnfärgning, hål i kärnor (DAPI-filter); kraftig grön bakgrundsfärgning i cytosol (Texas Red/FITC dubbelfilter). Observera att kärnor i vävnad som brutits ned för lite har en fin morfologi jämfört med vävnad som brutits ned för mycket. 4f. För hög denatureringstemperatur 4g. Inkorrekta hybridiseringsförhållanden. 5a. Täckglas har monterats på objektglaset på felaktigt sätt. 5b. Inkorrekta hybridiseringsförhållanden. Kan orsaka minskade signaler eller förlust av signaler, vävnadsskada och bakgrundsfärgning. 6. Användning av utgångna eller ej rekommenderade objektglas 4e. Förläng Pepsininkuberingstiden till t.ex. 2-3 gånger den använda nedbrytningstiden. Se även Felsökning punkt 1a, 1c, 3a, 4a och 4d. 4f. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen för denaturering används. 4g. Se Felsökning punkt 1f och 5b. 5a. Tvinga inte bort täckglaset om det sitter hårt fast på objektglaset. Sänk ned objektglaset i kärlet med spädd Stringent Wash Buffer vid rumstemperatur i 5 minuter och ta sedan bort täckglaset. Följ rekommendationerna för montering av täckglas i avsnitt B.3a eller B.3.b, steg 3. Se även Felsökning punkt 1f och 5b. 5b. Se till att det är tillräckligt fuktigt i hybridiseringskammaren. Använd Dako Hybridizer (kod S2450/S2451) och Hybridizer Humidity Control Strips (kod S2452). Följ anvisningarna i produktbladet för Hybridizer Humidity Control Strips.. Se rekommenderade hybridiseringsförhållanden i avsnitt B.3.a eller B.3.b, steg 3. Se även Felsökning punkt 1f och 5a. 6. Säkerställ att det belagda objektglaset (Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-l-lysinbelagda objektglas) inte har gått ut. OBS! Om problemet inte kan härröras till någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna korrigeringsåtgärden inte löser problemet kontaktar du Dakos serviceavdelning för vidare assistans. P04094SE_03/K p. 22/26

23 Bilaga 1 Histology FISH Accessory Kit, kod K5799 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar följande utrustning för användning med Histology FISH Accessory kit när Dako FISH-prober används: 1. Mikroskoptyp Epifluorescensmikroskop. 2. Lampa 100 watt kvicksilverlampa (ska i allmänhet bytas ut efter 200 timmar) 3. Objektiv För screening av vävnaden kan fluorescens torr 10X eller fluorescens oljeimmersion 16X objektiv användas. För högre förstoring och räkning av signaler rekommenderas endast fluorescens oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 63x eller 100x. 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI-filter i kombination med ett högkvalitativt Texas Red/FITC-dubbelfilter när Dako FISH-prober används. DAPI-filter Texas Red/FITC-dubbelfilter Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse. Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är mycket viktigt för tolkningen. Ytterligare detaljerad information kan fås från mikroskoptillverkaren eller Dakos representant eller Dakos webbsida. 5. Olja Icke-fluorescerande immersionsolja. Försiktighetsåtgärder Specifika fluorokromer kräver olika utrustningar. För Dako FISH-prober rekommenderas inte en 50 watt kvicksilverlampa, rodaminfilter kan inte användas och trippelfilter rekommenderas i allmänhet inte. Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunder bör kontrollera och följa tillverkarens rekommendationer för hur kvicksilverlampan och mikroskopet ska underhållas. Man ska sträva efter att exponera provet så lite som möjligt för excitationsljuset för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar inställning av det specifika mikroskopet med tillverkaren innan in situ-fluorescenshybridisering påbörjas eller att du konsulterar relevant referenslitteratur. P04094SE_03/K p. 23/26

24 Bilaga 2 Valfritt steg för optimering av nedbrytningstid för Pepsin Detta valfria steg kan användas för att utvärdera effekten av nedbrytning med pepsin och för att hjälpa till att optimera den nedbrytningstid som används i steg 2, Pepsin. För att kontrollera om den använda nedbrytningstiden med pepsin är tillräcklig, färgar du det tvättade pepsin-nedbrutna vävnadssnittet med 10 µl propidiumjodid (400 ng/ml) som tillhandahålls av användaren. Placera ett 22 mm x 22 mm täckglas över propidiumjodid och låt det fördelas jämnt under täckglaset. Inkubera i en minut. Använd ett fluorescensmikroskop med Texas Red/FITC-dubbelfilter (se Bilaga 1) för att utvärdera den röda färgningen av kärnor med propidiumjodid. Om vävnadsnedbrytningen är godtagbar bör det finnas röda kärnor med väldefinierade gränser. Avlägsna propidiumjodid genom att låta snitten ligga i spädd Wash Buffer två gånger i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C) och fortsätt till avsnitt B3, Färgningsprotokoll, steg 3, FISH-prob. Om kärnorna fortfarande är gröna av autofluorescens och inte färgade röda av propidiumjodid är det nödvändigt att upprepa nedbrytningscykeln: Lägg snitten i spädd Wash Buffer två gånger i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C) för att avlägsna propidiumjodid. Tillsätt 5-8 droppar (250 µl) kall (2-8 C) Pepsin (flaska 2) för att täcka provet. Förvara alltid pepsinflaskan vid 2 8 C. Placera objektglasen vid 37 C på ett föruppvärmt värmeblock eller på Dako Hybridizer. Inkubera i 10 minuter om ingen eller litet nedbrytning har förekommit. Tiden på 10 minuter är endast en riktlinje. Användaren bör bestämma den optimala tiden. Blötlägg igen i spädd Wash Buffer två gånger i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C) för att avlägsna pepsin. Applicera 10 µl propidiumjodid (400 ng/ml) en gång till i 1 minut. Utvärdera färgningen och lägg snitten i spädd Wash Buffer två gånger i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Upprepa cykeln om nödvändigt eller fortsätt till avsnitt B.3.a eller B.3.b, Färgningsprotokoll, steg 3, FISH-prob. OBS! Kitet innehåller reagens som räcker till 20 tester. Användning av Wash Buffer och Pepsin i detta valfria steg kommer att minska det totala antalet möjliga tester med satsen. P04094SE_03/K p. 24/26

25 Referenser 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; P04094SE_03/K p. 25/26

26 Förklaring av symboler Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod In vitro diagnostisk medicinsk apparat Läs instruktionema för användning Får ej förvaras i direkt solljus (se avsnittet Förvaringsförhållanden) Innehållet räcker till <n> tester Använd före Tillverkare Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Revision Tillverkad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel. +33 (42) DK-2600 Glostrup Fax Danmark P04094SE_03/K p. 26/26