HER2 IQFISH pharmdx Kod K5731

Transkript

1 HER2 IQFISH pharmdx Kod K5731 3:a utgåvan HER2 IQFISH pharmdx är en direkt fluorescerande in situ hybridiseringsanalys (FISH) för kvantitativ bestämning av HER2-genens amplifiering i formalinfixerad, paraffininbäddad bröstcancervävnadsprover och FFPE-prover från patienter med adenocarcinom i magen eller gastroesofageala förbindelsen. Analysen indikeras som ett hjälpmedel till HercepTest vid utvärdering av patienter för vilka Herceptin -behandling övervägs. Kitet innehåller reagens som räcker till 20 tester. ( ) P04090SE_01_K / s. 1/60

2 Innehållsförteckning Sida Avsedd användning... 4 Sammanfattning och förklaring - Bröst... 5 Procedurprincip - Bröst... 5 Reagenser - Bröst... 5 Medföljande material... 5 Material som behövs, men inte ingår... 7 Försiktighetsåtgärder - Bröst... 7 Förvaring - Bröst Provförberedning - Bröst Paraffininbäddade snitt INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Bröst A. Reagenspreparation - Bröst A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Etanolserier A.5 Pepsin solution B. Färgningsprocedur - Bröst B.1 Procedurnoteringar B.2 Behandling av vävnader före färgning B.3 Färgningsprotokoll Kvalitetskontroll - Bröst Tolkning av färgning - Bröst Begränsningar - Bröst Prestandaegenskaper - Bröst Analytisk sensitivitet Analytisk specificitet Härdighetsstudier Repeterbarhet Reproducerbarhet Klinisk användbarhet Felsökning - Bröst Bilaga 1 - Bröst Bilaga 2 - Bröst Bilaga 3 - Bröst Sammanfattning och förklaring - Mage ( ) P04090SE_01_K / s. 2/60

3 Procedurprincip - Mage Reagenser - Mage Medföljande material Material som behövs, men inte ingår Mikroskoputrustning med tillbehör Försiktighetsåtgärder - Mage Förvaring - Mage Provförberedning - Mage Paraffininbäddade snitt BRUKSANVISNING - Mage A. Reagenspreparation - Mage A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Etanolserier A.5 Pepsinlösning B. Färgningsprocedur - Mage B.1 Proceduranteckningar B.2 Behandling av vävnader före färgning B.3 Färgningsprotokoll Kvalitetskontroll - Mage Färgningstolkning - Mage Begränsningar - Mage Prestandaegenskaper - Mage Analytisk sensitivitet Analytisk specificitet Härdighetsstudier Repeterbarhet Reproducerbarhet Klinisk användbarhet Felsökning - Mage Bilaga 4 - Mage Bilaga 5 - Mage Bilaga 6 - Mage Bilaga 7 - Mage Referenser Symbolförklaring ( ) P04090SE_01_K / s. 3/60

4 Avsedd användning För diagnostisk användning in vitro. HER2 IQFISH pharmdx är en direkt fluorescerande in situ hybridiseringsanalys (FISH) som utformats för att kvantitativt bestämma HER2 -genens amplifiering i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadsprover med bröstcancer och FFPE-prover från patienter med adenocarcinom i magen inklusive gastroesofageala förbindelsen. HER2 IQFISH pharmdx indikeras i samband med HercepTest vid bedömningen av patienter för vilka Herceptin -(trastuzumab) behandling övervägs (se produktbladet för Herceptin ). För bröstcancerpatienter är resultat från HER2 IQFISH pharmdx avsedda för användning som tillägg till den kliniska patologiska informationen som för närvarande används för uppskattning av prognosen i stadium II, nodpositiva bröstcancerpatienter. Adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, kallas även magcancer i detta dokument. För bröstcancerapplicering, se sid För magcancerapplikation, se sid Viktigt: Observera skillnaderna för bröstcancervävnad och magcancervävnad, speciellt i avsnitten Tolkning av färgning ( ) P04090SE_01_K / s. 4/60

5 Bröstcancer Sammanfattning och förklaring - Bröst Den humana HER2-genen (även kallad ERBB2 eller NEU) finns på kromosom 17 och kodar HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet är en membran tyrosinkinasreceptor med homologi till den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genen är närvarande i 2 kopior i alla normala diploida celler. Hos en del patienter med bröstcancer är HER2-genen amplifierad som del av den maligna omvandlingsprocessen och tumörprogressionen (3-8) HER2-genamplifiering leder i allmänhet till överexpression av HER2-proteinet på ytan av bröstcancerceller (9). Amplifiering av HER2-genen och/eller överexpression av dess protein har påvisats i % av bröstcancrar. Denna uppreglering associeras med dålig prognos, ökad risk för återfall och förkortad överlevnad. Flera undersökningar har visat att HER2-status korrelerar med känslighet eller resistens mot vissa kemoterapibehandlingar (10). Påvisande av hög överexpression av HER2-protein eller HER2-genamplifiering är väsentligt för initiering av behandling med Herceptin, en monoklonal antikropp mot HER2-protein. Kliniska prövningar har visat att patienter vars tumörer har hög överexpression av HER2-protein och/eller amplifiering av HER2-genen, har störst nytta av Herceptin (11). Procedurprincip - Bröst HER2 IQFISH pharmdx innehåller alla viktiga reagenser som behövs för att fullborda en FISHprocedur för formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. Efter avparaffinering och rehydrering, värms prover upp i Pre-Treatment Solution följt av proteolytisk nedbrytning med pepsin. Efter upphettning och de proteolytiska förbehandlingsstegen, utnyttjar detta kit en icke toxisk, bruksfärdig IQISH probmix, baserad på en kombination av PNA (peptidnukleinsyra) (12) och DNA-teknik. Denna Probe Mix består av en blandning av Texas Redmärkta DNA-prober som täcker en 218 kb region i vilken HER2-genen på kromosom 17 ingår, och en blandning av fluoresceinmärkta PNA-prober riktade mot den centromeriska regionen hos kromosom 17 (CEN-17). Den specifika hybridiseringen till de två målen resulterar i bildande av en distinkt röd fluorescerande signal vid varje HER2-genlokus och en distinkt grön fluorescerande signal vid varje kromosom 17-centromer. Efter en stringenttvätt monteras proverna med Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI och förses med täckglas. Med användning av ett fluorescensmikroskop försett med lämpliga filter (se Bilaga 3) lokaliseras tumörceller och räkning av röda (HER2) och gröna (CEN-17) signaler utförs. Därefter beräknas HER2/CEN-17-förhållandet. Normala celler i det analyserade vävnadssnittet tjänar som en intern positiv kontroll av förbehandling och hybridisering. Ytterligare information finns i avsnittet Tolkning av färgningen. För interaktiv e-utbildning, använd HER2 IQFISH pharmdx e-utbildningsprogrammet, som är utformat för att förse laboratorietekniker, patologer och forskare med noggrann och snabb kunskap om hur man uppnår optimala resultat med HER2 IQFISH pharmdx : Reagenser - Bröst Medföljande material Det material som anges nedan räcker till 20 tester (ett test definieras som ett 22 mm x 22 mm målområde). Antalet tester baseras på användning av 250 µl per objektglas av flaska 2A (5 8 droppar), 10 µl per objektglas av flaska 3, och 15 µl per objektglas av flaska 5. Lösningarna i flaska 3 och flaska 5 är viskösa och måste eventuellt centrifugeras kortvarig i en mikrocentrifug för att samla in all tillhandahållen reagens. Kitet tillhandahåller material som räcker till 10 individuella färgningskörningar (fyra separata körningar, vid användning av pepsinnedsänkningsmetoden). HER2 IQFISH pharmdx levereras på kolsyreis. För att garantera att kitets komponenter inte har utsatts för hög temperatur ( ) P04090SE_01_K / s. 5/60

6 Bröstcancer under transporten bör kolsyreisen fortfarande finnas kvar vid leveransen. Observera att vissa kitkomponenter kan fortsätta vara ofrysta. Detta påverkar inte prestandan hos HER2 IQFISH pharmdx. Flaska 1 Flaska 2A Flaska 2B Flaska 3 Flaska 4 Förbehandlingslösning (20x) 150 ml, koncentrerad 20x MES- (2-[N-morfolino]etansulfonsyra) buffert. Pepsin 4 x 6,0 ml, bruksfärdigt Pepsinlösning, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Pepsin-spädningsmedel (10x) 24 ml, koncentrerad 10x Spädningsmedelbuffert, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. HER2/CEN-17 IQISH probmix 0,2 ml, bruksfärdig Blandning av Texas Red-märkta HER2 DNA-prober och fluoresceinmärkta CEN-17 PNA-prober, tillhandahålls i IQISH hybridiseringsbuffert. Stringenttvättbuffert (20x) 150 ml, koncentrerad 20x SSC- (saltlösning-natriumcitrat) buffert med tvättmedel (Tween-20). Flaska 5 Flaska 6 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml, bruksfärdig Fluorescerande monteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, koncentrerad 20x Tris/HCl-buffert. Coverslip Sealant 1 rör, bruksfärdigt Lösning för borttagbar försegling av täckglas. OBS! Följande kitreagenser: Pre-Treatment Solution (20x), Pepsin, Pepsin Diluent (10x), Stringent Wash Buffer (20x), Fluorescence Mounting Medium, Wash Buffer (20x) och motsvarande Coverslip Sealant, kan bytas mot motsvarande reagenser i Dako Histology FISH-tillbehörskitet, kod K5799. ( ) P04090SE_01_K / s. 6/60

7 Bröstcancer Material som behövs, men inte ingår Laboratoriereagenser Destillerat eller avjoniserat vatten Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitut Laboratorieutrustning Absorberande pappersdukar Justerbara pipetter Kalibrerad partiell immersionstermometer (område C) Kalibrerad yttermometer (område C) Täckglas (22 mm x 22 mm) Pincett Dragskåp Dako Hybridizer (kod S2450 eller S2451)* Värmeblock eller hybridisering* Fuktig hybridiseringskammare* Mikrocentrifug Objektglas, Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-l-lysin-belagda objektglas (se Provpreparation) Färgningskyvetter eller -bad Timer (med 2 15 minuters intervaller) Vortexblandare Vattenbad med lock (som kan hålla 37(±2) C, 63 (±2 ) C och från 95 C till 99 C) Mikrovågsugn med avkänningskapacitet om förbehandling utförs med mikrovågsugn (se B3. Färgningsprotokoll. Steg 1: Förbehandling, metod B) * Värmeblock eller hybridiseringsugn för denaturering (66 (±1) C) och hybridisering (45 (±2) C) till sammans med en fukthybridiseringskammare kan användas som ett alternativ till Dako Hybridizer. Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI och FITC/Texas Red dubbelfilter, eller FITC och Texas Red monofilter - se Bilaga 3 för ytterligare information. Fluorescensmikroskop med 100 watt kvicksilverlampa som ljuskälla bör användas. Inga andra ljuskällor rekommenderas med dessa filter. Mikroskopglasfolder (kartongbricka med gångjärnsförsett lock och plats för 20 objektglas eller liknande). Försiktighetsåtgärder - Bröst 1. För diagnostisk användning in vitro. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Etiketter angående risker/faror krävs inte för flaskan 1. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 4. Flaska 2A, Pepsin, innehåller 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A och <0.1% blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isotiazol-3-on och 2-metyl-2H 2Hisotiazol-3-on, blandning (3:1). Flaska 2A är märkt: ( ) P04090SE_01_K / s. 7/60

8 Bröstcancer Fara H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Kan orsaka allergisk hudreaktion. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 5. Flaska 2B, Pepsin Diluent (10x) innehåller 50-<75% propan-2-ol och 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Flaske 2B är märkt: Fara H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Orsakar allvarlig ögonirritation. Kan göra att man blir dåsig eller omtöcknad. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker elektrisk utrustning, ventilationsutrustning, belysningsutrustning och materialhanteringsutrustning. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 6. Flaska 3, HER2/CEN-17 IQISH probmix, innehåller 10-<25% etylenkarbonat och 3-<5% natriumklorid. Flaske 3 är märkt: Varning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i ( ) P04090SE_01_K / s. 8/60

9 Bröstcancer flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 7. Flaska 4, Stringent tvättbuffert (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% 2- amino-2-(hydroximetyl)propan-1, 3-diolhydroklorid. Flaska 4 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 8. Flaska 6, Wash Buffer (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% trometamol. Flaska 6 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 9. Artikelt 7, Coverslip Sealant, innehåller 100 % nafta (petroleum), vätebehandlad lätt, och är märkt: Fara H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Kan vara dödligt vid förtäring om det kommer ner i luftvägarna. Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker el-, ventilations-, belysnings- och materialhanteringsutrustning. Undvik utsläpp till miljön. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 10. Prover, före och efter fixering och alla material som exponerats för dessa, bör hanteras som potentiellt smittbärande och kasseras med lämpliga försiktighetsåtgärder (16). Pipettera ( ) P04090SE_01_K / s. 9/60

10 Bröstcancer aldrig reagenser med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagenser och prover. Om reagenser kommer i kontakt med känsliga områden ska dessa sköljas med stora mängder vatten. 11. Minimera mikrobiell kontamination av reagenser för att undvika felaktiga resultat. 12. Andra inkubationstider och temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. 13. Vävnadsfixeringsmetoder och provtjocklekar som är annorlunda än de specificerade kan påverka vävnadsmorfologi och/eller signalintensitet. 14. Undvik avdunstning av HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix under hybridisering genom att tillförsäkra tillräcklig fuktighet i hybridiseringskammaren. 15. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan innebära resultatförlust. 16. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (SDS). 17. Endast rena färgningskyvetter bör användas för pepsinnedsänkningsmetoden (steg 2, metod C). Förvaring - Bröst Förvara HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (flaska 3) vid -18 C i mör ker. Alla andra reagenser kan förvaras vid 2 8 C i mörker. Alla reagenser kan fr ysas. Frysning och upptining av reagenserna upp till 10 gånger påverkar inte resultatet. Pepsin, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, och Fluorescence Mounting Medium (flaska 2, 3 och 5) kan påverkas negativt om de utsätts för värme. Lämna inte dessa komponenter i rumstemperatur. HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix och Fluorescence Mounting Medium (flaska 3 och 5) kan påverkas negativt om de utsätts för alltför höga belysningsnivåer. Förvara inte dessa komponenter och utför inte analysen i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. Använd inte kitet efter det utgångsdatum som är tryckt på kitets kartong. Om reagenserna förvaras under andra förhållanden än de som specificerats i detta produktblad måste användaren validera reagensresultaten (14). Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet för denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normala celler i det analyserade vävnadssnittet. Kontakta Dakos tekniska service om ett oväntat fluorescerande mönster observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och något problem med HER2 IQFISH pharmdx misstänks. Provförberedning - Bröst Prover från biopsier, excisioner eller resektioner måste hanteras så att vävnaden bevaras för FISH-analys. Standardmetoder för vävnadsbehandling för immuncytokemisk färgning bör användas för alla prover (15). Paraffininbäddade snitt Endast vävnad som konserverats i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddats lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis blockeras till en tjocklek på 3 4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Vävnaderna dehydreras sedan i en graderad serie etanoloch xylenbad, följt av infiltrering av smält paraffin som inte är varmare än högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader håller för evigt innan de snittas och monteras på objektglas om de förvaras på sval plats (15 25 C) (15-16). Andra fixativ är inte lämpliga. Vävnadsprover ska snittas i 4 6 µm tjocka snitt. Objektglasen som krävs för HER2 genamplifieringsanalys och verifikation av tumörens närvaro ska prepareras samtidigt. Minst 2 seriella snitt rekommenderas, 1 snitt för tumörnärvaro färgat med hematoxylin och eosin (H&E-färgning) och 1 snitt för HER2 genamplifieringsanalys. Vi rekommenderar att vävnadssnitten monteras på Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-llysin-belagda objektglas. Prover ska analyseras inom 4 6 månader efter snittning när de förvaras i rumstemperatur (20 25 C). ( ) P04090SE_01_K / s. 10/60

11 Bröstcancer ( ) P04090SE_01_K / s. 11/60

12 Bröstcancer INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Bröst A. Reagenspreparation - Bröst Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: A.1 Pre-Treatment Solution Kristaller kan förekomma i flaska 1, men de löses upp vid rumstemperatur. Kontrollera att inga kristaller finns innan reagenset prepareras. Späd en tillräcklig mängd från flaska 1 (Förbehandlingslösning 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda lösningen o m den är grumlig. A.2 Stringent Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd från flaska 4 (Stringent tvättbuffert 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.3 Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd från flaska 6 (Wash Buffer 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.4 Etanolserier Preparera tre burkar med 70 %, 85 % respektive 96 % etanol från 96 % etanollösning. Förvara täckta burkar vid rumstemperatur eller vid 2 8 C o ch använd lösningarna för högst 200 objektglas. Kassera lösningarna om de ser grumliga ut. A.5 Pepsin solution En pepsinlösning behövs endast när pepsinnedsänkningsmetoden (metod C) används. Preparera pepsinlösning enligt följande: För en behållare för sex objektglas ska 60 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 48 ml rumstempererat (20 25 C) eller avjo niserat vatten till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsinspädningsmedel ( 10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) til l behållaren. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. För en behållare för 24 objektglas ska 240 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 192 ml rumstempererat (20 25 C) eller avj oniserat vatten till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) Pepsinspädningsmedel (10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) ti ll behållaren. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. Pepsinlösning som antagit rumstemperatur bör användas inom 5 timmar. ( ) P04090SE_01_K / s. 12/60

13 Bröstcancer B. Färgningsprocedur - Bröst B.1 Procedurnoteringar Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser bör anta jämvikt vid relevant temperatur före användning enligt följande: Flaska 1: Den spädda förbehandlingslösningen ska anta jämvikt vid C om vattenbad används för förbehandling (B3. Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod A). Om mikrovågsugn med avkänningskapacitet används för förbehandling (B3. Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod B) den utspädda förbehandlingslösningen bör få anta jämvikt vid rumstemperatur C. Flaska 2A: Pepsin bör appliceras vid 2 8 C (B3, färgningsprotokoll, steg 2: metod A och B) och alltid hållas kallt. Flaska 2B: Pepsinspädningsmedel (10X) bör appliceras vid 2 8 C (B3, färgningsprotokoll, steg 2: Metod C). Flaska 3: HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix separeras i 2 faser medan den förvaras vid -18 C. Före användning av flaska 3 måste du säkerställa att endast en fas är närvarande genom att låta probmixen anta jämvikt till rumstemperatur (20 25 C ) följt av blandning. Tina flaska 3 vid rumstemperatur (20 25 C) i högst 30 minuter (skydd a från starkt ljus), virvla sedan flaskan grundligt i 15 sekunder vid r/min med användning av en vortexblandare. Förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Flaska 4: Utspädd Stringent Wash Buffer; en burk ska nå jämvikt vid rumstemperatur, en annan burk ska anta jämvikt vid 63 (±2) C före användning. Flaska 5: Fluorescence Mounting Medium kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2 25 C. Flaska 6: Den spädda Wash Buffer ska anta jämvikt vid rumstemperatur C. Coverslip Sealant kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2 25 C. Alla steg måste utföras vid den angivna temperaturen. Proceduren inkluderar ett antal dehydreringar följt av torkning av vävnadssnitten. Se till att vävnadssnitten är helt torra innan du går vidare till nästa steg. Låt inte vävnadssnitten torka under de övriga procedurstegen. Om färgningsproceduren måste avbrytas kan glasen förvaras i tvättbuffert efter avparaffineringssteget i upp till en timma vid rumstemperatur (20 25 C) utan att resultatet påverkas. B.2 Behandling av vävnader före färgning Avparaffinering och rehydrering: Innan analysen utförs måste objektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Se till att paraffinet är fullständigt avlägsnat. Resterande inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i 96 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i 70 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Slå bort överskottsvätska och placera glasen i utspädd tvättbuffert (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i minst 2 minuter. Påbörja färgningsproceduren så som beskrivs i avsnitt B.3, steg 1, Förbehandling. Xylen och alkohollösningarna ska bytas efter högst 200 objektglas. Xylensubstitut kan användas. ( ) P04090SE_01_K / s. 13/60

14 Bröstcancer OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer detta kit har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra resultaten ogiltiga. B.3 Färgningsprotokoll Steg 1: Förbehandling Förbehandling kan utföras antingen med vattenbad enligt metod A eller med mikrovågsugn med avkänningskapacitet enligt metod B. Metod A: Förbehandling med vattenbad Fyll färgningskärl, t.ex. Coplin-kärl, med den spädda förbehandlingslösningen (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärl med utspädd förbehandlingslösning i vattenbad. Hetta upp vattenbadet och Pre-Treatment Solution till C. Mät temperaturen inuti skålen med en kalibre rad termometer så att du säkert får rätt temperatur. Täck skålarna med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda förbehandlingslösningen i färgningsskålarna. Kontrollera temperaturen igen och inkubera i 10 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Ta av locket och låt glasen svalna i förbehandlingslösning i 15 minuter vid rumstemperatur. Flytta över glasen till en skål med utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Metod B: Förbehandling med mikrovågsugn med avkänningskapacitet Fyll en plastskål med spädd Pre-Treatment Solution vid rumstemperatur (20 25 C). Sänk ned de avparaffinerade snitten i förbehandlingslösning, täck över skålen med ett punkterat lock och placera den i mikrovågsugnen. Välj koksensorfunktionen och ett program som kör i 10 minuter efter att kokpunkten har uppnåtts*. Efter 10 minuters inkubation ska du ta ut skålen med objektglas ur ugnen, ta bort locket och låta den svalna i 15 minuter vid rumstemperatur. Flytta över objektglasen till en skål med spädd Wash Buffer och låt dem ligga i blöt i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. * Användning av en mikrovågsugn med avkänningskapacitet betyder att ugnen måste ha en sensor och program som initialt värmer upp Pre-Treatment Solution till kokpunkten och sedan bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) medan nedräkning sker av den förinställda tiden (10 (±1) minuter). Vissa mikrovågsugnar med avkänningskapacitet har eventuellt inte möjligheten att fritt ställa in nedräkningstid. Om modellen endast har förinställda program ska du se till att välja ett program som bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) under minst 10 (±1) minuter och manuellt stoppa programmet efter 10 (±1) minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Pepsin, bruksfärdigt (RTU) eller pepsinlösning Pepsininkubation kan utföras genom direkt applicering av bruksfärdiga pepsindroppar på objektglasen, antingen vid rumstemperatur (20 25 C) (metod A) eller vid 37 C (metod B). Alternativt kan objektglasen sänkas ned i en pepsinlösning och inkuberas vid 37 (±2) C (metod C). ( ) P04090SE_01_K / s. 14/60

15 Bröstcancer Metod A och metod B: Slå bort överskottsbuffert. Använd en luddfri duk (såsom en absorberande duk eller gasbinda) och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all återstående vätska och för att hålla reagenserna inom det föreskrivna området. Tillsätt 5 8 droppar (250 µl) kallt (2 8 C) pepsin (flaska 2A) för att täcka provet. Förvara alltid Pepsin vid 2 8 C. Metod A: pepsin, RTU - Inkubation vid C Inkubera i 5 15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 5 minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort Pepsinet och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Metod B: Pepsin, RTU - Inkubation vid 37 C Placera provet med Pepsin på ett värmeblock vid 37 C - t.ex. Dako Hybridizer - och inkubera i 3 5 minuter. En inkubationstid på 3 minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödigt pepsin och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Metod C: Pepsinlösning - Nedsänkning av objektglas i 37 C pepsinlösning Kitet innehåller tillräckligt med reagenser för fyra separata körningar (60 ml pepsinlösning, liten behållare för sex objektglas) eller en enda körning (240 ml pepsinlösning, stor behållare för 24 objektglas). Preparera pepsinlösningen enligt vad som beskrivs i avsnitt A.5. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. Kontrollera att temperaturen har stabiliserats. Mät temperaturen på insidan av behållaren med en kalibrerad termometer för att garantera korrekt temperatur. Slå bort överflödig tvättbuffert. Sänk ned objektglasen i 37 (±2) C pepsinlösning och inkubera i minuter. En inkubationstid på minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödigt pepsin och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Steg 3: HER2/CEN-17 IQISH probmix HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix separeras i 2 faser medan den förvaras vid -18 C. Före användning av flaska 3 måste du säkerställa att endast en fas är närvarande genom att låta probmixen anta jämvikt till rumstemperatur (20 25 C) följt av blandning. Tina flaska 3 vid rumstemperatur (20 25 C) i högst 30 minuter (skydd a från starkt ljus), virvla sedan flaskan grundligt i 15 sekunder vid r/min med användning av en vortexblandare. Förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Applicera 1 0 µl HER2/CEN-17 IQISH probmix (flaska 3) ( ) P04090SE_01_K / s. 15/60

16 Bröstcancer till mitten av vävnadssnittet. Placera omedelbart ett 22 mm x 22 mm täckglas över probmixen och låt det sprida sig jämnt under täckglaset. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor ska du försiktigt knacka bort dem från vävnaden med en pincett. Kom ihåg att förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. ( ) P04090SE_01_K / s. 16/60

17 Bröstcancer Försegla täckglaset med täckglasförsegling genom att klämma ut förseglingen runt täckglasets kanter. Låt täckglasförseglingen överlappa täckglas och objektglas så att en försegling bildas runt täckglaset. Se till att täckglasförsegling täcker alla kanterna på täckglaset. Preparera Dako Hybridizer* (kod S2450 eller S2451) för en hybridiseringskörning. Se till att Humidity Control Strips (kod S2452) är mättade och optimala att använda. Starta Hybridizer och välj ett program som: Denaturerar vid 66 C i 10 minuter följt av hybridi sering vid 45 C i minuter. Placera objektglasen i Dako Hybridizer, se till att locket är ordentligt stängt och starta programmet. Se användarhandboken till Dako Hybridizer för ytterligare information. * Instrument som tillåter förhållanden som är identiska med de som beskrivs ovan kan användas för denaturering och hybridisering: Placera objektglasen på en plan metall- eller stenyta (värmeblock eller ett block i en hybridiseringsugn) som är förvärmd till 66 (±1) C. Denaturera i exakt 10 minuter. Placera glasen i en föruppvärmd fuktad hybridiseringskammare. Täck kammaren med ett lock och inkubera vid 45 (±2) C i minuter. Observera att en hybri diseringstemperatur på 37 C inte är lämplig för användning med proberna i detta kit. Steg 4: Stringenttvätt Fyll två färgningsskålar, t.ex. Coplin-burkar, med utspädd stringent tvättbuffert (se BRUKSANVISNING, Avsnitt A.2). En minsta volym på 100 ml eller 15 ml per objektglas i varje skål rekommenderas. Placera en av färgningsskålarna med utspädd stringent tvättbuffert vid rumstemperatur i ett dragskåp och den andra i ett vattenbad. Hetta upp vattenbadet och den utspädda Stringent Wash Buffer till 63 (±2) C. Kontrollera att temperature n har stabiliserat sig. Täck skålen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Mät temperaturen inuti vattenbadets skål med en kalibrerad termometer för att vara säker på att temperaturen är korrekt. Stringent Wash Buffer innehåller tvättmedel och kan bli grumlig vid 63 C ; detta påverkar inte resultatet. Använd pincett eller handskar och ta ut objektglasen ur hybridiseringskammaren, ta försiktigt bort täckglasförsegling och täckglaset och placera glasen i den rumstempererade skålen med stringent tvättbuffert, ett i taget. Så snart som alla täckglas har avlägsnats ska objektglasen överföras från det rumstempererade för-tvättkärlet till kärlet vid 63 (±2) C i vatten badet. Timern bör startas omedelbart efter att objektglasen överförts till behållaren på 63 (±2) C med utspädd Stringent Wash Buffer i vattenbad. Utför stringent tvätt i exakt 10 minuter. Ta bort glasen från den utspädda Stringent Wash Buffer och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten torka helt. Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI (flaska 5) till objektglasets målområde och lägg på ett täckglas. OBS! Objektglasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om objektglasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara glasen i mörker vid C för att minimera blekning. ( ) P04090SE_01_K / s. 17/60

18 Bröstcancer Kvalitetskontroll - Bröst 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. 2. Normala celler gör att man kan göra en intern kontroll av färgningskörningen. Normala celler ska ha 1 2 klart synliga gröna signaler som tecken på att CEN-17 PNAproben framgångsrikt har hybridiserats till den centromeriska regionen hos kromosom 17. Normala celler ska också ha 1 2 klart synliga röda signaler som tecken på att HER2 DNAproben framgångsrikt har hybridiserats till HER2-genamplifieringen. På grund av vävnadssnittningen kommer vissa normala celler ha färre än de förväntade 2 signalerna av varje färg. Om inga signaler detekteras i normala celler är det ett tecken på att analysen misslyckats och resultaten bör anses ogiltiga. 3. Nukleär morfologi måste vara intakt vid utvärdering med ett DAPI-filter. Många spökliknande celler och en allmänt dålig nukleär morfologi tyder på övernedbrytning av provet, vilket resulterar i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prover ska anses ogiltiga. 4. Skillnader i vävnadsfixering, behandling, och inbäddning i användarens laboratorium kan producera variabilitet i resultaten som gör regelbunden utvärdering av egna kontroller nödvändiga. Tolkning av färgning - Bröst Bedömningsbar vävnad Endast prover från patienter med invasiva karcinom bör testas. I fall med carcinoma in situ och invasivt karcinom i samma prov, ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Undvik nekrotiska områden och områden där de nukleära gränserna är tvetydiga. Tag inte med kärnor som kräver subjektiv bedömning. Hoppa över kärnor med svag signalintensitet och icke-specifik eller hög bakgrundsfärgning. Signalräkning: Lokalisera tumören inom det H&E-färgade objektglaset och utvärdera samma område på det FISH-färgade glaset. Undersök flera områden med tumörceller för att redovisa eventuell heterogenitet. Välj ett område med god fördelning av kärnor. Börja analysen i den övre vänstra kvadranten i det valda området och räkna antalet signaler inom kärngränserna för varje bedömd kärna enligt riktlinjerna nedan medan du skannar från vänster till höger (se även Bilaga 3). - Fokusera uppåt och nedåt för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna. - Räkna två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd som är lika med eller mindre än signalens diameter som endast en signal. - I kärnor med höga nivåer HER2-genamplifiering, kan HER2-signalerna ligga mycket nära varandra och bilda kluster av signaler. I dessa fall kan antalet HER2-signaler inte räknas utan måste uppskattas. Speciell uppmärksamhet måste ges åt de gröna signalerna eftersom kluster med HER2-signaler kan täcka de gröna signalerna och göra dem omöjliga att se. Vid tveksamhet ska du kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter. Poängsätt inte kärnor utan signaler eller signaler med endast en färg. Poängsätt endast de kärnor som har en eller flera FISH-signaler av varje färg. ( ) P04090SE_01_K / s. 18/60

19 Bröstcancer Signalräkningsguide 1 Räkna inte. Kärnorna överlappar, alla områden med kärnor syns inte 2 Två gröna signaler, räkna inte kärnor med signaler med endast en färg 3 Räkna som 3 gröna och 12 röda signaler (klusteruppskattning) 4 Räkna som 1 grön och 1 röd signal. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en. 5 Räkna inte (över- eller undernedbrutna kärnor). Eller Saknade signaler i mitten av kärnor (donut-formade kärnor). 6 Räkna som 2 gröna och 3 röda signaler. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en. 7 Räkna som 1 grön och 5 röda signaler 8 Räkna som 3 gröna (1 grön ej i fokus) och 3 röda signaler 9 Kluster med röda signaler som skymmer gröna signaler, kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITCfilter eller räkna inte Registrera antalen i en tabell såsom visas i Bilaga 2. Räkna 20 kärnor per vävnadsprov när så är möjligt från distinkta tumörområden(17). Beräkna HER2/CEN-17-förhållandet genom att dividera antalet röda HER2-signaler med det totala antalet gröna CEN-17-signaler. Prover med ett HER2/CEN-17-förhållande över eller lika med 2 bör anses HER2- genamplifierada (5, 17-19). Resultat vid eller nära tröskelvärdet (1,8 2,2) bör tolkas med försiktighet. Om förhållandet är ett gränsfall (1,8 2,2) ska du räkna ytterligare 20 kärnor och räkna om förhållandet för de 40 kärnorna. Vid tveksamhet bör provobjektglaset poängsättas på nytt. Vid gränsfall finns det anledning att låta patologen konsultera med den behandlande läkaren. ( ) P04090SE_01_K / s. 19/60

20 Bröstcancer Begränsningar - Bröst 1. FISH är en flerstegsprocess som kräver specialutbildning i val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, preparation av FISH-objektglaset och tolkning av färgningsresultaten. 2. FISH-resultat är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan påverka probhybridiseringen. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder eller på inneboende oregelbundenheter i vävnaden. 3. För optimala och reproducerbara resultat måste vävnadspreparat avparaffineras fullständigt. Paraffinborttagningen måste vara klar vid början av färgningsprocessen. (Se BRUKSANVISNING, avsnitt B.2). 4. Endast temperaturkalibrerat vattenbad, värmeblock, och hybridiseringsugn bör användas. Användning av andra typer av utrustning kan resultera i avdunstning av HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix under hybridiseringen och måste valideras av användaren. Prestandaegenskaper - Bröst Analytisk sensitivitet Känsligheten hos HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix undersöktes med hjälp av 18 adenokarcinomprover från normalt humant bröstepitel. Förhållandet mellan antalet HER2- signaler och CEN-17 signaler beräknades baserat på en räkning av 20 kärnor per prov. HER2/CEN-17-förhållandet för de 18 proverna av normalt humant bröstepitel var mellan 0,97 1,08. Analytisk specificitet HER2 -DNA proberna i HER2 /CEN-17 IQISH Probe Mix har ändsekvenserats och kartlagt för att bekräfta att de täcker totalt 218 kb inklusive HER2 -genen. CEN-17 PNA-proberna i HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix har testats individuellt och i kombination för att bekräfta deras specifika hybridisering till den centromeriska regionen hos kromosom 17. Studier utfördes på vävnadsprover av normalt humant bröstepitel med användning av flaska 3, innehållande hybridiseringsbufferten men utan probmixen, för att mäta analysens förmåga att ensam identifiera målsubstanserna HER2 och CEN-17 utan interferens från andra substanser. Totalt 18 prover utvärderades för närvaro av signaler som inte var relaterade till probmixen. Ingen detektion av andra kromosommål eller interferens med nära relaterade substanser observerades i några av de 18 proverna. Härdighetsstudier Härdigheten av HER2 IQFISH pharmdx -analysen testades genom att variera förbehandlingstid, temperatur och metoder för uppvärmning av förbehandlingsbuffert (mikrovågsugn eller vattenbad), pepsininkubationstid och metod (bruksfärdigt pepsin eller nedsänkning), denatureringstemperatur och tid, hybridiseringstid samt stringenttvättid och temperatur. Inga signifikanta skillnader i resultat observerades vid följande experimentella tillstånd: Förbehandlingsmetod A) Vattenbad i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 95 C, C samt 99 C, tillsamm ans med 9, 10 och 11 minuter vid C Förbehandlingsmetod B) Mikrovågsugn i 9, 10 och 11 minuter vid > 95 C. ( ) P04090SE_01_K / s. 20/60

21 Bröstcancer Pepsinnedbrytningsmetod A) med inkubationstider på 5, 10 och 15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Pepsinnedbrytningsmetod B) med inkubationstider på 3, 4 och 5 minuter vid 37 C). Pepsin nedbrytningsmetod C) med inkubationstider på 20, 25 och 30 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 35, 37 och 39 C. Denaturering i 10 minuter, kombinerat med var och en av temperaturerna 65, 66 och 67 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid 66 C. Hybridiseringstid på 60, 90 och 120 minuter vid 45 C. Stringenttvätt i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 61, 63 och 65 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid 63 C. Obs! I härdighetstesterna ändrades endast en parameter i färgningsproceduren åt gången medan alla andra parametrar behölls oförändrade. Vi rekommenderar att tiden och temperaturerna som anges i färgningsproceduren följs. Hybridisering i 60 minuter gav hög signalintensitet, men något minskad jämfört med hybridisering vid 90 och 120 minuter. Ingen signifikant skillnad i resultat observerades vid de andra tids-/ temperaturkombinationerna. Färgningsproceduren för HER2 IQFISH pharmdx erbjuder protokollvariabler för värmeförbehandling, pepsinnedbrytning samt hybridiseringstid. Varje unika kombinationsalternativ har validerats med hänsyn till HER2-genstatus. Validering utfördes på 10 FFPE humana bröstkarcinomprover för vart och ett av de 12 möjliga kombinationsalternativen. HER2 FISH pharmdx kit (K5331) användes som referens. HER2/CEN-17-förhållande för varje individuellt prov visas i Figur 1. Korstabuleringar mellan de 12 testerna och referensfärgningen visade total överensstämmelse i HER2- genstatus på 100 % (10/10) med undre och övre two-tailed 95-procentiga konfidensgränser vid 78,3 % respektive 100 %. Kappavärde var 1,00 och McNemars test visade frånvaro av ensidighet (two-tailed p-värde på 1,00). Figur 1. Individuella HER2/CEN-17-förhållanden för 10 humana bröstkarcinomprover, som färgats med användning av de 12 kombinationsprotokollvariationerna som är möjliga med HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) (Test 1 12) och HER2 FISH pharmdx kit (kod K5331) referens (R). Den vågräta linjen visar tröskelvärdet på 2,0. ( ) P04090SE_01_K / s. 21/60

22 Bröstcancer Repeterbarhet Repeterbarheten av HER2/CEN-17-förhållandet undersöktes med HER2 IQFISH pharmdx -analysen med användning av seriella snitt av nio humana bröstkarcinomprover med antingen icke amplifierad eller amplifierad HER2-genstatus. Tredubbla snitt av varje prov testades i samma körning. Den genomsnittliga variationskoefficienten var 5,2 % för icke amplifierade prover (intervall från 1 % till 8 %) och 14 % för amplifierade prover (intervall från 7 % till 20 %). Totalt fem på varandra följande snitt av humana bröstcancerprover med olika tjocklek (3, 4, 5, 6, och 7 µm) testades med HER2 IQFISH pharmdx. Den genomsnittliga variationskoefficienten av HER2/CEN-17-förhållandet var 7 % (intervall från 6 % till 9 %). Reproducerbarhet HER2 IQFISH pharmdx -analysen testades för reproducerbarhet mellan partier och mellan observatörer, med användning av tre partier med HER2 IQFISH pharmdx och tre observatörer. Reproducerbarhet testades på nio olika humana bröstkarcinomprover med antingen icke amplifierad eller amplifierad HER2-genstatus. Den genomsnittliga variationskoefficienten för reproducerbarhet mellan partier var 5 % för icke amplifierade prover (intervall från 2 % till 8 %) och 7,8 % för amplifierade prover (intervall från 5 % till 11 %). Den genomsnittliga variationskoefficienten för reproducerbarhet mellan observatörer var 3,2 % för icke amplifierade prover (intervall från 0,2 % till 6 %) och 2,8 % för amplifierade prover (intervall från 2 % till 4 %). Klinisk användbarhet Den kliniska allmännyttan av Dako HER2 FISH pharmdx kit undersöktes i en jämförande studie med Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Studien inkluderade 150 arkivprov från patienter som antingen hade nodpositiv eller nodnegativ grad II-III bröstcancer. Det primära målet med studien var att undersöka graden av överensstämmelse mellan HER2/kromosom 17 centromerförhållanden för de 150 proverna testade med Dako och Vysis kit, både beträffande den allmänna överensstämmelsen för förhållandena och beträffande överensstämmelsen för de dikotomiserade FISH-resultaten (+/- grupper). Totalt 145 prover hybridiserades framgångsrikt och poängsattes och kvalificerades därigenom för statistisk analys. En 2 x 2 korstabulering av resultaten visas i Tabell 1. Tabell 1. Dikotomiserade resultat från 145 bröstcancerprover testade med Dako HER2 FISH pharmdx kit och Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. 60 kärnor i varje prov bedömdes med vart och ett av de två kiten. Vysis kit (-) amplifierad Vysis kit (+) amplifierad Dako Kit (-) amplifierad Dako Kit (+) amplifierad Summa Summa Samstämmigheten mellan Dako och Vysis tester var 95 % med ett konfidensintervall på %. Kappavärdet var 0,89. McNemars test för systematisk benägenhet mellan de två testen var inte signifikant (p=0,22). Figur 2 visar en spridningsplot av de parade observationerna för de 145 proverna. ( ) P04090SE_01_K / s. 22/60

23 Bröstcancer Scatter Spridningsplot plot of paired av parade observations observationer 12,00 10,00 DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit Dako HER2 FISH pharmdx kit 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis Vysis PathVysion HER-2 HER-2 DNA DNA Probe Probe Kit Kit Figur bröstcancerprover testade för HER2 genamplifiering med Dako HHER2 FISH pharmdx Kit och med Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Resultaten uttrycks som HER2/kromosom 17-centromer-förhållanden. 60 kärnor i varje prov bedömdes med vart och ett av de två kiten. Den allmänna överensstämmelsen mellan Dako HER2 FISH pharmdx och Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe-tester undersöktes med analys av skillnaden mellan parade observationer av det logaritmiska (förhållandet), och en linjär regressionsanalys av logg (förhållandet) för de två testerna. Slutsatsen var att skillnaden mellan parade observationer av logg (förhållandet) ökar systematiskt med summan av HER2/kromosom 17-centromerförhållandena och att för högre förhållanden är det mätta förhållandet högre i Dako-testet än i Vysis testet. Det högre HER2/kromosom 17-centromerförhållandet som observerades med Dako HER2 FISH pharmdx kit kan vara relaterad till en äkta skillnad mellan de två testen, dvs. att en högre upplösning hos Dako HER2 FISH pharmdx kit, resulterar i högre förhållanden för starkt HER2-genamplifierada fall. Testningen av de kiten utfördes dock på 2 olika platser och variation mellan laboratorier förväntas. Dessutom har en större variation för högt amplifierade fall rapporterats i litteraturen men inte ansetts kliniskt relevant (18). Den aktuella studien tillåter inte undersökning av en systematisk skillnad mellan de två testerna på flera laboratorier. Det bör tilläggas att den observerade variationen mellan de två testerna är av liknande storlek som variationen mellan olika platser observerade i portabilitetsstudien. Dako HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) har jämförts med Dako HER2 FISH pharmdx kit (kod K5331) i en jämförande studie av 78 bröstvävnadsprover av humant bröstkarcinom. ( ) P04090SE_01_K / s. 23/60

24 Bröstcancer Korstabulering av HER2-status, som erhållits av de två analyserna, gav en total överensstämmelse på 98,7 % med undre och övre gränser för det 95-procentiga konfidensintervallet vid 94,2 % och 99,9 %. Kappa-värdet var 0,96 med undre och övre gränser för det 95-procentiga konfidensintervallet vid 0,89 och 1,00. P-värdet för McNemars test var 1,00, vilket talar för frånvaro av ensidighet mellan de två analyserna. ( ) P04090SE_01_K / s. 24/60

25 Bröstcancer Felsökning - Bröst Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 1a. Kitet har exponerats för höga temperaturer under transport eller förvaring 1b. Mikroskopet fungerar inte korrekt - olämpligt filter insatt - fel lampa - kvicksilverlampan för gammal - smutsiga och/eller spruckna uppasmlingslinser - olämplig immersionsolja 1a. Kontrollera förvaringsförhållandena. Kontrollera att kolsyreis fanns närvarande när leveransen togs emot. Kontrollera att flaska 3 har förvarats vid -18 C i mörker. Kontrollera att flaska 2A och 5 har förvarats vid högst 2 8 C i mörker. 1b. Kontrollera mikroskopet och att de använda filtren är lämpliga för användning med kitets fluorokromer och att kvicksilverlampan är korrekt och inte har använts längre än sin förväntade livslängd. (se Bilaga 3). Kontakta mikroskopförsäljaren vid tveksamhet. 1c. Blekta signaler 1c. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starka ljuskällor. 1d. Felaktiga förbehandlingsförhållanden 1e. Avdunstning av probmix under hybridiseringen 2. Inga gröna signaler 2a. Fel stringenttvättförhållanden 1d. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 1e. Kontrollera fuktighetsnivån i hybridiseringskammaren 2a. Kontrollera att den rekommenderade stringent tvättemperaturen används och att täckglasen tas bort innan stringenttvätten utförs 3. Inga röda signaler 3a. Felaktiga förbehandlingsförhållanden 4. Områden utan signal 3a. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 4a. Probvolymen är för liten 4a. Se till att probvolymen är tillräckligt stor för att täcka området under täckglaset 4b. Luftbubblor infångades under probmixappliceringen eller monteringen 4b. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor, knacka försiktigt bort dem med en pincett ( ) P04090SE_01_K / s. 25/60

26 Bröstcancer Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 5. Överdriven bakgrundsfärgning 6. Dålig vävnadsmorfologi 5a. Olämplig vävnadsfixering 5a Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används 5b. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt 5c. Stringenttvättemperaturen är för låg 5d. Långvarig exponering av hybridiserat snitt för starkt ljus 5b. Följ de avparaffineringsoch rehydreringsprocedurer som beskrivs i avsnitt B.2 5c. Se till att stringenttvättemperaturen är 63 (±2) C 5d. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starkt ljus. 6a. Felaktig pepsinbehandling 6a. Följ de rekommenderade inkubationstiderna för pepsin. Se avsnitt B.3, steg 2. Se till att pepsinet hanteras vid korrekt temperatur. Se avsnitt B.1 6b. Felaktig förbehandling kan resultera i otydligt eller grumligt utseende 6c. Alltför lång pepsinbehandling eller mycket tunna snitt kan göra att spökceller eller donut-celler visas. 6b. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 6c. Förkorta inkubationstiden för pepsin. Se avsnitt B.3, steg 2. Se till att snittjockleken är 4 6 µm. 7. Hög nivå av grön fluorescens på objektglaset, inklusive områden utan FFPE-vävnad 7. Användning av utgångna eller ej rekommenderade objektglas 7. Säkerställ att det belagda objektglaset (Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-l-lysinbelagda objektglas) inte har gått ut. OBS! Om problemet inte kan hänföras till någon av ovanstående orsaker eller om de föreslagna åtgärderna inte löser problemet, kontakta Dakos tekniska service för ytterligare hjälp. ( ) P04090SE_01_K / s. 26/60

27 Bröstcancer Bilaga 1 - Bröst HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Protokoll - checklista Datum för körningen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 parti: Prov-ID: Utrustnings-ID: Färgningskörning logg-id: Datum för utspädning/utgångsdatum för 1 x Wash Buffer (flaska 6 utspädd 1:20): / Vävnad fixerad i neutralbuffrat formalin Ja Nej Steg 1: Förbehandling Datum för spädning/utgångsdatum för Pre-Treatment Solution (flaska 1 spädd 1:20) Uppmätt temperatur för Pre-Treatment Solution (95 99 C) om vattenbad används för uppvärmning Förbehandling (10 minuter), och avkylning (15 minuter) Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Steg 2: Pepsin Varaktighet av pepsinbehandlingen (flaska 2) vid 37 C eller Varaktighet av pepsinbehandlingen (flaska 2) vid rumstemperatur (20 25 C) eller Varaktighet av pepsinnedsänkning vid 37 (±2) C Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Dehydrera glasen (3 x 2 minuter) i graderad serie etanol och lufttorka Steg 3: HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix Applicera probmix (flaska 3), täckglas och förslut med täckglasförsegling C minuter minuter minuter Uppmätt denatureringstemperatur (66 (±1) C) C Denaturering i 10 minuter Uppmätt hybridiseringstemperatur (45 (±2) C) C Hybridiseringstid ( minuter) Steg 4: Stringenttvätt Datum för utspädning/utgångsdatum för stringent tvättbuffert (flaska 4 utspädd 1:20) minuter Uppmätt temperatur för stringent tvättbuffert (63 (±2) C) C Stringenttvätt (10 minuter) efter borttagning av täckglas Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) C Dehydrera glasen (3 x 2 minuter) i graderad serie etanol och lufttorka / minuter ( ) P04090SE_01_K / s. 27/60

28 Bröstcancer Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium (flaska 5) och täck med täckglas Kommentarer: Datum och namnteckning, Tekniker: ( ) P04090SE_01_K / s. 28/60

29 Bröstcancer Bilaga 2 - Bröst HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Poängsättningsschema Färgningskörning - logg-id: Datum för körningen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 parti: Prov-ID: Kärna nr HER2 poäng (röd) Räkna signaler i 20 kärnor CEN-17 poäng (grön) Kärna nr Totalt (1 10) Totalt (11 20) HER2 poäng (röd) CEN-17 poäng (grön) För bestämning av HER2/CEN-17-förhållandet, räkna antalet HER2-signaler och antalet CEN-17- signaler i samma 20 kärnor och dividera det totala antalet HER2-signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Om HER2/CEN-17-förhållandet är ett gränsfall (1,8 2,2) ska du räkna ytterligare 20 kärnor och beräkna förhållandet på nytt. Ett förhållande vid eller nära gränsen (1,8 2,2) ska tolkas med försiktighet (se räkningsguiden). Total poäng (1 20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-förhållande Förhållande < 2: HER2-genamplifiering observerades inte Förhållande 2: HER2-genamplifiering observerades Datum och namnteckning, Tekniker: Datum och namnteckning, Patolog: För riktlinjer för poängsättning: se Tolkning av färgning. ( ) P04090SE_01_K / s. 29/60

30 Bröstcancer Bilaga 3 - Bröst HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar att följande utrustning används med HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Mikroskoptyp Epifluorescensmikroskop. 2. Lampa 100 watt kvicksilverlampa (håll reda på brinntiden). 3. Objektiv För screening av vävnaden kan fluorescens torr 10X eller fluorescens oljeimmersion 16X objektiv användas. För högre förstoring och räkning av signaler rekommenderas endast fluorescens oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 100X. 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI filter i kombination med ett Texas Red-/FITCdubbelfilter av hög kvalitet. DAPI-filter, t.ex. Chroma-filter nr Texas Red/FITC dubbelfilter, t.ex. Chroma-filter nr Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse. Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är mycket viktigt för tolkningen. Om du vill ha detaljerad information ska du kontakta din mikroskopleverantör eller din Dako-representant. 5. Olja Icke-fluorescerande olja Försiktighetsåtgärder En 50 W kvicksilverlampa rekommenderas inte. Rhodaminfilter kan inte användas. Trippelfilter rekommenderas inte. Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunden ska övervaka och följa tillverkarens rekommendationer för kvicksilverlampan. Mikroskopet ska underhållas och kvicksilverlampan ska vara rätt inriktad innan du försöker tolka resultaten. Försök exponera provet så lite som möjligt för excitationsljuset för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar uppställningen av ditt särskilda mikroskop med tillverkaren innan du börjar med fluorescerande in situ hybridisering, eller tittar i litteraturen. ( ) P04090SE_01_K / s. 30/60

31 Magcancer Sammanfattning och förklaring - Mage Den humana HER2-genen (även kallad ERBB2 eller NEU) finns på kromosom 17 och kodar HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet är en membran tyrosinkinasreceptor med homologi till den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genen är närvarande i 2 kopior i alla normala diploida celler. Överexpression av HER2-proteinet och amplifiering av HER2-genen vid magcancer har påvisats i ett flertal olika studier (granskat i (20)). HER2-positivitet kan detekteras hos cirka 20 % av patienterna, genom antingen IHC eller FISH (20). Förkliniska in vitro- och in vivo-studier har påvisat att trastuzumab ((20-24)Herceptin ) är effektiv i olika magcancermodeller, vilket således lett till initiering av kliniska studier (21 25). I en fas III-studie BO18255, ToGA-prövningen, randomiserades HER2- positiva patienter med lokalt framskriden cancer som ej går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen inklusive den gastroesofageala förbindelsen för att få 5-FU eller capecitabin och cisplatin, antingen enbart eller i kombination med trastuzumab. En statistiskt signifikant ökning av total överlevnad (OS) observerades hos patienter som fick en kombinerad behandling bestående av trastuzumab och kemoterapi (25). Trastuzumab är en humaniserad monoklonal antikropp, som binder med hög affinitet till HER2-proteinet och har visat sig hämma proliferationen av humana tumörceller som överuttrycker HER2-protein in vitro och in vivo (21-24). Procedurprincip - Mage HER2 IQFISH pharmdx innehåller alla viktiga reagenser som behövs för att fullborda en FISHprocedur för formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. Efter avparaffinering och rehydrering, värms prover upp i Pre-Treatment Solution följt av proteolytisk nedbrytning med pepsin. Efter upphettning och de proteolytiska förbehandlingsstegen, utnyttjar detta kit en icke toxisk, bruksfärdig IQISH probmix, baserad på en kombination av PNA (peptidnukleinsyra) (12) och DNA-teknik. Denna Probe Mix består av en blandning av Texas Redmärkta DNA-prober som täcker en 218 kb region i vilken HER2-genen på kromosom 17 ingår, och en blandning av fluoresceinmärkta PNA-prober riktade mot den centromeriska regionen hos kromosom 17 (CEN-17). Den specifika hybridiseringen till de två målen resulterar i bildande av en distinkt röd fluorescerande signal vid varje HER2-genlokus och en distinkt grön fluorescerande signal vid varje kromosom 17-centromer. Efter en stringenttvätt monteras proverna med Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI och förses med täckglas. Med användning av ett fluorescensmikroskop försett med lämpliga filter (se Bilaga 3) lokaliseras tumörceller och räkning av röda (HER2) och gröna (CEN-17) signaler utförs. Därefter beräknas HER2/CEN-17-förhållandet. Normala celler i det analyserade vävnadssnittet tjänar som en intern positiv kontroll av förbehandling och hybridisering. Ytterligare information finns i avsnittet Tolkning av färgningen. För interaktiv e-utbildning, använd HER2 IQFISH pharmdx e-utbildningsprogrammet, som är utformat för att förse laboratorietekniker, patologer och forskare med noggrann och snabb kunskap om hur man uppnår optimala resultat med HER2 IQFISH pharmdx : Reagenser - Mage Medföljande material Det material som anges nedan räcker till 20 tester (ett test definieras som ett 22 mm x 22 mm målområde). Antalet tester baseras på användning av 250 µl per objektglas av flaska 2A (5 8 droppar), 10 µl per objektglas av flaska 3, och 15 µl per objektglas av flaska 5. Lösningarna i flaska 3 och flaska 5 är viskösa och måste eventuellt centrifugeras kortvarig i en mikrocentrifug för att samla in all tillhandahållen reagens. Kitet tillhandahåller material som räcker till 10 individuella färgningskörningar (fyra separata körningar, vid användning av pepsinnedsänkningsmetoden). HER2 IQFISH pharmdx levereras på kolsyreis. För att garantera att kitets komponenter inte har utsatts för hög temperatur under transporten bör kolsyreisen fortfarande finnas kvar vid leveransen. Observera att vissa kitkomponenter kan fortsätta vara ofrysta. Detta påverkar inte prestandan hos HER2 IQFISH pharmdx. ( ) P04090SE_01_K / s. 31/60

32 Magcancer Flaska 1 Flaska 2A Flaska 2B Flaska 3 Flaska 4 Förbehandlingslösning (20x) 150 ml, koncentrerad 20x MES (2-[N-morfolino]etansulfonsyra) buffert. Pepsin 4 x 6,0 ml, bruksfärdigt Pepsinlösning, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Pepsin-spädningsmedel (10x) 24 ml, koncentrerad 10x Spädningsmedelbuffert, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. HER2/CEN-17 IQISH probmix 0,2 ml, bruksfärdig Blandning av Texas Red-märkta HER2 DNA-prober och fluoresceinmärkta CEN-17 PNA-prober, tillhandahålls i IQISH hybridiseringsbuffert Stringenttvättbuffert (20x) 150 ml, koncentrerad 20x SSC- (saltlösning-natriumcitrat) buffert med tvättmedel (Tween-20). Flaska 5 Flaska 6 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml, bruksfärdig Fluorescerande monteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, koncentrerad 20x Tris/HCl-buffert. Coverslip Sealant 1 rör, bruksfärdigt Lösning för borttagbar försegling av täckglas. OBS! Följande kitreagenser: Pre-Treatment Solution (20x), Pepsin, Pepsin Diluent (10x), Stringent Wash Buffer (20x), Fluorescence Mounting Medium, Wash Buffer (20x) och motsvarande Coverslip Sealant, kan bytas mot motsvarande reagenser i Dako Histology FISHtillbehörskitet, kod K5799. ( ) P04090SE_01_K / s. 32/60

33 Magcancer Material som behövs, men inte ingår Laboratoriereagenser Destillerat eller avjoniserat vatten Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitut Laboratorieutrustning Absorberande pappersdukar Justerbara pipetter Kalibrerad partiell immersionstermometer (område C) Kalibrerad yttermometer (område C) Täckglas (22 mm x 22 mm) Pincett Dragskåp Dako Hybridizer (kod S2450 eller S2451)* Värmeblock eller hybridisering* Fuktig hybridiseringskammare* Mikrocentrifug Objektglas, Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-l-lysin-belagda objektglas (se Provpreparation) Färgningskyvetter eller -bad Timer (med 2 15 minuters intervaller) Vortexblandare Vattenbad med lock (som kan hålla 37(±2) C, 63 (±2 ) C och från 95 C till 99 C) Mikrovågsugn med avkänningskapacitet om förbehandling utförs med mikrovågsugn (se B3. Färgningsprotokoll. Steg 1: Förbehandling, metod B) * Värmeblock eller hybridiseringsugn för denaturering (66 (±1) C) och hybridisering (45 (±2) C) tillsammans med en fukthybridiseringskammare kan användas som ett alternativ till Dako Hybridizer. Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI och FITC/Texas Red dubbelfilter, eller FITC och Texas Red monofilter - se Bilaga 3 för ytterligare information. Fluorescensmikroskop med 100 watt kvicksilverlampa som ljuskälla bör användas. Inga andra ljuskällor rekommenderas med dessa filter. Mikroskopglasfolder (kartongbricka med gångjärnsförsett lock och plats för 20 objektglas eller liknande) Försiktighetsåtgärder - Mage 1. För diagnostisk användning in vitro. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Etiketter angående risker/faror krävs inte för flaskan 1. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 4. Flaska 2A, Pepsin, innehåller 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A och <0.1% blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isotiazol-3-on och 2-metyl-2H 2Hisotiazol-3-on, blandning (3:1). Flaska 2A är märkt: ( ) P04090SE_01_K / s. 33/60

34 Magcancer Fara H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Kan orsaka allergisk hudreaktion. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 5. Flaska 2B, Pepsin Diluent (10x) innehåller 50-<75% propan-2-ol, och 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Flaske 2B är märkt: Fara H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Orsakar allvarlig ögonirritation. Kan göra att man blir dåsig eller omtöcknad. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker elektrisk utrustning, ventilationsutrustning, belysningsutrustning och materialhanteringsutrustning. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 6. Flaska 3, HER2/CEN-17 IQISH probmix, innehåller 10-<25% etylenkarbonat och 3-<5% natriumklorid. Flaska 3 är märkt: Varning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i ( ) P04090SE_01_K / s. 34/60

35 Magcancer flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 7. Flaska 4, Stringent tvättbuffert (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% 2- amino-2-(hydroximetyl)propan-1, 3-diolhydroklorid. Flaska 4 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 8. Flaska 6, Wash Buffer (20x), innehåller 10-<25% natriumklorid och 10-<20% trometamol. Flaska 6 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Irriterar huden. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. 9. Artikelt 7, Coverslip Sealant, innehåller 100 % nafta (petroleum), vätebehandlad lätt, och är märkt: Fara H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Kan vara dödligt vid förtäring om det kommer ner i luftvägarna. Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker el-, ventilations-, belysnings- och materialhanteringsutrustning. Undvik utsläpp till miljön. VID FÖRTÄRING: Ring omedelbart GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller dusch. Förvaras svalt. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 10. Prover, före och efter fixering och alla material som exponerats för dessa, bör hanteras som potentiellt smittbärande och kasseras med lämpliga försiktighetsåtgärder (16). Pipettera ( ) P04090SE_01_K / s. 35/60

36 Magcancer aldrig reagenser med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagenser och prover. Om reagenser kommer i kontakt med känsliga områden ska dessa sköljas med stora mängder vatten. 11. Minimera mikrobiell kontamination av reagenser för att undvika felaktiga resultat. 12. Andra inkubationstider och temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. 13. Vävnadsfixeringsmetoder och provtjocklekar som är annorlunda än de specificerade kan påverka vävnadsmorfologi och/eller signalintensitet. 14. Undvik avdunstning av HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix under hybridisering genom att tillförsäkra tillräcklig fuktighet i hybridiseringskammaren. 15. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan innebära resultatförlust. 16. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (SDS). 17. P.g.a. magcancerprovers heterogena beskaffenhet är det viktigt att utföra en grundlig skanning av hela provet för att utvärdera signalfördelningen innan du väljer området för signalräkning. 18. Vi rekommenderar inte att utvärdera mycket små prover (dvs. proverna måste ha en intakt morfologi och tillräcklig kärna för räkning). 19. Om HER2 FISH-analysen utförs på ett biopsiprov, bör flera (7-8) biopsier från olika delar av tumören analyseras för att man ska uppnå en tillförlitlig bestämning av HER2-statusen. 20. Det är viktigt att inspektera det H&E-färgade objektglaset, för att identifiera alla vävnadskärnor i ett biopsiprov. 21. Endast rena färgningskyvetter bör användas för pepsinnedsänkningsmetoden (steg 2, metod C). ( ) P04090SE_01_K / s. 36/60

37 Magcancer Förvaring - Mage Förvara HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (flaska 3) vid -18 C i mör ker. Alla andra reagenser kan förvaras vid 2 8 C i mörker. Alla reagenser kan fr ysas. Frysning och upptining av reagenserna upp till 10 gånger påverkar inte resultatet. Pepsin, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, och Fluorescence Mounting Medium (flaska 2A, 3 och 5) kan påverkas negativt om de utsätts för värme. Lämna inte dessa komponenter i rumstemperatur. HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix och Fluorescence Mounting Medium (flaska 3 och 5) kan påverkas negativt om de utsätts för alltför höga ljusnivåer. Förvara inte dessa komponenter och utför inte analysen i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. Använd inte kitet efter det utgångsdatum som är tryckt på kitets kartong. Om reagenserna förvaras under andra förhållanden än de som specificerats i detta produktblad måste användaren validera reagensresultaten (13). Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet för denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normala celler i det analyserade vävnadssnittet. Kontakta Dakos tekniska service om ett oväntat fluorescensmönster observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och något problem med HER2 IQFISH pharmdx misstänks. Provförberedning - Mage Biopsier, excisioner eller resektioner som tagits från adenokarcinomprover i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, måste hanteras så att vävnaden bevaras för FISH-analys. Standardmetoder för vävnadsbehandling för immuncytokemisk färgning bör användas för alla prover (14). Vid testning av små biopsiprover måste man säkerställa att tumörmorfologin är intakt och att det finns tillräckligt många kärnor för signalräkning. Om en HER2 FISH-analys utförs på ett biopsiprov, bör flera (7-8) biopsier från olika delar av tumören analyseras för att säkerställa tillförlitlig bestämning av HER2-statusen. Paraffininbäddade snitt Endast vävnad som konserverats i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddats lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis blockeras till en tjocklek på 3 4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Biopsiproverna fixerades i 6 8 timmar i ToGA-prövningen (se (25) för studiereferens). Vävnaderna dehydreras sedan i en graderad serie etanol- och xylenbad, följt av infiltrering av smält paraffin som inte är varmare än högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader håller för evigt innan de snittas och monteras på objektglas om de förvaras på sval plats (15 25 C) (14, 15). Andra fixativ är inte lämpliga. Vävnadsprover ska snittas i 3 6 µm tjocka snitt. Objektglasen som krävs för HER2 genamplifieringsanalys och verifikation av tumörens närvaro ska prepareras samtidigt. Minst 2 seriella snitt rekommenderas, 1 snitt för tumörnärvaro färgat med hematoxylin och eosin (H&E-färgning) och 1 snitt för HER2 genamplifieringsanalys. Vi rekommenderar att vävnadssnitten monteras på Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-llysin-belagda objektglas. Prover ska analyseras inom 4 6 månader efter snittning när de förvaras i rumstemperatur (20 25 C). ( ) P04090SE_01_K / s. 37/60

38 Magcancer BRUKSANVISNING - Mage A. Reagenspreparation - Mage Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: A.1 Pre-Treatment Solution Kristaller kan förekomma i flaska 1, men de löses upp vid rumstemperatur. Kontrollera att inga kristaller finns innan reagenset prepareras. Späd en tillräcklig mängd från flaska 1 (Förbehandlingslösning 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda lösningen o m den är grumlig. A.2 Stringent Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd från flaska 4 (Stringent tvättbuffert 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.3 Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd från flaska 6 (Wash Buffer 20x) genom att späda koncentratet 1:20 i destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.4 Etanolserier Preparera tre burkar med 70 %, 85 % respektive 96 % etanol från 96 % etanollösning. Förvara täckta burkar vid rumstemperatur eller vid 2 8 C o ch använd lösningarna för högst 200 objektglas. Kassera lösningarna om de ser grumliga ut. A.5 Pepsinlösning En pepsinlösning behövs endast när pepsinnedsänkningsmetoden (metod C) används. Preparera pepsinlösning enligt följande: För en behållare för sex objektglas ska 60 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 48 ml rumstempererat (20 25 C) eller avjo niserat vatten till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) pepsinspädningsmedel ( 10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) til l behållaren. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. För en behållare för 24 objektglas ska 240 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 192 ml rumstempererat (20 25 C) eller avj oniserat vatten till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) pepsinspädningsmedel (10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) ti ll behållaren. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. Pepsinlösning som antagit rumstemperatur bör användas inom 5 timmar. ( ) P04090SE_01_K / s. 38/60

39 Magcancer B. Färgningsprocedur - Mage B.1 Proceduranteckningar Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser bör anta jämvikt vid relevant temperatur före användning enligt följande: Flaska 1: Den spädda förbehandlingslösningen ska anta jämvikt vid C om vattenbad används för förbehandling (B3. Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod A). Om mikrovågsugn med avkänningskapacitet används för förbehandling (B3. Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod B) den utspädda förbehandlingslösningen bör få anta jämvikt vid rumstemperatur C. Flaska 2A: Pepsin bör appliceras vid 2 8 C (B3, färgningsprotokoll, steg 2 metod A och B) och alltid förvaras kallt. Flaska 2B: Pepsinspädningsmedel (10X) bör appliceras vid 2 8 C (B3, färgningsprotokoll, steg 2 metod C). Flaska 3: HER2/CEN-17 IQISH Probe Mixsepareras i 2 faser medan den förvaras vid -18 C. Före användning av flaska 3 måste du säkerställa att endast en fas är närvarande genom att låta probmixen anta jämvikt till rumstemperatur (20 25 C) följt av blandning. Tina flaska 3 vid rumstemperatur (20 25 C) i högst 30 minuter (skydd a från starkt ljus), virvla sedan flaskan grundligt i 15 sekunder vid r/min med användning av en vortexblandare. Förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Flaska 4: Utspädd Stringent Wash Buffer; en burk ska nå jämvikt vid rumstemperatur, en annan burk ska anta jämvikt vid 63 (±2) C före användning. Flaska 5: Fluorescence Mounting Medium kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2 25 C. Flaska 6: Den spädda Wash Buffer ska anta jämvikt vid rumstemperatur C. Coverslip Sealant kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2 25 C. Alla steg måste utföras vid den angivna temperaturen. Proceduren inkluderar ett antal dehydreringar följt av torkning av vävnadssnitten. Se till att vävnadssnitten är helt torra innan du går vidare till nästa steg. Låt inte vävnadssnitten torka under de övriga procedurstegen. Om färgningsproceduren måste avbrytas kan glasen förvaras i tvättbuffert efter avparaffineringssteget i upp till en timme vid rumstemperatur (2 25 C) utan att resultatet påverkas. B.2 Behandling av vävnader före färgning Avparaffinering och rehydrering: Innan analysen utförs måste objektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Se till att paraffinet är fullständigt avlägsnat. Resterande inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i 96 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i 70 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Slå bort överskottsvätska och placera glasen i utspädd tvättbuffert (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i minst 2 minuter. Påbörja färgningsproceduren så som beskrivs i avsnitt B.3, steg 1, Förbehandling. ( ) P04090SE_01_K / s. 39/60

40 Magcancer Xylen och alkohollösningarna ska bytas efter högst 200 objektglas. Xylensubstitut kan användas. OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer detta kit har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra resultaten ogiltiga. B.3 Färgningsprotokoll Steg 1: Förbehandling Förbehandling kan utföras antingen med vattenbad enligt metod A eller med mikrovågsugn med avkänningskapacitet enligt metod B. Metod A: Förbehandling med vattenbad Fyll färgningskärl, t.ex. Coplin-kärl, med den spädda förbehandlingslösningen (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärl med utspädd förbehandlingslösning i vattenbad. Hetta upp vattenbadet och Pre-Treatment Solution till C. Mät temperaturen inuti skålen med en kalibrerad termometer så att du säkert får rätt temperatur. Täck skålarna med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda förbehandlingslösningen i färgningsskålarna. Kontrollera temperaturen igen och inkubera i 10 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Ta av locket och låt glasen svalna i förbehandlingslösning i 15 minuter vid rumstemperatur. Överför objektglasen till en skål med utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Metod B: Förbehandling med mikrovågsugn med avkänningskapacitet Fyll en plastkyvett med spädd Pre-Treatment Solution vid rumstemperatur (20 25 C). Sänk ned de avparaffinerade snitten i förbehandlingslösning, täck över skålen med ett punkterat lock och placera den i mikrovågsugnen. Välj koksensorfunktionen och ett program som kör i 10 minuter efter att kokpunkten har uppnåtts*. Efter 10 minuters inkubation ska du ta ut skålen med objektglas ur ugnen, ta bort locket och låta den svalna i 15 minuter vid rumstemperatur. Flytta över objektglasen till en skål med spädd Wash Buffer och låt dem ligga i blöt i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. * Användning av en mikrovågsugn med avkänningskapacitet betyder att ugnen måste ha en sensor och program som initialt värmer upp Pre-Treatment Solution till kokpunkten och sedan bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) medan nedräkning sker av den förinställda tiden (10 (±1) minuter). Vissa mikrovågsugnar med avkänningskapacitet har eventuellt inte möjligheten att fritt ställa in nedräkningstid. Om modellen endast har förinställda program ska du se till att välja ett program som bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) under minst 10 (±1) minuter och manuellt stoppa programmet efter 10 (±1) minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Pepsin, bruksfärdig eller pepsinlösning Pepsininkubation kan utföras genom direkt applicering av bruksfärdiga pepsindroppar på objektglasen, antingen vid rumstemperatur (20 25 C ) (metod A) eller vid 37 C (metod B). Alternativt kan objektglasen sänkas ned i en pepsinlösning och inkuberas vid 37 (±2) C (metod C) Metod A och metod B: Slå bort överskottsbuffert. Använd en luddfri duk (såsom en absorberande duk eller gasbinda) och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all återstående vätska och för att hålla reagenserna inom det föreskrivna området. ( ) P04090SE_01_K / s. 40/60

41 Magcancer Tillsätt 5 8 droppar (250 µl) kallt (2 8 C) pepsin (flaska 2A) för att täcka provet. Förvara alltid Pepsin vid 2 8 C. Metod A: Pepsin, bruksfärdigt - Inkubation vid C Inkubera i 5 15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 5 minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort Pepsinet och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Metod B: Pepsin, bruksfärdigt - Inkubation vid 37 C Placera provet med Pepsin på ett värmeblock vid 37 C - t.ex. Dako Hybridizer - och inkubera i 3 5 minuter. En inkubationstid på 3 minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödigt pepsin och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Metod C: Pepsinlösning - Nedsänkning av objektglas i 37 C pepsinlösning Kitet innehåller tillräckligt med reagenser för fyra separata körningar (60 ml pepsinlösning, liten behållare för sex objektglas) eller en enda körning (240 ml pepsinlösning, stor behållare för 24 objektglas). Preparera pepsinlösningen enligt vad som beskrivs i avsnitt A.5. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. Kontrollera att temperaturen har stabiliserats. Mät temperaturen på insidan av behållaren med en kalibrerad termometer för att garantera korrekt temperatur. Slå bort överflödig tvättbuffert. Sänk ned objektglasen i 37 (±2) C pepsinlösning och inkubera i minuter. En inkubationstid på minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överlödig pepsinlösning och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Steg 3: HER2/CEN-17 IQISH probmix HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix separeras i 2 faser medan den förvaras vid -18 C. Före användning av flaska 3 måste du säkerställa att endast en fas är närvarande genom att låta probmixen anta jämvikt till rumstemperatur (20 25 C) följt av blandning. Tina flaska 3 vid rumstemperatur (20 25 C) i högst 30 minuter (skydd a från starkt ljus), virvla sedan flaskan grundligt i 15 sekunder vid r/min med användning av en vortexblandare. Förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Applicera 10 µl HER2/CEN-17 IQISH probmix (flaska 3) till mitten av vävnadssnittet. Placera omedelbart ett 22 mm x 22 mm täckglas över probmixen och låt det sprida sig jämnt under täckglaset. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor ska du försiktigt knacka bort dem från vävnaden med en pincett. Kom ihåg att förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. ( ) P04090SE_01_K / s. 41/60

42 Magcancer Försegla täckglaset med täckglasförsegling genom att klämma ut förseglingen runt täckglasets kanter. Låt täckglasförseglingen överlappa täckglas och objektglas så att en försegling bildas runt täckglaset. Se till att täckglasförsegling täcker alla kanterna på täckglaset. Preparera Dako Hybridizer* (kod S2450 eller S2451) för en hybridiseringskörning. Se till att Humidity Control Strips (kod S2452) är mättade och optimala att använda. Starta Hybridizer och välj ett program som: Denaturerar vid 66 C i 10 minuter följt av hybridi sering vid 45 C i minuter. Placera objektglasen i Dako Hybridizer, se till att locket är ordentligt stängt och starta programmet. Se användarhandboken till Dako Hybridizer för ytterligare information. * Instrument som tillåter förhållanden som är identiska med de som beskrivs ovan kan användas för denaturering och hybridisering: Placera objektglasen på en plan metall- eller stenyta (värmeblock eller ett block i en hybridiseringsugn) som är förvärmd till 66 (±1) C. Denaturera i exakt 10 minuter. Placera glasen i en föruppvärmd fuktad hybridiseringskammare. Täck kammaren med ett lock och inkubera vid 45 (±2) C i minuter. Obser vera att en hybridiseringstemperatur på 37 C inte är lämplig för användning med proberna i detta kit. Steg 4: Stringenttvätt Fyll två färgningsskålar, t.ex. Coplin-burkar, med utspädd stringent tvättbuffert (se BRUKSANVISNING, Avsnitt A.2). En minsta volym på 100 ml eller 15 ml per objektglas i varje skål rekommenderas. Placera en av färgningsskålarna med utspädd stringent tvättbuffert vid rumstemperatur i ett dragskåp och den andra i ett vattenbad. Hetta upp vattenbadet och den utspädda Stringent Wash Buffer till 63 (±2) C. Kontrollera att temperature n har stabiliserat sig. Täck skålen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Mät temperaturen inuti vattenbadets skål med en kalibrerad termometer för att vara säker på att temperaturen är korrekt. Stringent Wash Buffer innehåller tvättmedel och kan bli grumlig vid 63 C ; detta påverkar inte resultatet. Använd pincett eller handskar och ta ut objektglasen ur hybridiseringskammaren, ta försiktigt bort täckglasförsegling och täckglaset och placera glasen i den rumstempererade skålen med stringent tvättbuffert, ett i taget. Så snart som alla täckglas har avlägsnats ska objektglasen överföras från det rumstempererade för-tvättkärlet till kärlet vid 63 (±2) C i vatten badet. Timern bör startas omedelbart efter att objektglasen överförts till behållaren på 63 (±2) C i vattenbadet. Utför stringenttvätt i exakt 10 minuter. Ta bort glasen från den utspädda Stringent Wash Buffer och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten torka helt. Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI (flaska 5) till objektglasets målområde och lägg på ett täckglas. OBS! Glasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om glasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara glasen i mörker vid C för att minimera blekning. Kvalitetskontroll - Mage 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. ( ) P04090SE_01_K / s. 42/60

43 Magcancer 2. Normala celler gör att man kan göra en intern kontroll av färgningskörningen. Normala celler ska ha 1 2 klart synliga gröna signaler som tecken på att CEN-17 PNAproben framgångsrikt har hybridiserats till den centromeriska regionen hos kromosom 17. Normala celler ska också ha 1 2 klart synliga röda signaler som tecken på att HER2 DNAproben framgångsrikt har hybridiserats till HER2-genamplifieringen. På grund av vävnadssnittningen kommer vissa normala celler ha färre än de förväntade 2 signalerna av varje färg. Om inga signaler detekteras i normala celler är det ett tecken på att analysen misslyckats och resultaten ska anses ogiltiga. 3. Nukleär morfologi måste vara intakt vid utvärdering med ett DAPI-filter. Många spöklika celler och en allmänt dålig nukleär morfologi tyder på övernedbrytning av provet, vilket resulterar i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prover ska anses ogiltiga. 4. Det minsta antalet bedömningsbara tumörceller är Skillnader i vävnadsfixering, behandling, och inbäddning i användarens laboratorium kan producera variabilitet i resultaten som gör regelbunden utvärdering av egna kontroller nödvändiga. Färgningstolkning - Mage Bedömningsbar vävnad Lokalisera tumören inom det H&E-färgade glaset och utvärdera samma område på det FISHfärgade glaset (i DAPI-filtret). Endast prover från patienter med adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, ska poängsättas. I fall med intestinal metaplasi och adenocarcinom i samma prov ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Undvik kraftigt inflammerade områden, nekros och områden där de nukleära gränserna är tvetydiga. Tag inte med kärnor som kräver subjektiv bedömning. Hoppa över kärnor med svag signalintensitet och icke-specifik eller hög bakgrund. Börja med att utvärdera det fullständiga FISH-färgade snittet respektive det tilldelade området på H&E-snittet med mikroskop. Innan det FISH-färgade objektglaset räknas ska du notera den allmänna signalfördelningen (homogena eller heterogena) i signalräkningsformuläret. I fall av heterogen fördelning ska du kontrollera om antingen fokal amplifiering eller enkel cellsamplifiering (mosaik) är närvarande. 1) Homogen signalfördelning I fall av homogen signalfördelning ska du räkna ut antalet kromosomcentromerer (gröna signaler) respektive antalet HER2-signaler (röda signaler) från 20 celler i 1 2 representativa tumörområden. 2) Heterogen signalfördelning Om signalfördelningen är heterogen ska du räkna totalt 20 celler från utvalda områden, enligt vad som specificeras nedan: A) Om fokal amplifiering är närvarande bör områden med amplifierade celler väljas. B) Om mosaik fördelning eller amplifierade, polysomala och disomala celler är närvarande, räkna i områden med amplifierade celler. Inom dessa områden bör inte endast de amplifierade cellerna utan även de närliggande, icke amplifierade cellerna räknas för totalt 20 celler. Välj om möjligt inte överlappande områden. Ignorera färgning av bakteriellt DNA Ett antal specialiserade celler (mastceller och makrofager), som är närvarande uppblandad i magvävnaden, uppvisar en hög nivå av färgning av HER2-proben p.g.a. närvaro av bakteriellt DNA. Detta leder till starkt röda fluorescerande celler, som skiljer sig klart och tydligt från tumörceller med en hög HER2-genamplifiering. Signalräkning När ett område har valts för signalutvärdering ska du påbörja analysen i en av de 20 intilliggande kärnorna som valts och sedan räkna cell för cell och endast som utelämna kärnor som inte ( ) P04090SE_01_K / s. 43/60

44 Magcancer uppfyller kvalitetskriterierna. Räkna antalet signaler inom kärngränsen för varje bedömd kärna enligt nedanstående riktlinjer (se även Bilaga 7). - Fokusera uppåt och nedåt för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna. - Räkna två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd som är (lika med eller) mindre än signalens diameter som endast en signal. Avståndet måste vara åtminstone lika med diametern för en signal av normal storlek för att den ska räknas som två individuella signaler. När avståndet mellan två signaler är mindre än signalens diameter måste den räknas som en. - I kärnor med höga nivåer HER2-genamplifiering, kan HER2-signalerna ligga mycket nära varandra och bilda kluster av signaler. I dessa fall kan antalet HER2-signaler inte räknas utan måste uppskattas. Speciell uppmärksamhet måste ges åt de gröna signalerna eftersom kluster med HER2-signaler kan täcka de gröna signalerna och göra dem omöjliga att se. Vid tveksamhet ska du kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter. Poängsätt inte kärnor utan signaler eller med signaler med endast en färg. Räkna endast med de kärnor som har en eller fler FISH-signaler av varje färg. Signalräkningsguide 1 Räkna inte. Kärnorna överlappar, alla områden med kärnor syns inte 2 Två gröna signaler, räkna inte kärnor med signaler med endast en färg 3 Räkna som 3 gröna och 12 röda signaler (klusteruppskattning) 4 Räkna som 1 grön och 1 röd signal. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en. 5 Räkna inte (över- eller undernedbrutna kärnor). Eller Saknade signaler i mitten av kärnor (donut-formade kärnor). 6 Räkna som 2 gröna och 3 röda signaler. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en. 7 Räkna som 1 grön och 5 röda signaler 8 Räkna som 3 gröna (1 grön ej i fokus) och 3 röda signaler 9 Kluster med röda signaler som skymmer gröna signaler, kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITC filter eller räkna inte. ( ) P04090SE_01_K / s. 44/60

45 Magcancer Registrera räknade signaler i en tabell så som visas i Bilaga 5 och 6. Räkna 20 kärnor per vävnadsprov när det är möjligt från distinkta tumörområden. Beräkna HER2/CEN-17-förhållandet genom att dividera antalet röda HER2-signaler med det totala antalet gröna CEN-17-signaler. Prover med ett HER2/CEN-17-förhållande över eller lika med 2 bör anses HER2- genamplifierada (26). Resultat vid eller nära tröskelvärdet (1,8 2,2) bör tolkas med försiktighet. Om förhållandet är ett gränsfall (1,8 2,2) ska du räkna ytterligare 40 kärnor och räkna förhållandet för de 40 kärnorna. Om räkningen fortsätter att vara gränsfall, kommer resultatet för den andra bedömningen att vara giltigt. En immunhistokemisk färgning av HER2, om en sådan är tillgänglig, bör inkluderas för bättre inriktning under den andra räkningen. Vid tveksamhet bör provobjektglaset poängsättas på nytt. Vid gränsfall finns det anledning att låta patologen konsultera med den behandlande läkaren. Begränsningar - Mage 1. FISH är en flerstegsprocess som kräver specialutbildning i val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, preparation av FISH-objektglaset och tolkning av färgningsresultaten. 2. FISH-resultat är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan påverka probhybridiseringen. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder eller på inneboende oregelbundenheter i vävnaden. 3. För optimala och reproducerbara resultat måste vävnadspreparat avparaffineras fullständigt. Paraffinborttagningen måste vara klar vid början av färgningsprocessen. (Se BRUKSANVISNING, avsnitt B.2). 4. Endast temperaturkalibrerat vattenbad, värmeblock, och hybridiseringsugn bör användas. Användning av andra typer av utrustning kan resultera i avdunstning av HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix under hybridiseringen och måste valideras av användaren. Prestandaegenskaper - Mage Bakgrund Säkerheten och effektiviteten av trastuzumab (Herceptin ) har påvisats i en klinisk studie (ToGA-prövningen) (25). Studien var utformad som en öppen, randomiserad, multicenter fas IIIstudie av HER2-positiva patienter med långt framskriden lokal cancer som ej går att operera, recidiverande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller gastroesofageala förbindelsen. I ToGA-prövningen definierades HER2-positivitet som antingen IHC-positiv (3+), (HercepTest, Dako) och/eller positiv genom HER2 FISH (HER2/CEN )(HER2 FISH pharmdx Kit, Dako (kod K5331)). Efter inklusion i studien randomiserades patienterna för att få kemoterapi (5-FU eller capecitabin och cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Den primära slutpunkten i studien var total överlevnad (OS). I studien randomiserades sammanlagt 594 patienter och 584 patienter erhöll studieläkemedlet och inkluderades i FAS (Full Analyses Set) (full analysuppsättning). För den primära slutpunkten visade sig kombinationen av kemoterapi plus trastuzumab vara statistiskt överlägsen jämfört med behandling med endast kemoterapi. OS-medeltalet ökade från 11,1 till 13,8 månader (p=0,0046) med ett riskförhållande på 0,74 (95 % KI: 0,60 0,91). Kaplan-Meier-kurvorna för OS visas i figur 3. ( ) P04090SE_01_K / s. 45/60

46 Magcancer Överlevnadsprobabilitet 1,0 0,9 0,8 0,7 Logg-ranktest P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (månader) nr kvar Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgrupp Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 3. Kaplan-Meier-kurva för OS (n=584). För-specificerade explorativa analyser av undergrupper enligt HER2-status utfördes när data fanns tillgänglig och dessutom definierades två nya HER2-undergrupper post hoc baserat på IHC-poängsättning: Grupp 1 ( grupp med låg HER2- expression ): Grupp 2 ( grupp med hög HER2- expression ): IHC 0/FISH+ och IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ och IHC 3+ (FISH+ eller FISH - eller FISH inget resultat)(n=446) När den primära analysen av OS upprepades post hoc för gruppen med hög HER2-expression (n=446) noterades en större fördel med den kombinerade behandlingen. OS-medeltalet för patientgruppen som hade fått kemoterapi plus trastuzumab ökade till 16,0 månader jämfört med 11,8 månader för patienter som endast fick kemoterapi. Riskförhållandet för denna analys minskade till 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meier-kurvorna för OS för gruppen med hög HER2-expression visas i figur 4. ( ) P04090SE_01_K / s. 46/60

47 Magcancer Överlevnadsprobabilitet 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (månader) nr kvar Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgrupp Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 4. Kaplan-Meier-kurvorna för OS för gruppen med högt HER2-uttryck (n=446). BO18255-studien påvisade den kliniska nyttan av både HercepTest och HER2 FISH pharmdx kit för bedömning av HER2-status hos patienter med lokalt framskriden cancer som ej går att operera, recidiverande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller gastroesofageala förbindelsen. Analytisk sensitivitet Den analytiska känsligheten hos HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix undersöktes med hjälp av 18 adenokarcinomprover från gastrisk cancer. Förhållandet mellan antalet HER2-signaler och CEN-17-signaler beräknades baserat på räkning av 20 kärnor från normala celler som omger tumören. HER2/CEN-17-förhållandet för de 18 adenokarcinomproverna från gastrisk cancer var mellan 0,95 och 1,06. Analytisk specificitet HER2 -DNA proberna i HER2 /CEN-17 IQISH Probe Mix har ändsekvenserats och kartlagt för att bekräfta att de täcker totalt 218 kb inklusive HER2 -genen. CEN-17 PNA-proberna i HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix har testats individuellt och i kombination för att bekräfta deras specifika hybridisering till den centromeriska regionen hos kromosom 17. Studier utfördes på adenokarcinomprover från magcancer med användning av flaska 3, innehållande hybridiseringsbufferten men utan probmixen, för att mäta analysens förmåga att ensam identifiera målsubstanserna HER2 och CEN-17 utan interferens från andra substanser. Totalt 18 prover utvärderades för närvaro av signaler som inte var relaterade till probmixen. Ingen detektion av andra kromosommål eller interferens med nära relaterade substanser observerades i några av de 18 proverna. Härdighetsstudier Härdigheten av HER2 IQFISH pharmdx -analysen testades genom att variera förbehandlingstid, temperatur och metoder för uppvärmning av förbehandlingsbuffert (mikrovågsugn eller vattenbad), pepsininkubationstid och metod (bruksfärdigt pepsin eller nedsänkning), denatureringstemperatur och tid, hybridiseringstid samt stringenttvättid och temperatur. Inga signifikanta skillnader i resultat observerades vid följande experimentella tillstånd: ( ) P04090SE_01_K / s. 47/60

48 Magcancer Förbehandlingsmetod A) Vattenbad i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 95 C, C samt 99 C, tillsammans med 9, 10 o ch 11 minuter vid C. Förbehandlingsmetod B) Mikrovågsugn i 9, 10 och 11 minuter vid > 95 C. Pepsinnedbrytningsmetod A) med inkubationstider på 5, 10 och 15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Pepsinnedbrytningsmetod B) med inkubationstider på 3, 4 och 5 minuter vid 37 C). Pepsin nedbrytningsmetod C) med inkubationstider på 20, 25 och 30 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 35, 37 och 39 C. Denaturering i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 65, 66 och 67 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid 66 C. Hybridiseringstider på 60, 90 och 120 minuter vid 45 C. Stringenttvätt i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 61, 63 och 65 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid 63 C. Obs! I härdighetstesterna ändrades endast en parameter i färgningsproceduren åt gången medan alla andra parametrar behölls oförändrade. Vi rekommenderar att tiden och temperaturerna som anges i färgningsproceduren följs. Färgningsproceduren för HER2 IQFISH pharmdx erbjuder protokollvariabler för värmeförbehandling, pepsinnedbrytning samt hybridiseringstid. Varje unika kombinationsalternativ har validerats med hänsyn till HER2-genstatus. Validering utfördes på 10 FFPE-prover av humant adenocarcinom i magen och den gastroesofageala förbindelsen för vart och ett av de 12 möjliga kombinationsalternativen. HER2 FISH pharmdx kit (K5331) användes som referens. HER2/CEN- 17-förhållande för varje individuellt prov visas i Figur 5. Korstabuleringar mellan de 12 testerna och referensfärgningen visade total överensstämmelse i HER2-genstatus på 100 % (10/10) med undre och övre two-tailed 95-procentiga konfidensgränser vid 78,3 % respektive 100 %. Kappavärde var 1,00 och McNemars test visade frånvaro av ensidighet (two-tailed p-värde på 1,00). Figur 5. Individuella HER2/CEN-17-förhållanden för 10 humana magadenokarcinomprover, som färgats med användning av de 12 kombinationsprotokollvariationerna som är möjliga med HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) (Test 1 12) och HER2 FISH pharmdx Kit (kod K5331) referens (R). Den vågräta linjen visar tröskelvärdet på 2,0. ( ) P04090SE_01_K / s. 48/60

49 Magcancer Repeterbarhet Repeterbarheten av HER2/CEN-17-förhållandet undersöktes med HER2 IQFISH pharmdx analysen med användning av seriella snitt av nio magadenokarcinomprover med antingen icke amplifierad eller amplifierad HER2-genstatus. Tredubbla snitt av varje prov testades i samma körning. Den genomsnittliga variationskoefficienten var 3,5 % för icke amplifierade prover (intervall från 1 % till 5 %) och 2,8 % för amplifierade prover (intervall från 1 % till 5 %). Repeterbarheten på seriella snitt av magadenokarcinomprover med olika tjocklek (2, 3, 4, 5, 6 och 7 µm) testades med HER2 IQFISH pharmdx. Den genomsnittliga variationskoefficienten av HER2/CEN-17-förhållandet var 4,5 % (intervall från 3 % till 6 %), dvs. inom samma intervall som för vävnad av samma tjocklek och inom de förinställda acceptanskriterierna. Reproducerbarhet HER2 IQFISH pharmdx -analysen testades för reproducerbarhet mellan partier och mellan observatörer, med användning av tre partier med HER2 IQFISH pharmdx och tre observatörer. Reproducerbarhet testades på nio olika magadenokarcinomprover med antingen icke amplifierad eller amplifierad HER2-genstatus. Den genomsnittliga variationskoefficienten för reproducerbarhet mellan partier var 3,8 % för icke amplifierade prover (intervall från 2 % till 7 %) och 1,8 % för amplifierade prover (intervall från 1 % till 3 %). Den genomsnittliga variationskoefficienten för reproducerbarhet mellan observatörer var 4,3 % för icke amplifierade prover (intervall från 3 % till 5 %) och 4,4 % för amplifierade prover (intervall från 2 % till 7 %). Magadenokarcinomprover bestod av 78,8 % resektion och 22,2 % biopsiprover. 55,6 % av proverna erhölls från mage och 44,4 % var från den gastroesofageala förbindelsen. Klinisk användbarhet Den kliniska användbarheten av Dako HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) undersöktes i en jämförande studie av med Dako HER2 FISH pharmdx kit (kod K5331). Studien inkluderade 79 magcancerprover bestående av olika typer av magadenokarcinomvävnad, dvs. adenocarcinom i mage eller gastroesofageala förbindelsen och resektioner eller biopsier med homogen eller heterogen (fokal eller mosaisk) signalfördelning. Tumörerna hade alla utvärderats för HER2- proteinexpressionstatus med användning av Dako HercepTest (kod K5207). Prover från var och en av de fyra IHC-poängsättningsgrupperna (0, 1+, 2+, 3+) inkluderades i studien. Korstabulering av HER2-status, som erhållits av de två analyserna, gav en total överensstämmelse på 98,7 % med undre och övre gränser för det 95-procentiga konfidensintervallet vid 94,2 % och 99,9 %. Kappa-värdet var 0,97 med undre och övre gränser för det 95-procentiga konfidensintervallet vid 0,92 och 1,00. P-värdet för McNemars test var 1,00, vilket talar för frånvaro av ensidighet mellan de två analyserna. ( ) P04090SE_01_K / s. 49/60

50 Magcancer Felsökning - Mage Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 1a. Kitet har exponerats för höga temperaturer under transport eller förvaring 1b. Mikroskopet fungerar inte korrekt - olämpligt filter insatt - fel lampa - kvicksilverlampan för gammal - smutsiga och/eller spruckna uppsamlingslinser - olämplig immersionsolja 1a. Kontrollera förvaringsförhållandena. Kontrollera att kolsyreis fanns närvarande när leveransen togs emot. Kontrollera att flaska 3 har förvarats vid -18 C i mörker. Kontrollera att flaska 2A och 5 har förvarats vid högst 2 8 C i mörker. 1b. Kontrollera mikroskopet och att de använda filtren är lämpliga för användning med kitets fluorokromer och att kvicksilverlampan är korrekt och inte har använts längre än sin förväntade livslängd. (se Bilaga 7). Kontakta mikroskopförsäljaren vid tveksamhet. 1c. Blekta signaler 1c. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starka ljuskällor. 1d. Felaktiga förbehandlingsförhållanden 1e. Avdunstning av probmix under hybridiseringen 1d. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 1e. Kontrollera fuktighetsnivån i hybridiseringskammaren 2. Inga gröna signaler 2a. Fel stringenttvättförhållanden 2a. Kontrollera att den rekommenderade stringent tvättemperaturen används och att täckglasen tas bort innan stringenttvätten utförs 3. Inga röda signaler 3a. Felaktiga förbehandlingsförhållanden 4. Områden utan signal 3a. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 4a. Probvolymen är för liten 4a. Se till att probvolymen är tillräckligt stor för att täcka området under täckglaset 4b. Luftbubblor infångades under probmixappliceringen eller monteringen 4b. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor, knacka försiktigt bort dem med en pincett ( ) P04090SE_01_K / s. 50/60

51 Magcancer Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 5. Överdriven bakgrundsfärgning 6. Dålig vävnadsmorfologi 7. Hög nivå av grön autofluorescens på objektglaset, inklusive områden utan FFPE-vävnad 5a. Olämplig vävnadsfixering 5a. Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används 5b. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt 5c. Stringenttvättemperaturen är för låg 5d. Långvarig exponering av hybridiserat snitt för starkt ljus 5b. Följ de avparaffinerings- och rehydreringsprocedurer som beskrivs i avsnitt B.2 5c. Se till att stringenttvättemperaturen är 63 (±2) C 5d. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starkt ljus. 6a. Felaktig pepsinbehandling 6a. Följ de rekommenderade inkubationstiderna för pepsin. Se avsnitt B.3, steg 2. Se till att pepsinet hanteras vid korrekt temperatur. Se avsnitt B.1 6b. Felaktig förbehandling kan resultera i otydligt eller grumligt utseende 6c. Alltför lång pepsinbehandling eller mycket tunna snitt kan göra att spökceller eller donut-celler visas. 7. Användning av utgångna eller ej rekommenderade objektglas 6b. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 6c. Förkorta inkubationstiden för pepsin. Se avsnitt B.3, steg 2. Se till att snittjockleken är 3 6 µm. 7. Säkerställ att det belagda objektglaset (Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-llysinbelagda objektglas) inte har gått ut. OBS! Om problemet inte kan hänföras till någon av ovanstående orsaker eller om de föreslagna åtgärderna inte löser problemet, kontakta Dakos tekniska service för ytterligare hjälp. ( ) P04090SE_01_K / s. 51/60

52 Magcancer Bilaga 4 Mage HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Protokoll - checklista Färgningskörning logg-id: Datum för körningen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 parti: Prov-ID: Utrustnings-ID: Datum för utspädning/utgångsdatum för 1 x Wash Buffer (flaska 6 utspädd 1:20): / Vävnad fixerad i neutralbuffrat formalin Ja Nej Steg 1: Förbehandling Datum för spädning/utgångsdatum för Pre-Treatment Solution (flaska 1 spädd 1:20) Uppmätt temperatur för Pre-Treatment Solution (95 99 C) om vattenbad används för uppvärmning Förbehandling (10 minuter), och avkylning (15 minuter) Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Steg 2: Pepsin Varaktighet av pepsinbehandlingen (flaska 2) vid 37 C eller Varaktighet av pepsinbehandlingen (flaska 2) vid rumstemperatur eller Varaktighet av pepsinnedsänkning vid 37 (±2) C Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Dehydrera glasen (3 x 2 minuter) i graderad serie etanol och lufttorka Vävnad fixerad i neutralbuffrat formalin Ja Nej Steg 3: HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix Applicera probmix (flaska 3), täckglas och förslut med täckglasförsegling / C minuter minuter minuter Uppmätt denatureringstemperatur (66 (±1) C) C Denaturering i 10 minuter Uppmätt hybridiseringstemperatur (45 (±2) C) C Hybridiseringstid (60 till 120 minuter) minuter ( ) P04090SE_01_K / s. 52/60

53 Magcancer Steg 4: Stringenttvätt Datum för utspädning/utgångsdatum för stringent tvättbuffert (flaska 4 utspädd 1:20) / Uppmätt temperatur för stringent tvättbuffert (63 (±2) C) C Stringenttvätt (10 minuter) efter borttagning av täckglas Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) C Dehydrera glasen (3 x 2 minuter) i graderad serie etanol och lufttorka Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium (flaska 5) och täck med täckglas minuter Kommentarer: Datum och namnteckning, Tekniker: ( ) P04090SE_01_K / s. 53/60

54 Magcancer Bilaga 5 - Mage HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Poängsättningsschema HER2 IQFISH pharmdx, K5731 parti: Färgningskörning - logg-id: Datum för körningen: Prov-ID: Karakterisering av signalfördelning i vävnad: Homogen: Heterogen - fokal: eller Heterogen - mosaik: Räkna signaler i 20 kärnor Kärnnr: Röd Grön (HER2) (CEN-17) Kärnnr: Totalt 1 10 Totalt Röd (HER2) Grön (CEN-17) För bestämning av HER2/CEN-17-förhållandet, räkna antalet HER2 -signaler och antalet CEN-17-signaler i samma 20 kärnor och dividera det totala antalet HER2 -signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Om HER2/CEN-17-förhållandet är ett gränsfall (1,8 2,2), ska du räkna ytterligare 40 kärnor och beräkna förhållandet på nytt (se poängsättningsschemat för omräkning). Ett förhållande vid eller nära gränsen (1,8 2,2) ska tolkas med försiktighet (se räkningsguiden). ( ) P04090SE_01_K / s. 54/60

55 Magcancer HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-förhållande TOTAL POÄNG (1-20) Förhållande < 2: HER2-genamplifiering observerades inte Förhållande 2: HER2-genamplifiering observerades Datum och namnteckning, Tekniker: Datum och namnteckning, Patolog: För riktlinjer för poängsättning: se Tolkning av färgning. ( ) P04090SE_01_K / s. 55/60

56 Magcancer Bilaga 6 - Mage HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Poängsättningsschema för omräkning HER2 IQFISH pharmdx, K5731 parti: Färgningskörning - logg-id: Datum för körningen: Prov-ID: Signaler i ytterligare 40 kärnor (1 40) Kärnnr: Röd HER2 Grön CEN-17 Kärnnr Röd HER2 Grön CEN-17 Kärnnr Röd HER2 Grön CEN-17 Kärnnr Totalt Totalt Totalt Totalt Röd HER2 Grön CEN-17 För bestämning av HER2/CEN-17-förhållandet, räkna antalet HER2 -signaler och antalet CEN-17-signaler i samma 40 kärnor och dividera det totala antalet HER2 -signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Rapportera de totala poängen från de 1-40 kärnorna i tabellen nedan. HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-förhållande TOTAL POÄNG (1 40) Förhållande < 2: HER2-genamplifiering observerades inte Förhållande 2: HER2-genamplifiering observerades Datum och namnteckning, Tekniker: Datum och namnteckning, Patolog: För riktlinjer för poängsättning: se Tolkning av färgning. ( ) P04090SE_01_K / s. 56/60

57 Magcancer Bilaga 7 - Mage HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar att följande utrustning används med HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Mikroskoptyp Epifluorescensmikroskop. 2. Lampa 100 watt kvicksilverlampa (håll reda på brinntiden). 3. Objektiv För screening av vävnaden kan fluorescens torr 10X eller fluorescens oljeimmersion 16X objektiv användas. För högre förstoring och räkning av signaler rekommenderas endast fluorescens oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 100X. 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI filter i kombination med ett Texas Red-/FITCdubbelfilter av hög kvalitet. DAPI-filter, t.ex. Chroma-filter nr Texas Red/FITC dubbelfilter, t.ex. Chroma-filter nr Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse. Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är mycket viktigt för tolkningen. Om du vill ha detaljerad information ska du kontakta din mikroskopleverantör eller din Dako-representant. 5. Olja Icke-fluorescerande olja Försiktighetsåtgärder En 50 W kvicksilverlampa rekommenderas inte. Rhodaminfilter kan inte användas. Trippelfilter rekommenderas inte. Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunden ska övervaka och följa tillverkarens rekommendationer för kvicksilverlampan. Mikroskopet ska underhållas och kvicksilverlampan ska vara rätt inriktad innan du försöker tolka resultaten. Man ska sträva efter att exponera provet så lite som möjligt för excitationsljuset för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar uppställningen av ditt särskilda mikroskop med tillverkaren innan du börjar med fluorescerande in situ hybridisering, eller tittar i litteraturen. ( ) P04090SE_01_K / s. 57/60

58 Referenser 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730): King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717): Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4): Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12): Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785): Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3): Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14): Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2): Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER- 2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12): Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12): Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1): Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6): Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1): ( ) P04090SE_01_K / s. 58/60

59 23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3): Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2): Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7): ( ) P04090SE_01_K / s. 59/60

60 Symbolförklaring Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod In vitro diagnostisk medicinsk apparat Får ej förvaras i direkt solljus (se avsnittet Förvaringsförhållanden) Använd före Läs instruktionema för användning Innehållet räcker till <n> tester Tillverkare Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Tillverkad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tel Fax ( ) P04090SE_01_K / s. 60/60