Zymed SP T-Light HER2 CISH TM -Kit ( ) Lämpar Sig För 20 objektglas

Transkript

1 Zymed SP T-Light HER2 CISH TM -Kit ( ) Lämpar Sig För 20 objektglas I. AVSEDD ANVÄNDNING För användning vid in vitro-diagnostik Zymeds SP T-Light HER2 CISH TM -Kit är avsedd att detektera HER2-genamplifikation i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadssnitt med hjälp av kromogen In Situ-hybridisering (CISH ). En kvalificerad patolog måste göra en tolkning i enlighet med patientens kliniska sjukdomshistoria. II. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Bakgrund HER2 Den humana genen HER2, eller c-erbb-2, och den råttmotsvarande genen, neu, har identifierats som proto-onkogener (2-4) som delar homologi med den nära besläktade v-erbb-onkogenen. (2) HER2-genen finns på kromosomen 17 (17q12-21) och kodar ett 185 kda-membranreceptor-liknande protein. HER2 har tyrosinkinasaktivitet och delar homologi med, men skiljer sig från, den epiderma tillväxtfaktorreceptorn (kallas EGFr, HER1 eller c-erbb-1). (3) HER2-genamplifikation eller över-expression av HER2-protein har identifierats i % av invasiva bröstcancerfall, enligt en serie bestående av 52 publicerade studier med mer än patienter och användning av olika metodologier. (5) Identifikation av HER2-gen- och proteinstatus är viktig när man gör prognos för en patient som diagnostiserats med invasiv bröstcancer, samt när man väljer en undergrupp bland dem med metastas och överexpression av HER2 och/eller amplifikation för behandling med trastuzumab (Herceptin, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA), (5-7) en monoklonal antikropp riktad mot HER2-protein. Trastuzumab har endast visat sig vara en effektiv behandling för patienter vars tumörer uppvisar HER2-genamplifikation och/eller över-expression av HER2-protein. (10) Därför har noggranna, konsekventa och direkta metoder för utvärdering av gen- och proteinstatus för HER2- blivit allt viktigare. Subtraction Probe Technology (SPT ) Zymeds SPT är en äganderättsskyddad och patenterad teknik som skapar specifika probe genom att eliminera repetitiva sekvenser (t.ex. Alu- och LINE-element) som finns i humannukleinsyra. Följaktligen är Zymed SPT -probe inherent specifika och kräver inte repetitiv sekvensblockering, som fallet är med traditionella, cytogena DNA-probe. Zymeds SPT -teknik möjliggör utvärdering av genetiska abnormiteter med hjälp av kromogen detektion. DNA-probebeskrivning och -specificitet Zymeds SP T-Light HER2-probe (reagens A) är en dubbelsträngad DNA-probe som har märkts med digoxigenin. Den levereras som en vätska i hybridiseringsbuffert. Den har visat sig innehålla HER2-genen av PCR och binder sig specifikt vid HER2-genelokus på kromosom 17q12-21 av metafas-fish i normala lymfocyter. Repetitiva nukleinsyrasekvenser har avlägsnats kvantitativt från proben med SPT -teknik. Principen för CISH TM -proceduren (kromogen in situ-hybridisering) Kromogen in situ-hybridisering (CISH TM ) tillåter detektion av genamplifikation, kromosomtranslokation och kromosomantal med hjδlp av konventionella peroxidasreaktioner under brightfield-mikroskop pε formalinfixerade, paraffininbδddade (FFPE) vδvnader (4-5 µm tjocklek). Den vδsentliga egenskapen i CISH TM är förmågan av märkta nukleinsyraprober att hybrideras (binda), in situ, vid specifika sektioner av komplementär nukleinsyra i provet. Man kan se probehybridiseringsresultat inom kontexten av den omgivande vävnadens morfologi. Därför kan patologer granska vävnadsmorfologi och genabnormiteter samtidigt. CISH TM -färgningsresultat kan visualiseras tydligt med ett standard brightfield-mikroskop och en 40x torr lins. Eftersom DAB-signalen är permanent kan resultaten förvaras under en längre period, varvid en permanent testpost skapas. Med CISH TM -immunodetektionsteknik är resultatanalysen både snabb och lätt. Den viktigaste fördelen med CISH TM är att detektion av genetiska avvikelser samt verifikation av histopatologi kan göras samtidigt. Tumörer med HER2-genamplifikation visar sig i allmänhet som stora peroxidaspositiva intranukleära genkopiekluster, som flera enskilda, peroxidaspositiva, små signaler eller som en blandning av kluster och enskilda genkopior. Tumörer med svag HER2-amplifikation har i allmänhet 6 till 10 genkopior per kärna. Tumörer med normal HER2-genstatus har i allmänhet 1 till 2 punkter per kärna, medan tumörer med kromosom 17 polysomi uppvisar 3 till 5 HER2-genkopior per kärna. III. REAGENSER SOM TILLHANDAHÅLLS 4/6/2005 Copyright 2005, Zymed Laboratories PIN: 31265

2 Zymeds SP T-Light HER2 CISH TM -Kit är en fullständig kit som inkluderar alla nödvändiga reagenser och buffertar i smidiga, lättanvända format, inklusive vävnadsförbehandlingsreagenser, HER2-probe, detektionsreagenser och motfärgningslösning. Peroxidasdetektionssystemet utnyttjar Zymeds äganderättsskyddade, mycket känsliga HRPpolymerdetektionsmetod och DAB för signalutveckling. Kit inkluderar även formalinfixerade, paraffininbäddade kontrollobjektglas med både HER2-icke-amplifierade och synnerligen starkt amplifierade bröstcancercellinjer på varje objektglas. En nyckelkomponent i kit är tolkningsguiden i helfärg som utformats för att assistera vid tolkning av HER2 CISH TM -resultat. Reagens A. 0,4 ml digoxigeninmärkt SP T-Light HER2-probe (klar för användning) Reagens B. 1 l värmebehandlingslösning, ph 7,0 (klar för användning) Reagens C. 500 ml SSC-buffert (klar för användning) Reagens D. 100 ml Mayer s Hematoxylin (klar för användning) Reagens E. 1 förpackning PBS-pulver (för 1 liter PBS) Reagens F. 5 ml enzymförbehandlingsreagens (klar för användning) Reagens G. 3 ml CAS-Block TM (klar för användning) Reagens H. 3 ml mus-anti-digoxigenin antikropp (klar för användning) Reagens I. 3 ml polymeriserad HRP-anti-mus-antikropp (klar för användning) Reagens J1. 1 ml koncentrat substratbuffert (20x) Reagens J2. 1 ml koncentrat DAB-lösning (20x) Reagens J3. 1 ml 0,6 % väteperoxid (20x) Reagens K. 4 ml Histomount TM -monteringslösning Reagens L. 2 procedurkontrollcellobjektglas, formalinfixerade, paraffininbäddade, vart och ett med både HER2- icke-amplifierade och starkt amplifierade bröstcancercellinjer IV. REAGENSER/MATERIAL OCH UTRUSTNING SOM KRÄVS MEN INTE TILLHANDAHÅLLS Hjälpreagenser/material Zymed kat. nr 1. SuperFrost Plus-objektglas ELLER HistoGrip TM -objektglasadhesiv [Alternativ] Positiv vävnadskontroll: FFPE-vävnadssnitt med HER2-genamplifikation 3. [Alternativ] Negativ vävnadskontroll: FFPE-vävnadssnitt utan HER2-genamplifikation 4. Avjoniserat eller destillerat vatten (dh 2 O) 5. Xylen %, 85 %, 95 % och 100 % etanol (EtOH) 7. Täckglas, gummicement, 18G ½-tumsnål och 5 ml-spruta ELLER 8. [Alternativ] UnderCover -objektglas (18x18 mm) [Alternativ] UnderCover -objektglas (22x22 mm) % väteperoxid (H 2 O 2 ) % metanol % Tween Utrustning 1. Timer 2. Pipett (p20, p1000) 3. Pipettspetsar 4. Objektglasstativ 5. Het platta, aluminiumfolie och 1-litersbägare 6. Objektglasvärmare C-inkubator 8. Värmeelement med digitaltemperaturskärm och luftfuktighetsobjektglaslåda ELLER PCR-värmeskåp för termisk cykling med ett objektglasställ 9. Vattenbad (med kapacitet för att upprätthålla C-temperatursområde) 10. Coplin-kärl och färgningskärl 11. Brightfield-mikroskop V. FÖRVARING Förvara SP T-Light HER2-proben (reagens A) vid -20 C

3 Förvara reagenser B, C och D vid rumstemperatur. Förvara andra komponenter (reagenser E-L) vid 2-8 C Notera att vid -20 C, så fryser inte SP T-Light HER2-proben (reagens A), och förblir i ett flytande tillstånd, så att inga associerade frysnings-/upptiningsproblem uppstår. Använd inte kit efter det utgångsdatum som tryckts på etiketten. Om produkter förvaras under andra förhållanden än dem som specificeras på bipacksedeln måste användaren verifiera dessa förvaringsförhållanden. VI. BRUKSANVISNING A. PROVPREPARATION Paraffininbäddade vävnadssnitt: i. Vävnader fixerade i neutralt buffrat formalin i timmar före paraffininbäddning är lämpliga för bruk. Vävnadssnitt (4-5 µm tjocka) måste monteras på HistoGrip TM -behandlade eller Superfrost/Plusmikroskopobjektglas. ii. Lufttorka objektglasen eller torka vid 37 C, och baka sedan i 2-4 timmar vid 60 C. B. REAGENSPREPARATION PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) Lägg till 1 förpackning PBS-pulver (reagens E) till 1 liter dh 2 O. Blanda. PBS/Tween 20-buffert (0,025 %) Lägg till 1 del 50 % Tween-20 till 1999 delar PBS. Blanda. Substrat-kromogenlösning (DAB) Bered DAB genom att lägga till 1 droppe av varje reagens (J1, J2, J3) till 1 ml dh 2 O. Blanda väl. Denna lösning måste beredas omedelbart före användning. Alkoholserier Bered 70 %, 85 %, 95 % och 100 % etanol. 3 % H 2 O 2 i absolut metanol Lägg till 1 del av 30 % H 2 O 2 till 9 delar metanol. C. STANDARD CISH -PROTOKOLL FÖR FFPE-VÄVNADSPROV Alla reagenser utom reagens A (HER2-probe) bör ekvilibreras till rumstemperatur (RT) (20-25 C) före användning. HER2-proben kan användas kall och utan ekvilibrering till rumstemperatur. Varje inkubation måste utföras vid rumstemperatur (20-25 C), utom när annat anges. Om inget annat anges är det viktigt att vävnadssektionen inte dehydreras vid någon tidpunkt under förfarandet. 1. Förbehandling (endast för FFPE-vävnadssnitt) a) Avparaffinering: Sänk ned i xylen. två gånger, 5 minuter vardera Blötlägg i 100 % EtOH. tre gånger, 3 minuter vardera Tvätta i dh 2 O. tre gånger, 2 minuter vardera (Om du inte kan fortsätta med nästa steg omedelbart, lufttorka objektglasen efter det att de blötlagts i 100 % EtOH tre gånger i stället för att tvätta objektglasen i dh 2 O tre gånger.) b) Värmeförbehandling (Det mest kritiska steget för CISH -prestanda): Objektglasen/-proven måste kokas eller värmas upp till över 98 C under 15 minuter i CISH vävnadsförbehandlingslösning (reagens B). Vi rekommenderar att värmeplattan används för detta steg. (För protokoll som använder annan utrustning, kontakta Zymeds tekniska service på tech@zymed.com.) i. Placera objektglasen på objektglasstativet. ii. Värm upp förbehandlingslösningen (reagens B) i en bägare på en värmeplatta till den kokar och vid = 98 C. För att förhindra att bufferten avdunstar måste bägare täckas med antingen glas eller aluminiumfolie. iii. Placera objektglasen i den kokande lösningen, täck bägaren och låt koka i 15 minuter.

4 iv. Överför objektglasen omedelbart till dh 2 O vid rumstemperatur (20-25 C) och tvätta tre gånger, 2 minuter vardera c) Enzymdigestion (ett kritiskt steg för CISH -prestanda): För de flesta bröstvävnader gäller att en 10 minuter lång enzymdigestion vid rumstemperatur kommer att ge de bästa CISH-resultaten (tillsätt RT-pepsin till vävnadssnittet). Olika enzyminkubationstider (5-15 minuter) kan krävas, beroende på vävnadstyp och fixationsmetod. i. Ekvilibrera enzymförbehandlingsreagenset (reagens F) till rumstemperatur (20-25 C). ii. Tillsätt tillräckligt med reagens F för att täcka vävnadssnittet och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. iii. Tvätta i dh 2 O tre gånger, 2 minuter vardera d) Dehydrering i graderade etanolserier: 70 % EtOH 2 minuter 85 % EtOH 2 minuter 95 % EtOH 2 minuter 100 % EtOH 2 minuter 100 % EtOH 2 minuter e) Lufttorka objektglasen. 20 minuter f) Märk objektglasen med en penna. 2. Denaturering och hybridisering (Använd antingen en PCR-maskin med objektglasenhet ELLER värmeenhet med digitaltemperaturskärm och fuktkammare för objektglas med 37 C-inkubator) a) Tillsätt 15 µliter HER2-probe (reagens A) till mitten av täckglaset. (Beroende på vävnadens storlek kan det krävas mer eller mindre probe.) b) Placera täckglaset med probesidan vänd nedåt på ett lämpligt ställe på vävnadssnittet på objektglaset. c) Förhindra avdunstning under inkubationen genom att försegla täckglaset. Använd en 5 ml-spruta som innehåller gummicement och använd en 18G ½-tumsnål för att varsamt applicera ett tunt skikt gummicement längs täckglasets sidor så att skiktet överlappar objektglaset en aning. Låt gummicementet torka i ungefär 10 minuter så att täckglaset inte glider av objektglaset. ELLER Använd Zymed UnderCover Slips och skala av tejpen/täckglasets pappersskydd och klistra fast vid ett lämpligt område på objektglaset, så att vävnadssnittet täcks. Försegla genom att trycka ihop tejpkanterna. (När du använder Zymed UnderCover Slips, TRYCK INTE NED MOT MITTEN AV TÄCKGLASET.) d) Denaturera proben genom att inkubera objektglasen vid C i 5 minuter. (Gör detta genom att placera objektglasen i objektglasenheten i en PCR-maskin som inställts på C, eller på en Cvärmeenhet med digitaltemperaturskärm och inkubera i 5 minuter.) e) Placera objektglasen i objektglasenheten i en PCR-maskin och ställ in på 37 C samt inkubera i >10 timmar (över natten). ELLER Placera objektglasen i en fuktkammare inställd på 37 C i >10 timmar (över natten). 3. Stringenttvätt: a) Preparera två Coplin-kärl med SSC-buffert (reagens C), en vid rumstemperatur (RT), den andra uppvärmd till 75 C. (Öka temperaturen med 1 C per objektglas för mer än 2 objektglas, men överstig inte 80 C.) b) Skala varsamt av gummicementet efter hybridiseringen. Avlägsna täckglaset. (Om du använder Zymed UnderCover Slip, skala bara av tejpen från objektglaset för att avlägsna täckglaset.) Låt inte vävnadssnittet torka. c) Skölj snabbt objektglasen i kärlet som innehåller RT SSC, sänk sedan ner objektglasen under 5 minuter i kärlet med SSC vid 75 C. d) Tvätta objektglasen i dh 2 O. tre gånger, 2 minuter vardera 4. Immunodetektionsprocedur: a) Sänk ned objektglasen i 3 % H 2 O 2 i absolut metanol. 10 min. b) Tvätta i PBS/Tween 20 (0,025 %). tre gånger, 2 minuter vardera

5 c) Tillsätt CAS-Block TM (reagens G): 2-3 droppar/objektglas vid rumstemperatur. Blötlägg. 10 min. b) Torka av blockeringsreagens. SKÖLJ INTE. c) Tillsätt mus-anti-dig antikropp (reagens H): 2-3 droppar/objektglas vid rumstemperatur. Blötlägg. 30 min. d) Tvätta i PBS/Tween 20 (0,025 %). tre gånger, 2 minuter vardera e) Tillsätt polymeriserad HRP-anti-mus-antikropp (reagens I): 2-3 droppar/objektglas vid rumstemperatur. 30 min. f) Tvätta i PBS/Tween 20 (0,025 %). tre gånger, 2 minuter vardera g) Under tvätten, preparera DAB genom att tillsätta en droppe av vardera reagens (J1-J3) till 1 ml dh 2 O. h) Tillsätt substrat-kromogenlösning (DAB): 2-3 droppar/objektglas. Blötlägg. 30 min. i) Placera objektglasen i objektglasstativet. j) Tvätta med rinnande kranvatten. 2 min. 5. Motfärgning och täckning a) Motfärga vävnaden med hematoxylin (reagens D). 6 sek 1 min. Motfärgningstiden beror på vilken vävnad som används. Mörk motfärgning rekommenderas inte, eftersom detta kan dölja positiva färgningssignaler. b) Tvätta med rinnande kranvatten. 2 min. c) Dehydrera i graderade EtOH-serier. (70 %, 85 %, 95 %, 100 %, 100 %) 2 min. varje grad d) Sänk ned i xylen. två gånger, 2 minuter vardera e) Täck med Histomount -monteringslösning (reagens K). 6. Brightfield-mikroskopi Undersök hybridiseringsresultaten och vävnadsmorfologin samtidigt med ett brightfield-mikroskop och ett 40x torrt objektiv. D. TOLKNING AV CISH TM -RESULTAT (Se bilaga A för fig. A-G.) 1. CISH TM -signaler I CISH TM visas en enskild HER2-gen som en liten punkt (fig. D). HER2-genamplifikation kan i allmänhet ses som stora DAB-färgade genkluster (fig. A), flera enskilda punkter inom kärnan (fig. B), eller blandade kluster och flera kärnpunkter (fig. C). Tabell 1: Signalvisualisering Förstorning CISH-signal 10x Enskilda signaler är knappt synliga och kan lätt missas. 20x Enskilda signaler är små men kan tydligt urskiljas. 40x Enskilda signaler kan lätt identifieras. 60x eller 100x Inte nödvändigt. 2. Positiv kontroll Om en positiv vävnadskontroll, dvs. en vävnad som vi vet innehåller HER2-genamplifikation, används bör den undersökas först för att kontrollera att alla reagenser fungerar på avsett sätt. Förekomst av genkluster, eller 6 enskilda signaler, inom en enda cells kärnor, indikerar förväntad positiv reaktivitet. Om den positiva kontrollen inte kan påvisa klusterförekomst, eller 6 signaler per kärna, bör provresultaten anses vara ogiltiga. Allmänt talat gäller att förekomst av högst två genkopior i kärnor i normal vävnads motsvarighet till positiv vävnadskontroll, bekräftar att proben och immunodetektionsreagenserna inte korsreagerar med cell- eller vävnadskomponenter. Om icke-specifik färgning uppträder i kärnorna i normalvävnadsmotsvarigheten för positiv vävnadskontroll, bör provresultaten anses vara ogiltiga. Om icke-specifik fläckning sker manifesteras detta i allmänhet som diffus färgning. Ibland kan sporadisk färgning utanför kärnorna observeras i vävnadssnitt som har utsatts för alltför mycket formalinfixering. Ickespecifik färgning bör inte förväxlas med positiva CISH TM -signaler.

6 De inkluderade kontrollobjektglasen (reagens L) är två 3-4 µm snitt som utskurits från FFPE-cellblock preparerade från två olika bröstcancercellinjer. Dessa objektglas bör användas som procedurkontroller. Cellinje A är icke-amplifierad och har två punkter per kärna. Ett litet antal celler kommer att ha 3-5 punkter per kärna pga. mitos. Cellinje B är amplifierad och uppträder som stora DAB-kluster i kärnan. Värmeförbehandlingssteget bör utföras under 15 minuter medan enzymdigestionssteget bör utföras under 10 minuter vid rumstemperatur för att erhålla optimala resultat. Om kontrollobjektglaset (reagens L) är negativt, indikerar detta resultat att ett fel inträffade under CISH TM- proceduren. Om kontrollobjektglaset är positivt, men testobjektglasen är antingen negativa eller har svaga signaler, så skall enzymdigestionssteget justeras Se avsnitt VIII, Procedurtips och felsökning, på sidan 8 för mer information. Reagens L. CISH TM HER2 Kontrollobjektglas A B Bild 1. CISH TM HER-kontrollobjektglas (reagens L) med icke-amplifierad cellinje A och en synnerligen starkt amplifierad cellinje B. Notera att cellinjerna inte är skalenligt återgivna och att de är mindre än vad som anges i diagrammet. 3. Utvärdering av HER2-genstatus enligt CISH Tabell 2: Utvärdering av HER2-genstatus enligt CISH. Figurerna motsvarar den inkluderade tolkningshandledningen (bilaga A). Amplifikation >10 kopior eller stora kluster av HER2-genen förekommande per kärna i >50 % av cancerceller. Se fig. A, B och C. Låg amplifikation Ingen amplifikation 6-10 kopior av HER2-genen, eller ett litet HER2-genkluster, förekommande per kärna i >50 % av cancerceller. Se fig. F. Biotin-märkt SP T-Light kr.17 cen-probe kan användas i fall av svag HER2-amplifikation för att bekräfta att 6-10 kopior av HER2-genen (<5 % fall) är på grund av HER2-genamplifikation och inte pga. polysomi i kromosom 17. Se fig. G. 1-5 kopior av HER2-genen påvisades per kärna i >50 % av cancerceller. Se fig. D och E. Förekomsten av 3-5 kopior av HER2-genen per kärna är på grund av polysomi i kromosom 17. CISH TM med kr.17 cen-probe krävs inte för att bekräfta detta rön. Se fig. E. Ibland observeras 3-5 kopior av HER2-genen i samband med 1-2 kopior av kr. 17cen- i >50 % av cancerceller (HER2/Chr.17cen-kvoten är 2). Detta orsakas av duplikation av kromosomarmen 17q, (9) som påvisas av CGH (komparativ genomisk hybridisering). Se bilaga A för ett illustrerande flödesdiagram av tolkning av HER2 CISH TM -resultat. Polysomi, eller flera kopior av en hel kromosom, är en vanlig händelse i människocancer. Eftersom polysomi av kromosom 17 och/eller duplikation av kromosom 17q i cancer, i allmänhet resulterar i 3-5 HER2-genkopior per kärna och denna observation kan förväxlas med HER2-amplifickation, (1,8,9) kan Zymeds Chromosome 17 Centromeric Probe (kat. nr ) och CISH TM Centromeric Detection Kit (kat. nr ) användas i vissa fall av svag HER2-amplifikation för bekräftelse, för att skilja mellan HER2-genamplifikation och polysomi när 6-10 HER2-genkopior observeras per kärna. (1,8) VII. KVALITETSKONTROLL Variationer i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan leda till signifikanta skillnader i resultaten, vilket nödvändiggör regelbundna kontroller inom anläggningen i tillägg till följande procedurer. Den positiva signalens färg och typ kommer att vara beroende av den detektionsmetod som används. Se detektionskit bipacksedel för en beskrivning av den förväntade positiva signalen. Positiv (amplifikation) vävnadskontroll: Externa positiva vävnadskontrollmaterial bör tas från färska obduktions- /biopsi-/kirurgiprover som har fixerats, behandlats och inbäddats på samma sätt som provet. Vävnadsprover som behandlats på annat sätt än provet validerar endast reagensfunktion och verifierar inte vävnadspreparationsteknik.

7 Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt preparerade vävnader och riktig färgningsteknik. En positiv vävnadskontroll för varje uppsättning med testförhållanden bör inkluderas i varje körning. Vävnad som används som positiva kontrollmaterial bör väljas från prover med välkaraktäriserade HER2- genamplifikationsnivåer. Ungefär 25 % av bröstcancervävnad innehåller HER2-genamplifikation, detta kan vara en praktisk källa för positiv kontrollvävnad. Kända positiva vävnadskontroller bör endast användas för övervakning av korrekt funktion i behandlad vävnad och testreagenser, i stället för som ett hjälpmedel v id tolkning av provresultat. Om den positiva vävnadskontrollen inte kan påvisa positiv färgning bör provresultaten anses vara ogiltiga. VIII. PROCEDURTIPS OCH FELSÖKNING 1. Om inget annat anges är det viktigt att vävnadssektionen inte dehydreras vid någon tidpunkt under förfarandet. 2. Värmeförbehandling (Det mest kritiska steget för CISH -prestanda): Provet måste kokas eller uppvärmas till över 98 C under 15 minuter i värmeförbehandlingslösning (reagens B). Se sidan Enzymdigestion (Ett kritiskt steg för lyckade CISH -prestanda): Beroende på vävnadstyp och fixeringsmetod kan det krävas olika enzyminkubationstider (5-15 minuter). För de flesta bröstvävnader gäller att en 10 minuter lång enzymdigestion vid rumstemperatur ger de bästa CISH -resultaten. Kom ihåg att förvärma enzymförbehandlingsreagenset (reagens F) till rumstemperatur innan det läggs till vävnadssnittet. Enzymförbehandling av provet bör utvärderas omedelbart efter det att CISH TM -protokollet har fullgjorts. Om cellkärnorna inte motfärgas och CISH TM -signalen inte finns eller är mycket svag, kan detta orsakas av cellkärnsförlust som ett resultat av överflödig digestion. Om cellkärnorna är starkt motfärgade, men det inte finns en CISH TM -signal i kärnan, kan detta ha orsakats av underdigestion under pepsinförbehandlingen. Om optimala resultat inte uppnås kan enzymförbehandling även utföras vid 37 C i 3 minuter som ett alternativ. 4. Probedenaturering vid en lägre temperatur än vad som rekommenderas i protokollet kan resultera i en svag eller ingen CISH TM -signal alls. 5. Hybridisering utförd under kortare tidsperioder, eller strikta tvättningar utförda vid högre temperaturer, än vad som rekommenderas i protokollet kan leda till svagare eller ingen CISH TM -signal alls. 6. Kontakta en lokal distributör eller Zymed Laboratories, Inc. på tech@zymed.com eller för ytterligare teknisk support eller för produktlitteratur. IX. SÄKERHET OCH FÖRSIKTIGHET 1. Vidtag alla tillgängliga försiktighetsåtgärder vid hantering av reagenser. Använd handskar för engångsbruk, laboratorierock och skyddsglasögon vid hantering av misstänkta carcinogener. 2. Använd inte produkten efter utgångsdatum. 3. 3,3 -diaminobensidintetraklorid (DAB) kan vara farlig efter förtäring, inandning eller hudabsorption och kan irritera ögon, hud, slemhinnor och de övre luftvägarna DAB är ett misstänkt carcinogen. Konsultera lokala och statliga myndigheter angående avfallshantering. 4. 0,1-procentig natriumazid (NaN 3 ), som används som konserveringsmedel i denna kit, är toxisk vid förtäring. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparledningar och bilda mycket explosiva metallazider. I syfte att förhindra azidansamling i ledningar bör du spola med rikliga mängder vatten när produkten hälls ut. 5. Låt inte detta reagens komma i kontakt med ögon och slemhinnor. Spola med rikliga mängder vatten om reagenset kommer i kontakt med känsliga områden. 6. Denna produkt uppfyller inte OSHA:s kriterier (Occupational Safety & Health Administration) avseende farliga ämnen och därför behövs inget varuinformationsblad (MSDS). 7. Konsultera gällande lokala föreskrifter om bortskaffande av potentiellt toxiska komponenter. 8. Prover och alla material som kommer i kontakt med dem bör hanteras som infektiöst material och kasseras med iakttagande av lämpliga försiktighetsåtgärder. Pipettera aldrig med munnen. Se till att proben och vävnadsproverna inte kommer i kontakt med hud och slemhinnor. 9. Minimera mikrobiell kontamination för att undvika icke-specifik färgning. 10. Användning av ej angivna inkubationstider, koncentrationer och temperaturer kan leda till felaktiga resultat. Användaren måste validera dylika förändringar. X. BEGRÄNSNINGAR 1. CISH TM är en flerstegsprocedur som kräver specialiserad utbildning vid valet av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering och behandling av CISH TM -objektglas, samt tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnads- och cellfärgning beror på hantering och behandling av vävnadsprover före färgning. Felaktig fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, uppvärmning, sektionering eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan leda till artefakter, falskt-positiva eller falskt-negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan orsakas av variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller av inbyggda oregelbundenheter inom vävnadsprovet. 3. Alltför mycket eller ofullständig motfärgning kan påverka tolkningen av resultaten.

8 4. Alla avvikelser från rekommenderade testprocedurer kan ogiltigförklara förutsagda, förväntade resultat, lämpliga kontroller måste användas och dokumenteras. Användare som avviker från rekommenderade testprocedurer måste ta ansvar för tolkningen av provresultat under dessa omständigheter. 5. Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i samband med tidigare otestade vävnader. Möjligheten för oväntade reaktioner, även i testade vävnadsgrupper, kan inte elimineras fullständigt på grund av biologisk vävnadsvariabilitet. 6. Falsk-positiva resultat kan produceras genom icke-immunologisk bindning av detektionsproteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan även orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) eller endogen peroxidasaktivitet (cytokrom c). XI. REFERENSER 1. Tanner M, Gancberg D, DiLeo A, et al. Chromogenic in situ hybridization: A practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 157(5): , King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 229(4717): , Schechter AL, Hung MC, Vaidyanathan L, et al. The neu gene: An erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 229: , Semba K, Kamata N, Toyoshima K, et al. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factorreceptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. PNAS 82(19): , Ross JS, Fletcher JA. HER-2/neu (c-erb-b2) gene and protein in breast cancer. Am J Clin Pathol 112:S53-S67, Shak S. Overview of the trastuzumab (Herceptin) anti-her2 monoclonal antibody clinical program in HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Herceptin multinational investigator study group. Cancer Res 6:71-77, Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D, et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-her-2 overexpression in metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J Clin Oncol 17: , Zhao J, Wu R, Au A, et al. Determination of HER2 gene amplificaiton by chromogenic in situ hybridizaiton (CISH) in archival breast carcinoma. Mod Pathol 15(6): , Isola J, Chu L, DeVries S, et al. Genetic alterations in erbb2-amplified breast carcinomas. Clin Cancer Res 5: , Ross JS, et al. The HER-2/neu Gene and Protein in Breast Cancer 2003: Biomarker and Target of Therapy. The Oncologist 8: , Andra CISH TM- referenser: Tanner M, et al. Amplification of HER-2/neu and Topoisomerase IIα in primary and metastatic breast cancer. Cancer Res 61: , Kumamoto H, et al. Chromogenic in situ hybridization analysis of HER-2/neu status in breast carcinoma: Application in screening of patients for trastuzumab (Herceptin ) therapy. Pathol Int 51: , Cell Markers and Cytogenetics Committees, College of American Pathologists. Clinical laboratory assays for HER-2/neu amplification and overexpression. Arch Pathol Lab Med 126)7): , Palmu S, et al. Expression of C-KIT and HER-2 tyrosine kinase receptors in poor-prognosis breast cancer. Anticancer Res 22: , Savinainen KJ, et al. Expression and gene copy number analysis of ERBB2 oncogene in prostate cancer. Am J Pathol 160(1): , Dandachi N, et al. Chromogenic in situ hybridization: A novel approach to a practical and sensitive method for the detection of HER2 oncogene in archival human breast carcinoma. Lab Invest 82(8): , Korsching E, et al. Cytogenetic Alterations and Cytokeratin Expression Patterns in Breast Cancer: Integrating a New Model of Breast Differentiation into Cytogenetic Pathways of Breast Carcinogenesis. Lab Invest 82: , van de Vijver M. Emerging Technologies for HER2 Testing. Oncology 63 Suppl 1: 33-8, Gupta D, et al. Comparison of fluorescence and chromogenic in situ hybridization for detection of HER-2/neu oncogene in breast cancer. Am J Clin Pathol 119(3): 381-7, Joensuu H, et al. Amplification of erbb2 and erbb2 Expression Are Superior to Estrogen Receptor Status As Risk Factors for Distant Recurrence in pt1n0m0 Breast Cancer: A Nationwide Population-based Study. Clin Cancer Res 9(3): , Park K, et al. Topoisomerase Iiα (topoii) and HER2 amplifiation in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Can 39: , Arnould L, et al. Agreement between chromogenic in situ hybridization (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. Br J Can 88: , VARUMÄRKEN CISH, Clearmount, HistoGrip, Histomount, SP T-Light, SPT och Zymed är varumärken som tillhör Zymed Laboratories, Inc. SPT TM är en teknik patenterad av Zymed. CISH är en teknik som patentsökts. Kontakta den lokala distributören om du har frågor om den här produkten. Auktoriserad representant för IVDD 98/79/EC: MDSS Burckhardstr.1 D Hannover Tyskland