HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

Transkript

1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Kod GM333 Andra utgåvan HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är en direkt analys med fluorescerande in situhybridisering (FISH) utformad för kvantitativ bestämning av HER2-genamplifiering i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) prover av bröstcancervävnad och FFPE-prover från patienter med metastatiskt adenocarcinom i magen eller gastroesofageala förbindelsen. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) indikeras i samband med HercepTest vid bedömningen av patienter för vilka Herceptin -behandling övervägs. Flaskan innehåller reagens som räcker till 20 tester. Tillbehörsreagens som ska användas tillsammans med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Kod GM300 GM301 GM302 GM303 GM304 Produktnamn ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 1/54

2 Innehållsförteckning Sida Avsedd användning... 3 Tillvägagångssätt för proceduren - Bröst... 4 Reagens - Bröst... 5 Försiktighetsåtgärder - Bröst... 6 Förvaring - Bröst... 6 Provberedning - Bröst... 7 INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Bröst... 8 A. Reagensberedning - Bröst... 8 B. Färgningsprocedur - Bröst Kvalitetskontroll - Bröst Färgningstolkning - Bröst Begränsningar - Bröst Prestandaegenskaper - Bröst Felsökning - Bröst Bilaga 1 - Bröst Bilaga 2 - Bröst Sammanfattning och förklaring - Mage Procedurprincip - Mage Reagens - Mage Försiktighetsåtgärder - Mage Förvaring - Mage Provförberedning - Mage INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Mage A. Reagensberedning - Mage B. Färgningsprocedur - Mage Kvalitetskontroll - Mage Färgningstolkning - Mage Begränsningar - Mage Prestandaegenskaper - Mage Felsökning - Mage Bilaga 3 - Mage Bilaga 4 - Mage Bilaga 5 - Mage Referenser Symbolförklaringar ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 2/54

3 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är hybridiseringsproben för den automatiserade direkta fluorescerande in situ-hybridiseringen (FISH) på Dako Omnis-instrument och är, tillsammans med tillbehörsreagensenheter, utformad för kvantitativ bestämning av HER2-genamplifiering i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) prover av bröstcancervävnad och FFPE-prover från patienter med adenocarcinom i magen, inklusive gastroesofageala förbindelsen. HER2 IQFISH pharmdx indikeras i samband med HercepTest vid bedömningen av patienter för vilka Herceptin (trastuzumab) behandling övervägs (se produktbladet för Herceptin ). För bröstcancerpatienter är resultaten från HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) avsedda som ett komplement till den kliniska patologiska informationen som för närvarande används för att uppskatta prognosen i stadium II, nodpositiva bröstcancerpatienter. Adenocarcinom i magen eller den gastroesofageala förbindelsen kallas även magcancer i detta dokument. För tillämpning vid bröstcancer, se sidorna För tillämpning vid magcancer, se sidorna Viktigt: Observera skillnaderna för bröstcancervävnad och magcancervävnad, särskilt vid tolkningen av färgade snitt ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 3/54

4 Bröstcancer Sammanfattning och förklaring - Bröst Den humana HER2 -genen (också kallad ERBB2 eller NEU) sitter på kromosom 17 och kodar HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet är en membranreceptor tyrosinkinas med homologi till den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genen finns närvarande i två kopior i alla normala diploida celler. I en andel av patienter med bröstcancer är HER2 -genen amplifierad som en del av den maligna omvandlingsprocessen och tumörprogressionen (3-8). HER2-genamplifiering leder i allmänhet till överuttryck av HER2-proteinet på ytan av bröstcancerceller (9). Amplifiering av HER2-genen och/eller överuttryck av dess protein har påvisats i % av bröstcancrar (10). Denna uppreglering associeras med dålig prognos, ökad risk för återfall och förkortad överlevnad. Åtskilliga undersökningar har visat att HER2-status korrelerar med känslighet eller resistens mot vissa kemoterapibehandlingar (11). Påvisande av högt HER2-proteinöveruttryck eller HER2-genamplifiering är väsentligt för att behandling med Herceptin, en monoklonal antikropp mot HER2-protein, ska inledas. Kliniska undersökningar har visat att patienter vars tumörer har hög HER2-proteinöveruttryck och/eller amplifiering av HER2-genen har störst nytta av Herceptin (12). Den här produkten (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) är en IQISH-probmix för automatiserad direkt FISH-detekterande HER2-genamplifiering. Den här produkten ska användas tillsammans med de specificerade tillbehörsreagensen på Dako Omnis och härleds från den manuellt utförda HER2-genamplifieringsanalysen, HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731. Tillvägagångssätt för proceduren - Bröst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är en IQISH-probmix bestående av en blandning av Texas Red-märkta DNA-prober som täcker en 218 kb region, inklusive HER2-genen på kromosom 17 och en blandning av fluoresceinmärkta peptidnukleinsyraprober (PNA) (13) som är riktade mot den centromeriska regionen hos kromosom 17 (CEN-17). Den specifika hybridiseringen till de två målen resulterar i bildandet av en distinkt röd fluorescerande signal vid varje HER2-genlokus och en distinkt grön fluorescerande signal vid varje kromosom 17-centromer. Utvärdering av HER2-genamplifiering med hjälp av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), är en helautomatiserad metod på Dako Omnis-instrumentet. Tre olika validerade HER2 FISHfärgningsprotokoll kan väljas i programvaran till Dako Link Omnis-arbetsstationen. Protokollen skiljer sig bara i tiden för nedbrytning med pepsin, följaktligen kan nedbrytning med pepsin i 10 min (protokollet Short (kort)), 15 min (protokollet Medium (medellångt)) eller 20 min (protokollet Long (långt)) väljas (mer information finns nedan). Protokollet Medium (medellångt) rekommenderas för inledande analys. Efter färgningen på Dako Omnis monteras proverna med Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) som innehåller 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och förses med täckglas. Med hjälp av ett fluorescensmikroskop försett med lämpliga filter (se Bilaga 2) lokaliseras tumörceller och räkning av röda (HER2) och gröna (CEN-17) signaler utförs. Sedan beräknas HER2/CEN-17- kvoten. Normala celler i det analyserade vävnadssnittet tjänar som en intern positiv färgningskontroll. Ytterligare information finns i avsnittet Tolkning av färgningen. Se användarhandboken till Dako Omnis för detaljerade instruktioner om laddning och uttagning av objektglas, ISH Lid (Dako Omnis), reagens, bulkvätska och avfallsflaskor. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 4/54

5 Bröstcancer Reagens - Bröst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagens kan beställas separat som enskilda reagens. Medföljande material HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, bruksfärdig mix av Texas Red-märkta HER2 DNAprober och fluoresceinmärkta CEN-17 PNA-prober, som levereras i IQISH-hybridiseringsbuffert. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) levereras på torris. För att garantera att reagenset inte har utsatts för höga temperaturer under transporten ska det fortfarande finnas torris kvar vid mottagandet. Reagensflaskor med tinat innehåll ska alltid förvaras och hanteras i upprätt läge. Reagensflaskan innehåller en guldbelagd metallkula som möjliggör reagensblandning med hjälp av Dako Omnis Mixing Device (se användarhandboken till Dako Omnis Mixing Device). Det är viktigt att reagenset blandas ordentligt innan det laddas på Dako Omnis. Material som behövs men inte medföljer Tillbehörsreagens Följande reagens behövs på Dako Omnis-instrumentet för att utföra HER2-genamplifieringsanalys med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, koncentrerad 20x; ska spädas ut 1:20 i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska (kod GC109). Produkten innehåller ett antimikrobiellt medel och inert grön färg för enkel identifiering och användarvänlighet. ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis): 14 ml av 96 % etanol (bruksfärdig). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml Pepsin A-lösning (bruksfärdig), ph 2,0; innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Pepsin levereras på torris. För att garantera att reagenset inte har utsatts för höga temperaturer under transporten ska det fortfarande finnas torris kvar vid mottagandet. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml saltlösning-natriumcitrat-buffert koncentrerad 20x; ska spädas ut 1:20 i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska (kod GC109). Produkten innehåller ett antimikrobiellt medel, ett rengöringsmedel och inert gul färg för enkel identifiering och användarvänlighet. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorescensmonteringsmedium (bruksfärdigt) med DAPI. Även om ovannämnda reagens inte medföljer HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), beskrivs de kortfattat nedan. Läs bruksanvisningen för varje enhet för ytterligare information. Extra reagens och utrustning Dako Omnis, kod GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kod GC807 Clearify, kod GC810 Dako Omnis Mixing Device, kod GC116 ISH Lid, kod GC102 ISH Cleaning Solution, kod GC207 Täckglas för montering (24 mm x 50 mm) Se den grundläggande och den avancerade användarhandboken för Dako Omnis för användning av extra reagens och enheter. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 5/54

6 Bröstcancer Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI och FITC/Texas Red dubbelfilter, eller FITC och Texas Red monofilter - se Bilaga 2 för detaljer. Användning av DAPI-filter vid hög förstoring påverkar signalintensiteten negativt. Långa exponeringstider ska undvikas. Fluorescensmikroskop en kvicksilverlampa på 100 watt som ljuskälla ska användas. Andra ljuskällor rekommenderas inte med dessa filter. Mikroskopglasfolder (kartongbricka med gångjärnsförsett lock och plats för 20 objektglas eller liknande). Försiktighetsåtgärder - Bröst 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) innehåller 10-<25% ethylene carbonate och 3- <5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är märkt: Varning H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera P338 minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet. 4. Vävnadsprover, före och efter fixering, samt alla material som utsatts för dem, ska hanteras som om de kan överföra infektion och de ska undanskaffas med lämpliga försiktighetsåtgärder (14). Pipettera aldrig reagens med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagens och prover. Om reagens kommer i kontakt med känsliga områden ska du tvätta med stora mängder vatten. 5. Minimera mikrobiell kontaminering av reagens för att undvika felaktig färgning. 6. Vävnadsfixeringsmetoder och provtjocklekar som är annorlunda än de specificerade kan påverka vävnadsmorfologi och/eller signalintensitet. 7. Reagenset har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan leda till sämre funktion. 8. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Ytterligare information finns i säkerhetsdatabladet (SDS). 9. Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala, statliga och överstatliga föreskrifter. Förvaring - Bröst Förvara HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vid < 18 C ( 18 C till 25 C rekommenderas) i mörker. Håll alltid flaskan med tinat reagens upprätt. Frysning och upptining av reagens upp till 10 gånger påverkar inte resultatet. Lämna inte denna komponent i rumstemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagensen: ISH Pepsin (Dako Omnis) och Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påverkas negativt om de utsätts för värme. Lämna inte dessa komponenter i rumstemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagenset Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påverkas negativt om det utsätts för mycket ljus. Förvara inte dessa komponenter och utför inte analysen i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 6/54

7 Bröstcancer Förvara tillbehörsreagensen ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) och Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) i mörker vid 2 8 C. F örvara ISH Pepsin (Dako Omnis) vid C. Flaskans lock, inklusive snäpplocket, ska vara stängt för alla reagens under förvaring. Utspädda lösningar (ISH Stringent Wash Buffer arbetslösning och ISH Pre-Treatment Solution arbetslösning) kan förvaras vid 2-8 C i 30 dagar. Använd inte några reagens efter det utgångsdatum som är tryckt på reagensets behållare. Under lagring ska reagensets lock, inklusive snäpplocket, vara stängt. Användaren måste kontrollera reagensprestanda om reagensets förvaringsförhållanden avviker från vad som specificerats (15). Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normala celler i det analyserade vävnadssnittet. Om ett oväntat fluorescensmönster observeras som inte kan förklaras och ett problem med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eller dess tillbehörsreagens misstänks kontaktar du Dakos tekniska support Stabilitet i Dako Omnis-instrumentet Stabiliteten i instrumentet för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagensen ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) och ISH Pepsin (Dako Omnis) är 80 timmar. Stabiliteten i instrumentet för ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) och ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) är 7 dagar. Dako Omnis-programvaran håller reda på kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet. Användning av utgångna reagens resulterar i en varning från Dako Omnis-instrumentet, alla objektglas som färgats med utgångna reagens kommer att ändra status till misstänkta och objektglasloggen på arbetsstationen visar att ett utgånget reagens har använts. Provberedning - Bröst Prover från biopsier, excisioner eller resektioner måste hanteras så att vävnaden bevaras för FISH-analys. Standardmetoder för vävnadsbehandling för immuncytokemisk färgning ska användas för alla prover (16). Paraffininbäddade snitt Endast vävnad som konserverats i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddats lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis göras till block med en tjocklek på 3-4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Vävnaderna dehydreras i en graderad serie av etanol och xylen, följt av infiltrering av smält paraffin, som hålls vid högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader har obegränsad hållbarhet före snittning och montering på objektglas om de förvaras svalt (15-25 C) (16-17). Andra fixeringsmedel är inte lämpliga. Vävnadsprover ska snittas i 4-6 µm. Objektglasen som krävs för HER2-genamplifieringsanalys och bekräftelse av tumörnärvaro ska förberedas samtidigt. Minst två seriella snitt rekommenderas, ett snitt för tumörnärvaro färgat med hematoxylin och eosin (H&E-färgning), samt ett snitt för HER2 -genamplifieringsanalys. Vi rekommenderar att vävnadssnitt monteras på Dako FLEX IHC Microscope Slides, kod K8020. Superfrost Plus objektglas (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) är också lämpliga. Se till att objektglasens utgångsdatum inte har passerat. Proverna ska analyseras inom <6 månader efter att snitten skapats vid förvaring vid 2 25 C. OBS! Vävnadsproverna måste placeras på glaset inom det definierade färgningsområdet på glaset. Se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för dimensioner på färgningsområdet för objektglas. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 7/54

8 INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Bröst Bröstcancer A. Reagensberedning - Bröst A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Flaskan med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) innehåller en guldbelagd metallkula som används för blandning. Innan flaskan laddas på Dako Omnis måste reagenset vara tinat och ordentligt blandat eftersom det fassepareras under frysning. Använd Dako Omnis Mixing Device för probblandning. Följ proceduren nedan för probblandning på Dako Omnis Mixing Device och se blandningsenhetens användarhandbok för mer information. 1. Ta ut flaskan med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ur frysen. 2. Ladda flaskan på Dako Omnis Mixing Device. 3. Anslut blandningsenheten och kontrollera att den gröna statuslampan lyser Välj programmet Thaw + mix ( Tina + blanda ). Viktigt: Flaskor som lagras under -25 C ska tinas (endast precis) innan flaskan laddas på Dako Omnis Mixing Device och programmet Mix ( Blanda ) ska användas. 4. Ta bort flaskan från blandningsenheten. 5. Öppna snäpplocket, dra det bakåt och snäpp fast det i utskärningen (se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för mer information). 6. Ladda omedelbart flaskan i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis-instrumentet. Om funktionen för kontinuerlig reagensladdning används under färgningskörningen ska du se till att tiden från blandning till aspiration av flaskan vid Dako Omnis är minst 10 minuter. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-proben kan tinas på nytt och användas upp till 10 gånger. Blanda alltid HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-proben strax före laddning på instrumentet. Skaka inte. Den totala tiden för produktens stabilitet i instrumentet för ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är 80 timmar när den förvaras i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ska efter tiden den förvarats på Dako Omnis omedelbart överföras till < -18 C (-18 C till -25 C rekommenderas). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Bered en arbetslösning genom att späda ut ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 på följande sätt: 1. Fyll en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska, märkt PTB (blå etikett), till fyllningslinjen med avjoniserat vatten (3,325 L). Se till att bulkflaskan placeras på en horisontell yta före fyllning. 2. Töm en flaska med 175 ml ISH förbehandlingslösning (20x) (Dako Omnis) i bulkflaskan. 3. Ta etiketten från koncentratflaskan och fäst den på bulkflaskan. Sätt fast bulkflaskans lock och vänd försiktigt upp och ned på bulkflaskan 2 3 gånger. 4. Använd den manuella Dako Omnis-streckkodsläsaren för att identifiera reagenset (skanna den löstagbara etiketten och bulkflaskan). 5. Ladda omedelbart bulkflaskan i Dako Omnis-instrumentet. Den utspädda lösningen kan användas inom 7 dagar om den förvaras på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2-8 C i 30 dagar. Efter kall förvaring ska du se till att den utspädda lösningen når minst 18 C innan den laddas på Dako Omnis. OBS! Kassera den utspädda lösningen om den är grumlig. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 8/54

9 Bröstcancer A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Bered en arbetslösning genom att späda ut ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 på följande sätt: 1. Fyll en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska, märkt PTB (blå etikett), till fyllningslinjen med avjoniserat vatten (3,325 L). Se till att bulkflaskan placeras på en horisontell yta före fyllning. 2. Töm en flaska med 175 ml ISH stringent tvättbuffert (20x) (Dako Omnis) i bulkflaskan. 3. Ta etiketten från koncentratflaskan och fäst den på bulkflaskan. Sätt fast bulkflaskans lock och vänd försiktigt upp och ned på bulkflaskan 2 3 gånger. 4. Använd den manuella Dako Omnis-streckkodsläsaren för att identifiera reagenset (skanna den löstagbara etiketten och bulkflaskan). 5. Ladda omedelbart bulkflaskan i Dako Omnis-instrumentet. Den utspädda lösningen kan användas inom 7 dagar om den förvaras på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i upp till 30 dagar. Efter kall förvaring ska du se till att den utspädda lösningen når minst 18 C innan den laddas på Dako Omnis. OBS! Kassera den utspädda lösningen om den är grumlig. A.4 ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) är ett bruksfärdigt reagens. Före laddning på Dako Omnis öppnar du flaskans snäpplock, drar det bakåt och snäpper fast det i utskärningen. Den totala tiden för produktens stabilitet i instrumentet för ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) är 80 timmar när den förvaras i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). När körningen är klar kan ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) överföras till förvaringstemperatur (2-8 C) för att bevara tiden för stabilitet i instrumentet. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) är en bruksfärdig lösning. Före laddning på Dako Omnis ska du se till att reagenset är tinat och sedan öppnar du flaskans snäpplock, drar det bakåt och snäpper fast det i utskärningen. Den totala tiden för produktens stabilitet i instrumentet för ISH Pepsin (Dako Omnis) är 80 timmar när den förvaras i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). När körningen är klar ska ISH Pepsin (Dako Omnis) överföras till förvaringstemperatur (-18 8 C) för att bevara tide n för stabilitet i instrumentet. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) är ett bruksfärdigt monteringsmedium som används utanför Dako Omnis-instrumentet. Överför Fluorescence Mounting Medium till förvaringstemperatur (2-8 C) omedelbart efter anvä ndning. A.7 Ytterligare tillbehör Följande tillbehör ska vidare laddas på Dako Omnis: avjoniserat vatten, utspädd Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kod GC807, Clearify, kod GC810, ISH Cleaning Solution, kod GC207 och ISH Lid (Dako Omnis), kod GC102 som specificeras i användarhandboken till Dako Omnis. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 9/54

10 Bröstcancer B. Färgningsprocedur - Bröst B.1 Procedurnoteringar HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är hybridiseringsproben för den automatiserade direkta fluorescerande in situ-hybridiseringen (FISH) på Dako Omnis-instrumentet och är, tillsammans med tillbehörsreagensenheter GM300, GM301, GM302, GM303 och GM304 (GM304 utanför instrumentet), utformad för kvantitativ bestämning av HER2-genamplifiering. Före användning ska användaren läsa alla instruktioner noggrant och vara förtrogen med alla komponenter och deras försiktighetsåtgärder. Den automatiska FISH-färgningsproceduren på Dako Omnis inkluderar avparaffinering av vävnadssnitt, målåtervinning, nedbrytning med pepsin, hybridisering och stringenttvätt. Objektglasen tas ut på den torra uttagningsstationen. Alla protokollsteg är förprogrammerade i programvaran för Dako Omnis. Se användarhandboken till Dako Omnis för instruktioner om laddning och uttagning av objektglas, ISH Lid (ISH-lock), reagens, osv. Tre validerade HER2 IQFISH-protokoll: HER2 IQFISH Pepsin Short (kort), HER2 IQFISH Pepsin Medium (medellångt) och HER2 IQFISH Pepsin Long (långt) som endast skiljer sig i tiden för nedbrytning med pepsin, är förprogrammerade i programvaran för Dako Omnis och kan väljas för vart och ett av de fem objektglasen i objektglashållaren. Detta möjliggör optimering av vävnadsnedbrytning som kan bero på förhållanden före analys. Protokollet HER2 IQFISH Pepsin Medium (medellångt) ses som standardprotokollet. De olika färgningsprotokollen kan ses på Dako Link Omnis-arbetsstationen. B.2. Förfärgningsprocedur 1. Välj HER2 IQFISH-protokollet som ska användas för varje objektglas från programvaran för Dako Link Omnis-arbetsstationen under IQFISH-protokoll. 2. Skriv ut objektglasens etiketter och fäst dem på objektglasen. 3. Placera objektglasen i objektglashållaren. Se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för mer information. En objektglashållare kan hålla mellan ett och fem objektglas. Vi rekommenderar att minst två objektglas färgas i en HER2 IQFISH-färgningskörning. 4. Ladda objektglashållaren i Dako Omnis-instrumentet. 5. Ladda ISH Lid (ett ISH Lid per objektglashållare) på Dako Omnis. 6. Se till att bulkflaskor med vätska är inuti instrumentet och att de är registrerade av Dako Omnis-instrumentet. Bulkflaskor med vätska: Clearify (klargöringsmedel), utspädd ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), utspädd ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) och utspädd Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Ladda ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) och ISH Pepsin (Dako Omnis), den nyblandade HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och ISH Cleaning Solution (Dako Omnis) i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen). Se till att alla flaskors snäpplock är öppna. 8. Följ anvisningarna på pekskärmen och tryck på Done ( Klar ) för att starta färgningsproceduren. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 10/54

11 Bröstcancer B.3. Färgningsprocedur HER2 IQFISH-färgningsproceduren på Dako Omnis-instrument (sammanfattas i tabell 1) kan övervakas på Dako Link Omnis-arbetsstationen: Tabell 1. Förenklad översikt över protokollstegen för HER2 IQFISH-färgning. Steg Reagens Tid och temperatur Dewax Clearify (klargöringsmedel) 10 minuter, 38 C Målåtervinning ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 15 minuter, 97 C Tvätt ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 2 x 3 minuter, 32 C Nedbrytning* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minuter, 15 minuter eller 20 minuter Torkning 15 minuter, 45 C Denaturering 10 minuter, 66 C Hybridisering HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 minuter, 45 C Stringenttvätt ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minuter, 61 C * Tre validerade tider för nedbrytning med pepsin kan väljas med hjälp av HER2 IQFISH-protokollen ovan. Om inga ytterligare ISH-färgningar är nära förestående överför du alla reagens till de rekommenderade förvaringstemperaturerna. B.4. Efterfärgningsmetod Ta ut objektglasen och tillför upp till 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med DAPI till objektglasets målområde. Vävnadssnittet måste vara helt täckt av Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Använd ett täckglas. Obs!Objektsglasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om objektsglasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara glasen i mörker vid C för att minimera blekning. Kvalitetskontroll - Bröst 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. 2. Normala celler gör att man kan göra en intern kontroll av färgningskörningen. Normala celler ska ha 1-2 klart synliga gröna signaler som tecken på att CEN-17 PNA-proben framgångsrikt har hybridiserats till den centromeriska regionen av kromosom 17. Normala celler ska också ha 1-2 klart synliga röda signaler som tecken på att HER2 DNA-proben framgångsrikt har hybridiserats till HER2-genen/generna. På grund av vävnadssnittningen kan vissa normala celler ha färre än de förväntade två signalerna av varje färg. Om inga signaler detekteras i normala celler är det ett tecken på att analysen misslyckats och resultaten ska anses ogiltiga. 3. Nukleär morfologi måste vara intakt vid utvärdering med ett DAPI-filter. Många spöklika celler och en allmänt dålig nukleär morfologi tyder på övernedbrytning av provet, vilket resulterar i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prover ska anses ogiltiga. 4. Ett minimum av 20 tumörceller måste kunna utvärderas. 5. Skillnader i vävnadsfixering, behandling, och inbäddning i användarens laboratorium kan producera variabilitet i resultaten som gör regelbunden utvärdering av egna kontroller nödvändiga. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 11/54

12 Färgningstolkning - Bröst Bröstcancer Bedömningsbar vävnad Endast prover från patienter med invasiva carcinom ska testas. I fall med carcinoma in situ och invasivt carcinom i samma prov ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Undvik nekrotiska områden och områden där de nukleära gränserna är tvetydiga. Tag inte med kärnor som kräver subjektiv bedömning. Hoppa över kärnor med svag signalintensitet och ickespecifik eller hög bakgrundsfärgning. Signalräkning Lokalisera tumören inom det H&E-färgade glaset och utvärdera samma område på det FISH-färgade glaset. Undersök flera områden med tumörceller för att redovisa eventuell heterogenitet. Välj ett område med god fördelning av kärnor. Börja analysen i den övre vänstra kvadranten i det valda området och medan du skannar från vänster till höger räknar du antalet signaler inom kärngränserna för varje bedömd kärna enligt riktlinjerna nedan (se också Bilaga 2). - Fokusera uppåt och nedåt för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna - Räkna två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än signalens diameter som bara en signal - I kärnor med höga nivåer av HER2-genamplifiering kan HER2-signalerna ligga mycket nära varandra och bilda kluster av signaler. I dessa fall kan antalet HER2-signaler inte räknas utan måste uppskattas. Speciell uppmärksamhet måste ges åt de gröna signalerna eftersom kluster med HER2-signaler kan täcka de gröna signalerna och göra dem omöjliga att se. Om du är osäker, kontrollera även de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter. Räkna inte kärnor utan signaler eller de med signaler som bara har en färg. Räkna bara de kärnor som har en eller fler FISH-signaler av varje färg. Signalräkningsguide 1 Ta inte med. Kärnorna överlappar, kärnornas alla områden syns inte 2 Två gröna signaler, räkna inte kärnor med signaler som bara har en färg 3 Räkna som 3 gröna och 12 röda signaler (klusteruppskattning) 4 Räkna som 1 grön och 1 röd signal. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en 5 Räkna inte (över- eller undernedbrutna kärnor). eller Saknade signaler i mitten av kärnor (donut-formade kärnor). 6 Räkna som 2 gröna och 3 röda signaler. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en 7 Räkna som 1 grön och 5 röda signaler 8 Räkna som 3 gröna (1 grön ej i fokus) och 3 röda signaler ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 12/54

13 Bröstcancer 9 Kluster med röda signaler som skymmer gröna signaler, kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITCfilter eller räkna inte Skriv ner antal räknade signaler i en tabell så som visas i Bilaga 1. Räkna 20 kärnor per vävnadsprov när det är möjligt från distinkta tumörområden (18). Beräkna HER2/CEN-17-kvoten genom att dividera antalet röda HER2-signaler med det totala antalet gröna CEN-17-signaler. Prover med en HER2/CEN-17-kvot över eller lika med 2 ska anses vara HER2-genamplifierade (3, 18-20). Resultat vid eller nära gränsen (1,8-2,2) ska tolkas med försiktighet. Om förhållandet är ett gränsfall (1,8-2,2) räknar du ytterligare 20 kärnor och räknar om förhållandet för de 40 kärnorna. Om du tvekar ska provglaset räknas om på nytt. Vid gränsfall finns det anledning att låta patologen konsultera med den behandlande läkaren. Begränsningar - Bröst 1. Endast för automatisk användning på Dako Omnis-instrument. 2. Särskild utbildning krävs för vävnadsval, fixering och objektglasberedning samt för IQFISH-färgningstolkning. Tolkning av färgningar med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ska inte utföras av personer som har försämrat färgseende. 3. FISH-resultat är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan påverka probhybridiseringen. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 4. Prestandan hos HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-analysen har inte utvärderats på bröttumörprover med mikroförkalkningar. Prestandaegenskaper - Bröst Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten hos HER2 IQFISH pharmdx undersöktes med 180 formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt som testades på tre olika ställen i studien. Samtliga 180 vävnadssnitt gick att räkna enligt riktlinjerna för produkträkning. Hybridiseringseffektiviteten var 100 %. HER2/CEN-17-förhållandena som beräknades och användes i studierna av prestandaegenskaper baseras på räkning av signaler i 20 kärnor med hjälp av poängriktlinjerna som beskrivs i avsnittet Tolkning av färgning i den här bruksanvisningen. Analytisk sensitivitet Den analytiska känsligheten hos HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) undersöktes med hjälp av 20 olika vävnadsprover för bröstcarcinom (10 prover med amplifierad HER2-genstatus och 10 icke-amplifierade prover). Förhållandet mellan antalet HER2 signaler och CEN-17-signaler beräknades grundat på en räkning av signaler från 20 kärnor i normala celler i vävnadsprovet. HER2/CEN-17-förhållandet för normala celler som identifierades i de 20 vävnadsproverna för bröstcarcinom var mellan 0,97-1,11. Analytisk specificitet HER2 DNA-proberna i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har sekvenserats och mappats för att bekräfta att de täcker totalt 218 kb inklusive HER2-genen. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 13/54

14 Bröstcancer CEN-17 PNA-proberna i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har testats individuellt och i kombination med FISH för att bekräfta deras specifika hybridisering till den centromeriska regionen på kromosom 17. För att utesluta korshybridisering till andra kromosomer än kromosom 17, utfördes undersökningar av metafasspridning enligt standardiserade Dako kvalitetskontrollprocedurer. Totalt 275 metafasspridningar med distinkta signaler utvärderades för specifik hybridisering av HER2 DNA och CEN-17 PNA-probmixar. I alla 275 fall var hybridiseringen specifik för kromosom 17. Ingen korshybridisering till loci på andra kromosomer observerades i några av de 275 fallen. Probspecificiteten var således 100 % (275 av 275). För att mäta IQFISH-analysens förmåga att enbart identifiera målen HER2 och CEN-17 utan interferens av andra substanser utfördes studier på vävnadsprover av bröstcarcinom genom att utesluta HER2- och CEN-17-proberna från hybridiseringsblandningen och endast använda hybridiseringsbufferten. Totalt 20 prover utvärderades med avseende på förekomst av signaler som inte var relaterade till probmixen. Ingen detektion av andra kromosommål eller interferens från andra relaterade substanser observerades i något av de 20 proverna. Robusthetsstudier Robustheten hos analysen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) testades genom att variera PNA-probkoncentrationen, målåtervinning, pepsininkubationstid, denatureringstid, hybridiseringstid, stringenttvättid och temperatur. De olika parametrarna testades på fem FFPEvävnadsprover av bröstcancer (både amplifierade och icke-amplifierade prover ingick). Alla parametrar testades både under och över standardprotokollinställningarna med undantag för PNA-probkoncentration och temperatur för stringenttvätt, för vilka standardprotokollinställningarna ingick i uppställningen. Testparametrarna var: PNA-probkoncentration: Testad vid 100 % och +/-17 %. Målåtervinningstid: Testad vid 13 min 45 s och 16 min 15 s. Pepsininkubationstid: Testad vid14 min 45 s och 16 min 15 s. Denatureringstid: Testad vid 9 min 45 s och 10 min 45 s. Hybridiseringstid: Testad vid 70 min och 80 min. Stringenttvättid: Testad vid 8 min 45 s och 11 min 15 s. Stringenttvättemp.: Testad vid 59 C, 61 C och 63 C. De tre PNA-probkoncentrationerna utvärderades i en uppdelad försöksmodell (JMP tool, SAS) som utfördes med 12 olika färgningsprotokoll så som visas i tabell 2. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 14/54

15 Tabell 2. Tolv olika färgningsprotokoll användes i robusthetsstudien. Testparameter Bröstcancer Robusthet, protokollnr Målåtervinningstid (min) Pepsintid (min) Denatureringstid (min) Hybridiseringstid (min) Stringenttvättid (min) Stringenttvätttemp. ( 0 C) PNAkonc. i probmix 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Alla fem vävnadsprover färgades med alla 12 protokollen. Mätvärdena för robusthetsstudien var signalintensitet och morfologikvalitet. Alla protokoll gav färgning i alla vävnadsprover (60 totalt) med signaler som var starka, tydliga och lätta att utvärdera, och därmed lämpliga för signalräkning. Dessutom testades effekten av vävnadstjocklek på analysresultaten för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) genom att vävnadstjockleken hos FFPE-vävnadsproverna av bröstcancer varierades. Totalt fem på varandra följande snitt av fem humana bröstcarcinomprover med olika tjocklek (3, 4, 5, 6 och 7 µm) testades med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Den genomsnittliga variationskoefficienten för HER2/CEN-17-förhållandet var 5,8 % (från 4,3 % till 7,1 %). Reproducerbarhet Reproducerbarheten mellan loter och från dag till dag inom samma laboratorium testades med hjälp av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Studien utformades som en intern, blindad, randomiserad studie av HER2/CEN-17-förhållanden med hjälp av snitt från åtta olika formalinfixerade och paraffininbäddade bröstcancerprover med olika nivåer av HER2- genamplifiering. De åtta proverna testades med HercepTest och utgjordes av två prover HER2 IHC 0/1+, två prover med HER2 IHC 2+, två prover med HER2 IHC 3+ och två prover med ett förutbestämt HER2/CEN-17 FISH-förhållande mellan 1,5 och 2,5 som erhållits med hjälp av HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). Varje prov färgades med tre olika loter av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på fem dagar som inte följde på varandra. Totalt 240 vävnadsfärgningar bearbetades för hela studien eftersom varje kombination färgades i duplikat. Variationen av förhållandena mellan dagar och loter visas i figur 1. Data analyserades med Box- Cox-transformation via en linjär paneldatamodell för att erhålla homogen datavarians. Den totala variationskoefficienten uppskattades till 4,3 % och det påvisades att variation från dag till dag och mellan loter bidrog med 1,5 % respektive 0 %. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 15/54

16 Bröstcancer Figur 1. HER2/CEN-17-förhållanden erhölls i en studie över reproducerbarhet inom laboratoriet på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), där ändpunkterna för reproducerbarhet inkluderade de för lot till lot och dag till dag. Dessutom testades reproducerbarheten från dag till dag och mellan laboratorier för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) externt i en stratifierad och blindad studie med tre ställen (ett ställe i USA och två ställen i Europa) på vävnadssnitt från 12 olika formalinfixerade, paraffininbäddade bröstcancerprover. Tre prover var HER2 IHC 0/1+, tre prover var HER2 IHC 2+, tre prover var HER2 IHC 3+ och tre prover hade ett förutbestämt HER2/CEN-17 FISHförhållande mellan 1,5 respektive 2,5 som erhållits med hjälp av HercepTest respektive HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). Proverna färgades och analyserades på ställena för studien. Samtliga prover färgades minst fem gånger på fem dagar som inte följde på varandra och poängsattes av en observatör på varje ställe. 192 snitt färgades och inkluderades i den statistiska analysen. Data analyserades med Box-Cox-transformation och varianskomponenterna beräknades. Den totala variationskoefficienten som baserades på den övre konfidensgränsen på 95 % var 15 %. HER2/CEN-17-förhållandets variation för dag och ställe visas i figur 2. Figur 2. Variabilitetsgraf för HER2/CEN-17-förhållanden i icke-transformerade enheter som erhållits i reproducerbarhetsstudien för dag till dag och ställe till ställe för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på vävnadsprover av bröstcancer. Analysen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) testades med avseende på reproducerbarhet för olika observatörer som en del av den internt utförda metodjämförelsestudien som använde tre observatörer för att oberoende poängsätta de färgade proverna. Reproducerbarhet testades på 140 olika humana prover av bröstcarcinom med antingen icke-amplifierad eller amplifierad HER2- genstatus. Data analyserades med Box-Cox-transformation. Den genomsnittliga variationskoefficienten mellan observatörer var 9 %. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 16/54

17 Bröstcancer Repeterbarhet Repeterbarhet inom laboratoriet för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) testades med åtta på varandra följande humana prover av bröstcarcinom med antingen icke-amplifierad eller amplifierad HER2-gen. Vävnaderna testades i duplikat på fem dagar som inte följde på varandra med tre olika loter i totalt 240 objektglas (120 snitt i duplikat). Den linjära paneldatamodellen som användes för dataanalys resulterade i en varians som kan hänföras till dags- och lotvariationer (vilket påvisas i studien av intern reproducerbarhet). Den kvarvarande variansen är variansen mellan replikat och därmed repeterbarhet. Den övre konfidensgränsen på 95 % för variationskoefficienten för repeterbarhet var 4,4 %. Metodjämförelsestudier Jämförelse av resultat för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) med resultat för HER2 IQFISH pharmdx HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) jämfördes med HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) i en jämförande studie på 140 humana vävnadsprover av bröstcarcinom. Proverna utgjordes av 77 icke amplifierade HER2-fall och 63 amplifierade HER2-fall med känd HercepTest -poäng så som visas i tabell 3. Tabell 3. Fördelningen av prover baserat på HercepTest -poäng och HER2 FISH-poäng (HER2-gen) som erhölls med HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). HercepTest -färgningspoäng Totalt n HER2 FISH-status Amplifierad Icke-amplifierad Totalt antal FISH-testade prover Resultatet av korstabulering av HER2-genstatus som erhållits från de två analyserna med beräkning av total procentuell överensstämmelse (OPA), procentuell positiv överensstämmelse (PPA) och procentuell negativ överensstämmelse (NPA) visas i tabell 4. Korrelation mellan HER2/CEN-17-förhållanden med hjälp av de två analyserna visas i figur 3. Tabell 4. Korsberäkning av HER2-genstatus som erhölls med HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) och HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Icke-amplifierad HER2-genstatus (K5731) Amplifierad Totalt HER2- genstatus Icke-amplifierad (Dako Omnis) Amplifierad Totalt OPA: 100 % PPA: 100 % NPA: 100 % ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 17/54

18 Bröstcancer Figur 3. Korrelation mellan HER2/CEN-17-förhållanden med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) på 140 prover av bröstcancer (linjär passning: y = 0,11 + 0,95*x; R 2 = 0,97. Viktade med inverterad varians för att tillåta linjär passning). HER2/CEN-17-förhållanden log-transformerades för analys. Konfidensintervallet på 95 % för den genomsnittliga skillnaden mellan de två olika färgningsmetoderna vid HER2/CEN-17-förhållande = 2 befanns vara [0,002; 0,031]. Det betyder att en skillnad över 3 % inte är förväntad med 95 % konfidens. Rotmedelkvadratfelet (RMSE) befanns vara 9 % vilket indikerade en storlek på den genomsnittliga fluktuationen runt det genomsnittliga värdet. Jämförelse av resultat för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) med resultat för PathVysion HER-2 DNA Probe Kit HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) jämfördes med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit i en jämförande studie på 140 humana vävnadsprover av bröstcancer. Proverna utgjordes av 80 ickeamplifierade HER2-fall och 80 amplifierade HER2-fall med känd HercepTest -poäng så som visas i tabell 5. Tabell 5. Fördelningen av prover baserat på HercepTest -poäng och HER2 FISH-poäng (HER2-genstatus) som erhölls med HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). HercepTest -färgningspoäng Totalt n HER2 FISH-status Amplifierad Icke-amplifierad Totalt antal FISH-testade prover Resultatet av korstabulering av HER2-genstatus som erhållits från de två analyserna med beräkning av total procentuell överensstämmelse (OPA), procentuell positiv överensstämmelse (PPA) och procentuell negativ överensstämmelse (NPA) visas i tabell 6. Korrelation mellan HER2/CEN-17-förhållandena med hjälp av de två analyserna visas i figur 4. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 18/54

19 Bröstcancer Tabell 6. Korstabulering av HER2-genstatus som erhölls med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit och HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Icke-amplifierad HER2-genstatus (PathVysion) Amplifierad Totalt HER2- Icke-amplifierad genstatus (Dako Omnis) Amplifierad Totalt OPA: 100 % PPA: 100 % NPA: 100 % Figur 4. Korrelation mellan HER2/CEN-17-förhållanden med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och PathVysion på 140 prover av bröstcancer (linjär passning: y = 0,01 + 0,98*x; R 2 = 0,96. Viktade med inverterad varians för att tillåta linjär passning). HER2/CEN-17-förhållanden log-transformerades för analys. Konfidensintervallet på 95 % för den genomsnittliga skillnaden mellan de två olika färgningsmetoderna vid HER2/CEN-17-förhållande = 2 befanns vara [0,001; 0,031]. Det betyder att en skillnad över 3 % inte är förväntad med 95 % konfidens. Rotmedelkvadratfelet (RMSE) befanns vara 10 % vilket indikerade en storlek på den genomsnittliga fluktuationen runt det genomsnittliga värdet. Klinisk nytta vid val av patienter för behandling med Herceptin (trastuzumab) HER2 FISH pharmdx Kit undersöktes i jämförande studier med både PathVysion HER-2 DNA Probe Kit och Dako HercepTest. Resultaten av HER2 FISH-testerna finns tillgängliga för totalt 940 prover av bröstcancer. Jämförelse av resultat för HER2 FISH pharmdx Kit med testresultat för PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Tre studier har utförts som jämför resultaten för HER2 FISH pharmdx Kit-testet med resultaten för PathVysion HER-2 DNA Probe Kit-testet (se tabell 7). Studierna utfördes på geografiskt åtskilda platser, och det fanns inget överlapp i fråga om användning av prover. Totalt 328 prover har testats. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 19/54

20 Tabell 7. Summerade data för FISH-metodjämförelsestudier. Studiebeteckning Konkordansstudie Konkordansstudie (japanska prover, (danska prover, N=190) N=52) Konkordans 93,68 % (95 % konfidensintervall) (90,22 % - 97,14 %) 96,15 % Procentuell positiv 86 % överensstämmelse (77,34 % - 95,08 %) (95 % konfidensintervall) 97 % Procentuell negativ 97 % överensstämmelse (94,05 % - 99,89 %) (95 % konfidensintervall) 96 % Bröstcancer Konkordansstudie (franska prover, N=86) (21)* * Jämförelsedata angavs i artikeln, men HER2 FISH-analysen identifierades inte. Total 12 avvikande testresultat för HER2 FISH pharmdx Kit-testet och PathVysion HER-2 DNA Probe-testet återfanns för de danska kliniska proverna (se tabell 8). Tabell 8. Summering av data för de 12 avvikande testresultaten. HER2 FISH (positivt)/pathvysion (negativt) IDnförhållande HER2 FISH ,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) PathVysionförhållande 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) HercepTestpoäng ID-nr HER2 FISHförhållande ,68 (1,38-1,83) ,44 (1,07-1,83) ,7 (1,52-1,95) ,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) HER2 FISH( negativt)/pathvysion (positivt) PathVysionförhållande 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) HercepTestpoäng 2+ * Konfidensintervall för medellogförhållanden inkluderade 2.0. Siffrorna i parentes är konfidensintervallet på 95 % I den här avvikelseanalysen logaritmerades förhållandena. Konfidensintervallet på 95 % beräknades för de 60 logaritmerade förhållandena från kärnorna som användes för att beräkna PathVysion HER-2 DNA Probe-förhållandet. För de fyra fall där HER2 FISH pharmdx Kit var positivt och PathVysion HER-2 DNA Probe var negativt inkluderade inget intervall det kritiska värdet 2. För de åtta fall där HER2 FISH pharmdx Kit var negativt och PathVysion HER-2 DNA Probe var positivt inkluderade konfidensintervallet på 95 % för tre (nr 234, 284 och 735) det kritiska värdet 2. På samma vis beräknades konfidensintervallet på 95 % för de logaritmerade förhållandena från kärnorna som användes för att beräkna HER2 FISH pharm Dx Kitförhållandet. För de fyra fall där HER2 FISH pharmdx Kit var positivt och PathVysion HER-2 DNA Probe var negativt inkluderade två (nr 160 och 306) det kritiska värdet 2. För de åtta fall där HER2 FISH pharmdx Kit var negativt och PathVysion HER-2 DNA Probe var positivt inkluderade konfidensintervallet på 95 % för ett (nr 881) det kritiska värdet ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 20/54

21 Bröstcancer Jämförelse av resultat för HER2 FISH pharmdx Kit med resultat för HercepTest Fyra studier som jämförde resultat för HER2 FISH pharmdx Kit och HercepTest har utförts. Totalt 940 prover har jämförts, med användning av en färgningspoäng på 3+ som ett positivt IHCresultat i HercepTest -analysen (se tabell 9). Tabell 9. Sammanfattning av jämförelsestudierna HER2 FISH pharmdx Kit och IHC (HercepTest ). Studiebeteckning Konkordans (95 % konfidensintervall) Procentuell positiv överensstämmelse (95 % konfidensintervall) Procentuell negativ överensstämmelse (95 % konfidensintervall) Danska kliniska prover (N=682) 93,11% (91,21 % - 95,01 %) 91% (87,39 % - 94,57 %) 94% (92,12 % - 96,46 %) Japanska kliniska prover (N=52) Fransk studie (N=86) (31) Dansk pilotstudie (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96 % 87% 84% 96 % 87% 97% Fördelningsdata för testresultat för HercepTest och HER2 FISH för de danska kliniska proverna visas i tabell 10. Tabell 10. Fördelning av HER2-status för HercepTest och HER2 FISH pharmdx Kit. HercepTest -färgningspoäng Totalt n % % HER2 FISH-status Amplifierad Icke-amplifierad Totalt antal FISH-testade prover ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 21/54

22 Bröstcancer Felsökning - Bröst Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 1a. Reagens har utsatts för höga temperaturer under transport eller förvaring 1b. Mikroskopet fungerar inte tillfredsställande - Olämpligt filter insatt - inte rätt lampa - kvicksilverlampan för gammal - Smutsiga och/eller spruckna kollektorlinser - Olämplig immersionsolja 1a. Kontrollera förvaringsförhållandena. Kontrollera att torris fanns när IQFISH-probmixen och pepsinleveranserna togs emot. Kontrollera att reagensen har förvarats enligt specifikationerna. 1b. Kontrollera mikroskopet och att de använda filtren är lämpliga för användning med probmixens fluorokromer och att kvicksilverlampan är av rätt typ och inte har använts bortom sin förväntade livslängd (se Bilaga 2). Om du tvekar, kontakta mikroskopförsäljaren. 1c. Blekta signaler 1c. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponering från starka ljuskällor. 1d. Buffertar identifieras felaktigt 1d. Byt ut bulkbuffertar och säkerställ korrekt registrering (på arbetsstationen) och identifiering (på pekskärmen) för bulkbuffertar. Se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för mer information. Observera: ISH Pre-Treatment Solution är grön och ISH Stringent Wash Buffer är gul. 2. Områden utan signal 2. Luftbubblor fastnade under montering 2. Undvik luftbubblor. Om sådana observeras knackar du försiktigt bort dem med en pincett. 3. Överdriven bakgrundsfärgning 4. Dålig vävnadsmorfologi 3a. Olämplig vävnadsfixering 3a. Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används. 3b. Långvarig exponering av hybridiserat snitt från starkt ljus 3b. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starkt ljus. 4a. Felaktig pepsinbehandling 4a. Byt till ett annat av de tre olika färgningsprotokollen. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 22/54

23 Bröstcancer Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd Se till att ISH Pepsin (Dako Omnis) förvaras vid korrekt temperatur. 5. Hög nivå av grön autofluorescens på objektglas inkluderar områden utan FFPE-vävnad 4b. Alltför lång pepsinbehandling eller mycket tunna snitt kan göra att spökceller eller donut-celler visar sig 5. Användning av utgångna eller icke-rekommenderade objektglas 4b. Prova ett färgningsprotokoll med kortare pepsininkubationstid. Kontrollera att snittjockleken är 4 6 µm. 5. Välj objektglas enligt specifikationerna. Se till att objektglasens utgångsdatum inte har passerat. OBS! Om problemet inte kan härledas till någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna korrigeringsåtgärden inte löser problemet kontaktar du Dakos tekniska support för vidare assistans. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 23/54

24 Bröstcancer Bilaga 1 - Bröst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kod GM333 Poängschema Datum för körningen: Färgningskörningens logg-id: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lot: Prov-ID: Kärna Nr HER2- poäng (röd) Räkna signaler i 20 kärnor CEN-17- poäng (grön) Kärna nr Totalt (1-10) Totalt (11-20) HER2- poäng (röd) CEN-17- poäng (grön) För bestämning av HER2/CEN-17-kvoten räknar du antalet HER2-signaler och antalet CEN-17-signaler i samma 20 kärnor och dividerar det totala antalet HER2-signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Om HER2/CEN-17-kvoten är ett gränsfall (1,8-2,2) räknar du ytterligare 20 kärnor och räknar om kvoten för de 40 kärnorna. Ett förhållande vid eller nära gränsen ( ) ska tolkas med försiktighet (se räkningsguiden). Total poäng (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- förhållande ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 24/54

25 Bröstcancer Kärna nr HER2- poäng (röd) Räkna signaler i ytterligare 20 kärnor CEN-17- poäng (grön) Kärna nr Totalt (21-30) Totalt (31-40) HER2- poäng (röd) CEN-17- poäng (grön) Beräkna HER2/CEN-17-kvoten baserat på de 40 räknade kärnorna Total poäng (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- förhållande Kvot < 2: HER2-genamplifiering observerades inte Kvot 2: HER2-genamplifiering observerades Datum och namnteckning, laboratorieassistent: Datum och namnteckning, patolog: För poängriktlinjer: se Färgningstolkning. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 25/54

26 Bröstcancer Bilaga 2 - Bröst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kod GM333 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar följande utrustning för användning med HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Mikroskoptyp Epifluorescensmikroskop 2. Lampa 100 watt kvicksilverlampa (håll reda på brinntiden) 3. Objektiv För screening av vävnaden kan oljeimmersion 16x eller 20x objektiv användas För högre förstoring och för räkning av signaler rekommenderas endast oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 100x 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI filter i kombination med ett högkvalitativt Texas Red/FITC dubbelfilter. DAPI-filter, t.ex. Chroma filter # Texas Red/FITC, dubbelfilter, t.ex. Omega Optical filter # XF53 eller Chroma filter # Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse och för räkning Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är utomordentligt viktigt för tolkningen. Om du vill ha detaljerad information kontakta din mikroskopleverantör eller din Dakorepresentant. 5. Olja Icke-fluorescerande olja Försiktighetsåtgärder En kvicksilverlampa på 50 watt rekommenderas inte Rhodaminfilter kan inte användas Trippelfilter rekommenderas inte Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunden ska övervaka och följa tillverkarens rekommendationer för kvicksilverlampan. Mikroskopet ska underhållas och kvicksilverlampan ska vara rätt inriktad innan du försöker tolka resultaten. Man ska sträva efter att exponera provet så lite som möjligt för excitationsljuset för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar uppställningen av ditt särskilda mikroskop med tillverkaren innan du börjar med den fluorescerande in situ-hybridiseringen, eller tittar i litteraturen. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 26/54

27 Magcancer Sammanfattning och förklaring - Mage Den humana HER2 -genen (också kallad ERBB2 eller NEU) sitter på kromosom 17 och kodar HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet är en membranreceptor tyrosinkinas med homologi till den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genen finns närvarande i två kopior i alla normala diploida celler. Överuttryck av HER2-proteinet och amplifiering av HER2-genen i magcancer har påvisats i ett flertal olika studier (granskat i (23)). HER2-positivitet kan detekteras hos cirka 20 % av patienterna, antingen med IHC eller FISH (23). Förkliniska in vitro- och in vivo-studier har påvisat att trastuzumab (Herceptin ) är effektivt i olika magcancermodeller, vilket således har lett till att flera kliniska studier har inletts (23-27). Samtliga patienter i fas III-studien BO18255 (ToGA En öppen, randomiserad, multicenter, fas-iiistudie av trastuzumab i kombination med en fluoropyrimidin och cisplatin jämfört med endast kemoterapi som första behandling i patienter med HER2-positiv långt framskriden magcancer ) sponsrad av Hoffmann-La Roche AG utvaldes med hjälp av Dako HercepTest (IHC) och Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) med HER2-positivitet definierad som IHC 3+ eller FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). Studien visade den kliniska nyttan av både HercepTest (IHC) och HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) för utvärdering av HER2-status med långt framskridet adenocarcinom i magen eller den gastroesofageala förbindelsen för vilka behandling med trastuzumab övervägs (28). Inga patienter vars tumörer inte var genamplifierade men hade svagt till starkt överuttryck av HER2-protein [FISH(-)/IHC 2+] anmäldes. Därför är det oklart om patienter vars tumörer inte är genamplifierade men har svagt till starkt överuttryck av HER2-protein [t.ex. FISH(-), IHC 2+ eller 3+] kommer att ha nytta av behandling med Herceptin. Studien visade även att genamplifiering (FISH) och överuttryck av protein (IHC) inte är lika korrelerade som vid bröstcancer och därför ska inte en enda metod användas för att bestämma HER2-status. Den här produkten (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) är en IQISH-probmix för automatiserad direkt FISH-detekterande HER2-genamplifiering. Den här produkten ska användas tillsammans med de specificerade tillbehörsreagensen på Dako Omnis och härleds från den manuellt utförda HER2-genamplifieringsanalysen, HER2 IQFISH pharmdx, kod K5731. Procedurprincip - Mage HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är en IQISH-probmix bestående av en blandning av Texas Red-märkta DNA-prober som täcker en region på 218 kb, inklusive HER2-genen på kromosom 17 och en blandning av fluoresceinmärkta peptidnukleinsyraprober (PNA) (13) som är riktade mot den centromeriska regionen hos kromosom 17 (CEN-17). Den specifika hybridiseringen till de två målen resulterar i bildandet av en distinkt röd fluorescerande signal vid varje HER2-genlokus och en distinkt grön fluorescerande signal vid varje kromosom 17-centromer. Utvärdering av HER2-genamplifiering med hjälp av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), är en helautomatiserad metod på Dako Omnis-instrumentet. Tre olika validerade HER2 FISHfärgningsprotokoll kan väljas i programvaran till Dako Link Omnis-arbetsstationen. Protokollen skiljer sig bara i tiden för nedbrytning med pepsin, följaktligen kan nedbrytning med pepsin i 10 min (protokollet Short (kort)), 15 min (protokollet Medium (medellångt)) eller 20 min (protokollet Long (långt)) väljas (mer information finns nedan). Protokollet Medium (medellångt) rekommenderas för inledande analys. Efter färgningen på Dako Omnis monteras proverna med Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) som innehåller 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och förses med täckglas. Med hjälp av ett fluorescensmikroskop försett med lämpliga filter (se Bilaga 5) lokaliseras tumörceller och räkning av röda (HER2) och gröna (CEN-17) signaler utförs. Sedan beräknas HER2/CEN-17-kvoten. Normala celler i det analyserade vävnadssnittet tjänstgör som en intern positiv kontroll av förbehandling och hybridisering. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 27/54

28 Ytterligare information finns i avsnittet Tolkning av färgningen. Magcancer Se användarhandboken till Dako Omnis för detaljerade instruktioner om laddning och uttagning av objektglas, ISH Lid (Dako Omnis), kod GC102, reagens, bulkvätska och avfallsflaskor. Reagens - Mage HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagens kan beställas separat som enskilda reagens. Medföljande material HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, bruksfärdig mix av Texas Red-märkta HER2 DNA-prober och fluoresceinmärkta CEN-17 PNA-prober, levererade i IQISH buffertlösning för hybridisering. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) levereras på torris. För att garantera att reagenset inte har utsatts för höga temperaturer under transporten ska det fortfarande finnas torris kvar vid mottagandet. Reagensflaskor med tinat innehåll ska alltid förvaras och hanteras i upprätt läge. Reagensflaskan innehåller en guldbelagd metallkula som möjliggör reagensblandning med hjälp av Dako Omnis Mixing Device (se användarhandboken till Dako Omnis Mixing Device). Det är viktigt att reagenset blandas ordentligt innan det laddas på Dako Omnis. Erforderligt material som ej medföljer Tillbehörsreagens Följande reagens behövs på Dako Omnis-instrumentet för att utföra HER2-genamplifieringsanalys med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, koncentrerad 20x; ska spädas ut i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska (kod GC109). Produkten innehåller ett antimikrobiellt medel och inert grön färg för enkel identifiering och användarvänlighet. ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis): 14 ml av 96 % etanol (bruksfärdig). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml Pepsin A-lösning (bruksfärdig), ph 2,0; innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Pepsin levereras på torris. För att garantera att reagenset inte har utsatts för höga temperaturer under transporten ska det fortfarande finnas torris kvar vid mottagandet. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml saltlösning-natriumcitrat-buffert koncentrerad 20x; ska spädas ut 1:20 i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska (CG109). Produkten innehåller ett antimikrobiellt medel, ett rengöringsmedel och inert gul färg för enkel identifiering och användarvänlighet. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorescensmonteringsmedium (bruksfärdigt) med DAPI. Även om ovannämnda reagens inte medföljer HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), beskrivs de kortfattat nedan. Läs bruksanvisningen för varje enhet för ytterligare information. Extra reagens och utrustning Dako Omnis, kod GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kod GC807 Clearify TM, kod GC810 Dako Omnis Mixing Device, kod GC116 ISH Lid, kod GC102 ISH Cleaning Solution, kod GC207 Täckglas för montering (24 mm x 50 mm) ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 28/54

29 Magcancer Se den grundläggande och den avancerade användarhandboken för Dako Omnis för användning av extra reagens och enheter. Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI och FITC/Texas Red dubbelfilter, eller FITC och Texas Red monofilter - se Bilaga 5 för mer information. Användning av DAPI-filter vid hög förstoring påverkar signalintensiteten negativt. Långa exponeringstider ska undvikas. Fluorescensmikroskop en kvicksilverlampa på 100 watt som ljuskälla ska användas. Andra ljuskällor rekommenderas inte med dessa filter. Mikroskopglasfolder (kartongbricka med gångjärnsförsett lock och plats för 20 glas eller liknande) Försiktighetsåtgärder - Mage 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) innehåller 10-<25% ethylene carbonate och 3- <5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är märkt: Varning H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera P338 minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet. 4. Vävnadsprover, före och efter fixering, samt alla material som utsatts för dem, ska hanteras som om de kan överföra infektion och de ska undanskaffas med lämpliga försiktighetsåtgärder (14). Pipettera aldrig reagens med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagens och prover. Om reagens kommer i kontakt med känsliga områden ska du tvätta med stora mängder vatten. 5. Minimera mikrobiell kontaminering av reagens för att undvika felaktig färgning. 6. Vävnadsfixeringsmetoder och provtjocklekar som är annorlunda än de specificerade kan påverka vävnadsmorfologi och/eller signalintensitet. 7. Reagenset har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan leda till sämre funktion. 8. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Ytterligare information finns i databladet för säkerhet (SDS). 9. Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala, statliga och överstatliga föreskrifter. 10. Pga magcancerprovers heterogena beskaffenhet är det viktigt att utföra en grundlig skanning av hela provet för att utvärdera signalfördelningen innan du väljer området för signalräkning. 11. Vi rekommenderar inte att utvärdera mycket små prover (dvs. proverna måste ha en intakt morfologi och tillräcklig kärna för räkning). 12. Om en HER2 FISH-analys utförs på ett biopsiprov måste flera (7-8) biopsier från olika delar av tumören analyseras för att man ska uppnå en tillförlitlig bestämning av HER2-status. 13. För att identifiera alla vävnadsbitar i ett biopsiprov är det viktigt att kontrollera det H&Efärgade objektglaset. 14. HER2-genamplifiering och överuttryck av HER2-protein är inte lika korrelerade i magcancer som i bröstcancer. Därför ska inte en enda metod användas för att fastställa HER2-status. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 29/54

30 Magcancer Förvaring - Mage Förvara HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vid < 18 C (-18 C ti ll -25 C rekommenderas) i mörker. Håll alltid flaskan med tinat reagens upprätt. Frysning och upptining av reagens upp till 10 gånger påverkar inte resultatet. Lämna inte denna komponent i rumstemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagensen ISH Pepsin (Dako Omnis) och Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påverkas negativt om de utsätts för värme. Lämna inte dessa komponenter i rumstemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagenset Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påverkas negativt om det utsätts för höga ljusnivåer. Förvara inte dessa komponenter och utför inte analysen i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. Förvara tillbehörsreagensen ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) och Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) i mörker vid 2 8 C. F örvara ISH Pepsin (Dako Omnis) vid C. Flaskans lock, inklusive snäpplocket, ska vara stängt för alla reagens under förvaring. Utspädda lösningar (ISH Stringent Wash Buffer arbetslösning och ISH Pre-Treatment Solution arbetslösning) kan förvaras vid 2-8 C i 30 dagar. Använd inte reagensen efter det utgångsdatum som är tryckt på reagensets behållare. Under lagring ska locket, inklusive snäpplocket, vara stängt. Användaren måste kontrollera reagensprestanda om reagensets förvaringsförhållanden avviker från vad som specificerats (15). Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normala celler i det analyserade vävnadssnittet. Om ett oväntat fluorescensmönster observeras som inte kan förklaras och ett problem med HER2 IQFISH pharmdx misstänks kontaktar du Dakos tekniska support. Stabilitet i Dako Omnis-instrumentet Stabiliteten i instrumentet för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och tillbehörsreagensen: ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) och ISH Pepsin (Dako Omnis) är 80 timmar. Stabiliteten i instrumentet för ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) och ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) är 7 dagar. Dako Omnis-programvaran håller reda på kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet. Användning av utgångna reagens resulterar i en varning från Dako Omnis-instrumentet, alla objektglas som färgats med utgångna reagens kommer att ändra status till misstänkta och objektglasloggen på arbetsstationen visar att ett utgånget reagens har använts. Provförberedning - Mage Prover på adenocarcinom i magen eller den gastroesofageala förbindelsen från biopsier, excisioner eller resektioner måste hanteras så att vävnaden bevaras för FISH-analys. Standardmetoder för vävnadsbehandling för immunhistokemisk färgning ska användas för alla prover (16). Vid testning av små biopsiprover måste man säkerställa att tumörmorfologin är intakt och att det finns tillräckligt många kärnor för räkning. Om en HER2 FISH-analys utförs på ett biopsiprov måste flera (7-8) biopsier från olika delar av tumören analyseras för att man ska uppnå en tillförlitlig bestämning av HER2-status. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 30/54

31 Magcancer Paraffininbäddade snitt Endast vävnad som konserverats i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddats lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis göras till block med en tjocklek på 3-4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Biopsiproverna fixerades i 6-8 timmar i ToGA-prövningen [för studiereferens, se (28)]. Vävnaderna dehydreras i en graderad serie av etanol och xylen, följt av infiltrering av smält paraffin, som hålls vid högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader har obegränsad hållbarhet före snittning och montering på objektglas om de förvaras svalt (15-25 C) (16-17). Andra fixeringsmedel är inte lämpliga. Vävnadsprover ska snittas i 3-6 µm tjocka snitt. Objektglasen som krävs för HER2-genamplifieringsanalys och bekräftelse av tumörnärvaro ska förberedas samtidigt. Minst två seriella snitt rekommenderas, ett snitt för tumörnärvaro färgat med hematoxylin och eosin (H&E-färgning), samt ett snitt för HER2 -genamplifieringsanalys. Vi rekommenderar att vävnadssnitt monteras på Dako FLEX IHC Microscope Slides, kod K8020. Superfrost Plus objektglas (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) är också lämpliga. Se till att objektglasens utgångsdatum inte har passerat. Proverna ska analyseras inom <6 månader efter att snitten skapats vid förvaring vid 2 25 C. OBS! Vävnadsproverna måste placeras på objektglaset inom det definierade färgningsområdet för objektglas. Se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för dimensioner på färgningsområdet för objektglas. INSTRUKTIONER FÖR ANVÄNDNING - Mage A. Reagensberedning - Mage A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Flaskan med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) innehåller en guldbelagd metallkula som används för blandning. Innan flaskan laddas på Dako Omnis måste reagenset vara tinat och ordentligt blandat eftersom det fassepareras under frysning. Använd Dako Omnis Mixing Device för probblandning. Följ proceduren nedan för probblandning på Dako Omnis Mixing Device och se blandningsenhetens användarhandbok för mer information. 1. Ta ut flaskan med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ur frysen 2. Ladda flaskan på Dako Omnis Mixing Device 3. Anslut blandningsenheten och kontrollera att den gröna statuslampan lyser 4. Välj programmet Thaw + mix ( Tina + blanda ). Viktigt: Flaskor som lagras under -25 C ska tinas (endast precis) innan flaskan laddas på Dako Omnis Mixing Device och programmet Mix ( Blanda ) ska användas. 5. Ta bort flaskan från blandningsenheten. 6. Öppna snäpplocket, dra det bakåt och snäpp fast det i utskärningen (se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för mer information). 7. Ladda omedelbart flaskan i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis-instrumentet. Om funktionen för kontinuerlig reagensladdning används under färgningskörningen ska du se till att tiden från blandning till aspiration av flaskan vid Dako Omnis är minst 10 minuter. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-proben kan tinas på nytt och användas upp till 10 gånger. Blanda alltid HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-proben strax före laddning på instrumentet. Skaka inte. Den totala tiden för produktens stabilitet i instrumentet för ISH HER2 ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 31/54

32 Magcancer IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är 80 timmar när den förvaras i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ska efter tiden den förvarats på Dako Omnis omedelbart överföras till < -18 C (-18 C till -25 C rekommenderas). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Bered en arbetslösning genom att späda ut ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 på följande sätt: 1. Fyll en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska, märkt PTB (blå etikett), till fyllningslinjen med avjoniserat vatten (3,325 L). Se till att bulkflaskan placeras på en horisontell yta före fyllning. 2. Töm en flaska med 175 ml ISH förbehandlingslösning (20x) (Dako Omnis) i bulkflaskan. 3. Ta etiketten från koncentratflaskan och fäst den på bulkflaskan. Sätt fast bulkflaskans lock och vänd försiktigt upp och ned på bulkflaskan 2 3 gånger. 4. Använd den manuella Dako Omnis-streckkodsläsaren för att identifiera reagenset (skanna den löstagbara etiketten och bulkflaskan). 5. Ladda omedelbart bulkflaskan i Dako Omnis-instrumentet. Den utspädda lösningen kan användas inom 7 dagar om den förvaras på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2 8 C i 30 dagar. Efter kall förvaring ska du se till att den utspädda lösningen når minst 18 C innan den laddas på Dako Omnis. OBS! Kassera den utspädda lösningen om den är grumlig. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Bered en arbetslösning genom att späda ut ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 på följande sätt: 1. Fyll en Dako Omnis 3,5 L bulkflaska, märkt PTB (blå etikett), till fyllningslinjen med avjoniserat vatten (3,325 L). Se till att bulkflaskan placeras på en horisontell yta före fyllning. 2. Töm en flaska med 175 ml ISH stringent tvättbuffert (20x) (Dako Omnis) i bulkflaskan. 3. Ta etiketten från koncentratflaskan och fäst den på bulkflaskan. Sätt fast bulkflaskans lock och vänd försiktigt upp och ned på bulkflaskan 2 3 gånger. 4. Använd den manuella Dako Omnis-streckkodsläsaren för att identifiera reagenset (skanna den löstagbara etiketten och bulkflaskan). 5. Ladda omedelbart bulkflaskan i Dako Omnis-instrumentet. Den utspädda lösningen kan användas inom 7 dagar om den förvaras på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnis-programvaran (se ovan). Oanvänd utspädd lösning kan förvaras vid 2-8 C i upp till 30 dagar. Efter kall förvaring ska du se till att den utspädda lösningen når minst 18 C innan den laddas på Dako Omnis. OBS! Kassera den utspädda lösningen om den är grumlig. A.4 ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) är ett bruksfärdigt reagens. Före laddning på Dako Omnis öppnar du flaskans snäpplock, drar det bakåt och snäpper fast det i utskärningen. Den totala tiden för produktens stabilitet i instrumentet för ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) är 80 timmar när den förvaras i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnisprogramvaran (se ovan). När körningen är klar kan ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) överföras till förvaringstemperatur (2-8 C) för at t bevara tiden för stabilitet i instrumentet. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 32/54

33 Magcancer A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) är en bruksfärdig lösning. Före laddning på Dako Omnis ska du se till att reagenset är tinat och sedan öppnar du flaskans snäpplock, drar det bakåt och snäpper fast det i utskärningen. Den totala tiden för produktens stabilitet i instrumentet för ISH Pepsin (Dako Omnis) är 80 timmar när den förvaras i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen) på Dako Omnis. Kvarstående tid för produktens stabilitet i instrumentet kontrolleras av Dako Omnisprogramvaran (se ovan). När körningen är klar ska ISH Pepsin (Dako Omnis) överföras till förvaringstemperatur (-18 8 C) för att bevara tide n för stabilitet i instrumentet. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) är ett bruksfärdigt monteringsmedium som används utanför Dako Omnis-instrumentet. Överför Fluorescence Mounting Medium till förvaringstemperatur (2-8 C) omedelbart efter anvä ndning. A.7 Ytterligare tillbehör Följande tillbehör ska vidare finnas på Dako Omnis: avjoniserat vatten, utspädd Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kod GC807, Clearify (Dako Omnis), kod GC810, ISH Cleaning Solution, kod GC207 och ISH Lid (Dako Omnis), kod GC102 som specificeras i användarhandboken till Dako Omnis. B. Färgningsprocedur - Mage B.1 Procedurnoteringar HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) är hybridiseringsproben för den automatiserade direkta fluorescerande in situ-hybridiseringen (FISH) på Dako Omnis-instrumentet och är, tillsammans med tillbehörsreagensenheter GM300, GM301, GM302, GM303 och GM304 (GM304 utanför instrumentet), utformad för kvantitativ bestämning av HER2-genamplifiering. Före användning ska användaren läsa alla instruktioner noggrant och vara förtrogen med alla komponenter och deras försiktighetsåtgärder. Den automatiska proceduren på Dako Omnis inkluderar avparaffinering av vävnadssnitt, målåtervinning, nedbrytning med pepsin, hybridisering och stringenttvätt. Objektglasen tas ut på den torra uttagningsstationen. Alla protokollsteg är förprogrammerade i programvaran för Dako Omnis. Se användarhandboken till Dako Omnis för instruktioner om laddning av objektglas, ISH Lid (Dako Omnis), reagens osv. Tre validerade HER2 IQFISH-protokoll: HER2 IQFISH Pepsin Short (kort), HER2 IQFISH Pepsin Medium (medellångt) och HER2 IQFISH Pepsin Long (långt) som endast skiljer sig i tiden för nedbrytning med pepsin, är förprogrammerade i programvaran för Dako Omnis och kan väljas för vart och ett av de fem objektglasen i objektglashållaren. Detta möjliggör optimering av vävnadsnedbrytning som kan bero på förhållanden före analys. Protokollet HER2 IQFISH Pepsin Medium (medellångt) ses som standardprotokollet. De olika färgningsprotokollen kan ses på Dako Link Omnis-arbetsstationen. B.2. Förfärgningsprocedur 1. Välj HER2 IQFISH-protokollet som ska användas för varje objektglas från programvaran för Dako Link Omnis-arbetsstationen under IQFISH-protokoll. 2. Skriv ut objektglasens etiketter och fäst dem på objektglasen. 3. Placera objektglasen i objektglashållaren. Se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för mer information. En objektglashållare kan hålla mellan ett och fem objektglas. Vi rekommenderar att minst två objektglas färgas i en HER2 IQFISH-färgningskörning. 4. Ladda objektglashållaren i Dako Omnis-instrumentet. 5. Ladda ISH Lid (ett ISH Lid per objektglashållare) på Dako Omnis. 6. Se till att bulkflaskor med vätska är inuti instrumentet och att de är registrerade av Dako Omnis-instrumentet. Bulkflaskor med vätska: Clearify (klargöringsmedel), utspädd ISH Pre- ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 33/54

34 Magcancer Treatment Solution (Dako Omnis), utspädd ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) och utspädd Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Ladda ISH Ethanol Solution, 96 % (Dako Omnis) och ISH Pepsin (Dako Omnis), den nyblandade HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och ISH Cleaning Solution (Dako Omnis) i Reagent Storage Module (reagensförvaringsmodulen). Se till att alla flaskors snäpplock är öppna. 8. Följ anvisningarna på pekskärmen och tryck på Done ( Klar ) för att starta färgningsproceduren. B.3. Färgningsprocedur HER2 IQFISH-färgningsproceduren på Dako Omnis-instrument (sammanfattas i tabell 11) kan övervakas på Dako Link Omnis-arbetsstationen: Tabell 11. Förenklad översikt över protokollstegen för HER2 IQFISH-färgning. Steg Reagens Tid och temperatur Dewax Clearify (klargöringsmedel) 10 minuter, 38 C Målåtervinning ISH Pre-Treatment Solution 15 minuter, 97 C (Dako Omnis) Tvätt ISH Ethanol Solution, 96 % 2 x 3 minuter, 32 C (Dako Omnis) Nedbrytning* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minuter, 15 minuter eller 20 inuter Torkning 15 minuter, 45 C Denaturering 10 minuter, 66 C Hybridisering HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 minuter, 45 C Stringenttvätt ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minuter, 61 C * Tre validerade tider för nedbrytning med pepsin kan väljas med hjälp av HER2 IQFISH-protokollen ovan. Om inga ytterligare ISH-färgningar är nära förestående överför du alla reagens till de rekommenderade förvaringstemperaturerna. B.4. Efterfärgningsmetod Ta ut objektglasen och tillför upp till 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med DAPI till objektglasets målområde. Vävnadssnittet måste vara helt täckt av Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Använd ett täckglas. Obs!Objektsglasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om objektsglasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara glasen i mörker vid C för att minimera blekning. Kvalitetskontroll - Mage 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. 2. Normala celler gör att man kan göra en intern kontroll av färgningskörningen. Normala celler ska ha 1-2 klart synliga gröna signaler som tecken på att CEN-17 PNAproben framgångsrikt har hybridiserats till den centromeriska regionen av kromosom 17. Normala celler ska också ha 1-2 klart synliga röda signaler som tecken på att HER2 DNAproben framgångsrikt har hybridiserats till HER2-genen/generna. På grund av vävnadssnittningen kan vissa normala celler ha färre än de förväntade två signalerna av varje färg. Om inga signaler detekteras i normala celler är det ett tecken på att analysen misslyckats och resultaten ska anses ogiltiga. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 34/54

35 Magcancer 3. Nukleär morfologi måste vara intakt vid utvärdering med ett DAPI-filter. Många spöklika celler och en allmänt dålig nukleär morfologi tyder på övernedbrytning av provet, vilket resulterar i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prover ska anses ogiltiga. 4. Ett minimum av 20 tumörceller måste kunna utvärderas. 5. Skillnader i vävnadsfixering, behandling, och inbäddning i användarens laboratorium kan producera variabilitet i resultaten som gör regelbunden utvärdering av egna kontroller nödvändiga. Färgningstolkning - Mage Bedömningsbar vävnad Lokalisera tumören inom det H&E-färgade glaset och utvärdera samma område på det FISH-färgade glaset (i DAPI-filtret). Endast prover från patienter med adenocarcinom i magen eller den gastroesofageala förbindelsen ska analyseras. I fall med intestinal metaplasi och adenocarcinom i samma prov ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Undvik svårt inflammerade områden, nekros och områden där de nukleära gränserna är tvetydiga. Tag inte med kärnor som kräver subjektiv bedömning. Hoppa över kärnor med svag signalintensitet och icke-specifik eller hög bakgrund. Börja med en mikroskoputvärdering av den fullständiga FISH-färgade delen respektive området som tilldelats på H&E-delen. Före räkning av den FISH-färgade delen ska den allmänna signalfördelningen (homogena eller heterogena) i signalräkningsformuläret observeras. I fall av heterogen fördelning kontrollerar du om antingen fokal amplifiering eller enkelcellsamplifiering (mosaik) är närvarande. 1) Homogen signalfördelning I fall av homogen signalfördelning räknar du antalet kromosomcentromerer (gröna signaler) respektive antalet HER2-gener (röda signaler) från 20 celler i 1-2 representativa tumörområden. 2) Heterogen signalfördelning Om signalfördelningen är heterogen räknar du totalt 20 celler från utvalda områden som anges nedan: A) Om fokal amplifiering är närvarande bör områden med amplifierade celler väljas. B) Om mosaik-fördelning eller amplifierade, polysomala och disomala celler är närvarande, räkna i områden med amplifierade celler. Inom dessa områden ska inte bara amplifierade celler utan också intilliggande icke-amplifierade celler räknas till totalt 20 celler. Välj inte överlappande områden om möjligt. Ignorera färgning av bakteriellt DNA Ett antal specialiserade celler (mastceller och makrofager), som är närvarande uppblandat i magvävnaden, uppvisar en hög nivå av färgning av HER2-proben på grund av närvaro av bakteriellt DNA. Detta leder till starkt röda fluorescerande celler, som skiljer sig klart och tydligt från tumörceller med en hög HER2-genamplifiering. Signalräkning När ett område har valts för signalutvärdering, påbörjar du analysen i en av de 20 intilliggande kärnorna som valts och räknar sedan cell för cell samtidigt som du utelämnar kärnor som inte uppfyller kvalitetskriterierna. Lokalisera tumören inom det H&E-färgade glaset och utvärdera samma område på det FISH-färgade glaset. Granska hela det färgade objektglaset för att redovisa möjlig heterogenitet. Välj ett område med god fördelning av kärnor. Börja analysen i den övre vänstra kvadranten i det valda området och medan du skannar från vänster till höger räknar du antalet signaler inom kärngränserna för varje utvärderad kärna enligt riktlinjerna nedan (se också Bilaga 5). - Fokusera uppåt och nedåt för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna - Räkna två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd (lika med eller) mindre än signalens diameter som bara en signal. Avståndet måste vara åtminstone lika med ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 35/54

36 Magcancer diametern för en signal av normal storlek för att den ska räknas som två individuella signaler. När avståndet mellan två signaler är mindre än signalens diameter räknas den som en. - I kärnor med höga nivåer av HER2-genamplifiering kan HER2-signalerna ligga mycket nära varandra och bilda kluster av signaler. I dessa fall kan antalet HER2-signaler inte räknas utan måste uppskattas. Speciell uppmärksamhet måste ges åt de gröna signalerna eftersom kluster med röda HER2-signaler kan täcka de gröna signalerna och göra dem omöjliga att se. Om du tvekar kontrollerar du de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter. Räkna inte kärnor utan signaler eller de med signaler som bara har en färg. Räkna bara de kärnor som har en eller fler FISH-signaler av varje färg. Signalräkningsguide 1 Ta inte med. Kärnorna överlappar, kärnornas alla områden syns inte 2 Två gröna signaler, räkna inte kärnor med signaler som bara har en färg 3 Räkna som 3 gröna och 12 röda signaler (klusteruppskattning) 4 Räkna som 1 grön och 1 röd signal. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en 5 Räkna inte (över- eller undernedbrutna kärnor). eller Saknade signaler i mitten av kärnor (donut-formade kärnor). 6 Räkna som 2 gröna och 3 röda signaler. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en 7 Räkna som 1 grön och 5 röda signaler 8 Räkna som 3 gröna (1 grön ej i fokus) och 3 röda signaler 9 Kluster med röda signaler som skymmer gröna signaler, kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter eller räkna inte Registrera räknade signaler i en tabell så som visas i Bilaga 3 och 4. Räkna 20 kärnor per vävnadsprov när det är möjligt från distinkta tumörområden. Beräkna HER2/CEN-17-kvoten genom att dividera antalet röda HER2-signaler med det totala antalet gröna CEN-17-signaler. Prover med en HER2/CEN-17-kvot över eller lika med 2 ska anses vara HER2-genamplifierade (29). Resultat vid eller nära gränsen (1,8-2,2) ska tolkas med försiktighet. Om kvoten är ett gränsfall (1,8-2,2) räknar du 40 olika kärnor och beräknar kvoten för de 40 kärnorna. Om räkningen fortsätter att vara gränsfall, kommer resultatet för den andra bedömningen att vara giltig. Den immunhistokemiska färgningen av HER2 ska i förekommande fall inkluderas för bättre orientering under den andra räkningen. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 36/54

37 Om du tvekar ska provglaset räknas om på nytt. Vid gränsfall finns det anledning att låta patologen konsultera med den behandlande läkaren. Magcancer Begränsningar - Mage 1. Endast för automatisk användning på Dako Omnis-instrument. 2. Särskild utbildning krävs för vävnadsval, fixering och objektglasberedning samt för IQFISH-färgningstolkning. Tolkningar av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-färgningar ska inte utföras av personer med färgsinnesdefekt. 3. FISH-resultat är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan påverka probhybridiseringen. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. Prestandaegenskaper - Mage Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten hos HER2 IQFISH pharmdx undersöktes med 180 formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt som testades på tre olika ställen i studien. Samtliga 180 vävnadssnitt gick att räkna enligt riktlinjerna för produkträkning. Hybridiseringseffektiviteten var 100 %. HER2/CEN-17-förhållandena som beräknades och användes i studierna av prestandaegenskaper baseras på räkning av signaler i 20 kärnor med hjälp av poängriktlinjerna som beskrivs i avsnittet Tolkning av färgning i den här bruksanvisningen. Analytisk sensitivitet Den analytiska känsligheten hos HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) undersöktes med hjälp av 20 olika vävnadsprover av adenocarcinom i magen (10 prover med amplifierad HER2- genstatus och 10 icke-amplifierade prover). Förhållandet mellan antalet HER2-signaler och CEN- 17-signaler beräknades grundat på en räkning av signaler från 20 kärnor i normala celler i vävnadsprovet. HER2/CEN-17-förhållandet för de 20 vävnadsproverna av adenocarcinom i magen var mellan 0,94 och 1,19. Analytisk specificitet HER2 DNA-proberna i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har sekvenserats och mappats för att bekräfta att de täcker totalt 218 kb inklusive HER2-genen. CEN-17 PNA-proberna i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har testats individuellt och i kombination för att bekräfta deras specifika hybridisering till den centromeriska regionen på kromosom 17. För att utesluta korshybridisering till andra kromosomer än kromosom 17, utfördes undersökningar av metafasspridning enligt standardiserade Dako kvalitetskontrollprocedurer. Totalt 275 metafasspridningar utvärderades för specifik hybridisering av HER2 DNA- och CEN-17 PNA-probmixarna. I alla 275 fall var hybridiseringen specifik för kromosom 17. Ingen korshybridisering till loci på andra kromosomer observerades i några av de 275 fallen. Probspecificiteten var då 100 % (275 av 275). För att mäta IQFISH-analysens förmåga att enbart identifiera målen HER2 och CEN-17 utan interferens av andra substanser utfördes studier på vävnadsprover av adenocarcinom i magen genom att utesluta HER2- och CEN-17-proberna från hybridiseringsblandningen och endast använda hybridiseringsbufferten. Totalt 20 prover utvärderades med avseende på förekomst av signaler som inte var relaterade till probmixen. Ingen detektion av andra kromosommål eller interferens från andra relaterade substanser observerades i något av de 20 proverna. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 37/54

38 Magcancer Robusthetsstudier Robustheten hos analysen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) testades genom att variera PNA-probkoncentrationen, målåtervinning, pepsininkubationstid, denatureringstid, hybridiseringstid, stringenttvättid och temperatur. De olika parametrarna testades på tre olika FFPE-vävnadsprover av adenocarcinom i magen och två FFPE-vävnadsprover från den gastroesofageala förbindelsen (GEJ) (både amplifierade och icke-amplifierade vävnadsprover ingick i varje grupp). Alla parametrar testades både under och över standardprotokollinställningarna med undantag för PNA-probkoncentration och temperatur för stringenttvätt, för vilka standardprotokollinställningarna ingick i uppställningen. Testparametrarna var: PNA-probkoncentration: Testad vid 100 % och +/-17 %. Målåtervinningstid: Testad vid 13 min 45 s och 16 min 15 s. Pepsininkubationstid: Testad vid14 min 45 s och 16 min 15 s. Denatureringstid: Testad vid 9 min 45 s och 10 min 45 s. Hybridiseringstid: Testad vid 70 min och 80 min. Stringenttvättid: Testad vid 8 min 45 s och 11 min 15 s. Stringenttvättemp.: Testad vid 59 C, 61 C och 63 C. De tre PNA-probkoncentrationerna utvärderades i en uppdelad försöksmodell (JMP tool, SAS) som utfördes med 12 olika färgningsprotokoll så som visas i tabell 12. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 38/54

39 Magcancer Tabell 12. Tolv olika färgningsprotokoll användes i robusthetsstudien. Testparameter Robusthet, protokollnr Målåtervinningstid (min) Pepsintid (min) Denatureringstid (min) Hybridiseringstid (min) Stringenttvättid (min) Stringenttvättemp. ( 0 C) PNAkonc. i probmix 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Alla fem vävnadsprover färgades med alla 12 protokollen. Mätvärdena för robusthetsstudien var signalintensitet och morfologikvalitet. Alla protokoll gav färgning i alla vävnadsprover (60 totalt) med signaler som var starka, tydliga och lätta att utvärdera, och därmed lämpliga för signalräkning. Dessutom testades effekten av vävnadstjocklek på analysresultaten för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) genom att vävnadstjockleken hos FFPE-vävnadsproverna av magcancer varierades. Totalt fem på varandra följande snitt av fem magcancerprover med olika tjocklek (2, 3, 4, 5, 6 och 7 µm) testades med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Den genomsnittliga varianskoefficienten för HER2/CEN-17-förhållandet var 3,9 % (från 3,2 % till 5,0 %). Reproducerbarhet Reproducerbarheten mellan loter och från dag till dag inom samma laboratorium testades med hjälp av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Studien utformades som en intern, blindad, randomiserad studie av HER2/CEN-17-förhållanden med hjälp av snitt från åtta olika formalinfixerade och paraffininbäddade magcancerprover inklusive den gastroesofageala förbindelsen (GEJ) med olika nivåer av HER2-genamplifiering. De åtta proverna testades med HercepTest och utgjordes av två prover HER2 IHC 0/1+, två prover med HER2 IHC 2+, två prover med HER2 IHC 3+ och två prover med ett förutbestämt HER2/CEN-17 FISH-förhållande mellan 1,5 och 2,5 som erhållits med hjälp av HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). Varje prov färgades med tre olika loter av HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) på fem dagar som inte följde på varandra. Totalt 240 vävnadsfärgningar bearbetades för hela studien eftersom varje kombination färgades i duplikat. Variationen av förhållandena mellan dagar och loter visas i figur 8. Data analyserades med Box-Cox-transformation via en linjär paneldatamodell för att erhålla homogen datavarians. Den totala variationskoefficienten uppskattades till 6,5 % och det påvisades att variation från dag till dag och mellan loter bidrog med 0,7 % respektive 0,8 %. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 39/54

40 Magcancer Figur 8. HER2/CEN-17-förhållanden erhölls i en studie över reproducerbarhet inom laboratoriet på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), där ändpunkterna för reproducerbarhet inkluderade de för lot till lot och dag till dag. Medelvärdet för varje vävnadsprov visas med en vågrät linje. Dessutom testades reproducerbarheten från dag till dag och mellan laboratorier för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) externt i en stratifierad och blindad studie med tre ställen (ett ställe i USA och två ställen i Europa) på vävnadssnitt från 12 olika formalinfixerade, paraffininbäddade prover av adenocarcinom i magen inklusive den gastroesofageala förbindelsen (GEJ). Tre prover var HER2 IHC 0/1+, tre prover var HER2 IHC 2+, tre prover var HER2 IHC 3+ och tre prover hade ett förutbestämt HER2/CEN-17 FISH-förhållande mellan 1,5 respektive 2,5 som erhållits med hjälp av HercepTest TM respektive HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731). Proverna färgades och analyserades på ställena för studien. Samtliga prover färgades minst sju gånger på sju dagar som inte följde på varandra och poängsattes av en observatör på varje ställe. 314 snitt färgades och inkluderades i den statistiska analysen. Data analyserades med Box-Cox-transformation och varianskomponenterna beräknades. Den totala varianskoefficienten, baserad på den övre konfidensgränsen på 95 %, var 24 %. HER2/CEN-17-förhållandets variation för dag och ställe visas i figur 9. Figur 9. Variabilitetsgraf för HER2/CEN-17-förhållanden i icke-transformerade enheter som erhållits i reproducerbarhetsstudien för dag till dag och ställe till ställe för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på vävnadsprover av magcancer. Analysen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) testades med avseende på reproducerbarhet för olika observatörer som en del av den internt utförda metodjämförelsestudien som använde tre observatörer för att oberoende poängsätta de färgade proverna. Reproducerbarhet testades på 139 olika prover av adenocarcinom i magen med antingen icke-amplifierad eller amplifierad HER2-genstatus. Data analyserades med Box-Cox-transformation. Den genomsnittliga variationskoefficienten mellan observatörer var 18 %. Proverna av adenocarcinom i magen ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 40/54

41 Magcancer utgjordes av 96,4 % resektionsprover och 5,6 % biopsiprover. 81,3 % av proverna togs från magen och 18,7 % från den gastroesofageala förbindelsen. Repeterbarhet Repeterbarhet inom laboratoriet för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) testades med åtta på varandra följande prover av adenocarcinom från magen med antingen icke-amplifierad eller amplifierad HER2-genstatus. Vävnaderna testades i duplikat på fem dagar som inte följde på varandra med tre olika loter i totalt 240 objektglas (120 snitt i duplikat). Den linjära paneldatamodellen användes för dataanalys och resulterade i en varians som kan hänföras till dags- och lotvariationer (se studien ovan om intern reproducerbarhet). Den kvarvarande variansen förklarar variansen mellan replikat och därmed repeterbarhet. Den övre konfidensgränsen på 95 % för variationskoefficienten för repeterbarhet var 7,1 %. Metodjämförelsestudie Jämförelse av resultat för HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) och HER2 IQFISH pharmdx (K5731) I studien ingick 140 magcancerprover som utgjordes av olika vävnadstyper för gastriskt adenocarcinom, dvs. magen eller den gastroesofageala förbindelsen (GEJ) och resektioner eller biopsier med homogen eller heterogen (fokal eller mosaik) signalfördelning så som visas i tabell 13. Tabell 13. Fördelningen av prover i gastrisk cancertyp (mage eller GEJ), signalfördelningskategori (homogen eller heterogen) och vävnadstyp (resektion eller biopsi). Gastrisk cancertyp Antal prover Signalfördelning Antal prover Vävnadstyp Antal prover Magsäck 113 Homogen 58 Resektion 134 Gastroesofageala förbindelsen (GEJ) 27 Heterogen - mosaik Heterogen - fokal Biopsi 6 Totalt 140 Totalt 140 Totalt 140 Proverna utgjordes av 76 icke-amplifierade HER2-fall och 64 amplifierade HER2-fall med känd HercepTest -poäng så som visas i Tabell 14. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 41/54

42 Magcancer Tabell 14. Fördelning av prover baserat på HercepTest -poäng och HER2 FISH-poäng som erhållits med HER2 FISH pharmdx Kit (K5731). HercepTest -färgningspoäng Totalt n HER2 FISH-status Amplifierad Icke-amplifierad Totalt antal FISH-testade prover Resultatet av korstabulering av HER2-status som erhållits från de två analyserna med beräkning av total procentuell överensstämmelse (OPA), procentuell positiv överensstämmelse (PPA) och procentuell negativ överensstämmelse (NPA) visas i Tabell 15. Korrelation mellan HER2/CEN- 17-förhållanden med hjälp av de två analyserna visas i figur 10. Tabell 15. Korstabulering av HER2-genstatus som erhölls med HER2 IQFISH pharmdx (K5731) och HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). HER2-genstatus (K5731) Totalt Ickeamplifierad Amplifierad Icke-amplifierad HER2- genstatus (Dako Omnis) Amplifierad Totalt OPA: 99,3 % PPA: 98,4 % NPA: 100 % Figur 10. Korrelation mellan HER2/CEN-17-förhållanden med HER2 FISH pharmdx (Dako Omnis) och HER2 IQFISH pharmdx (kod K5731) på 140 prover av magcancer (linjär passning: y = 0,06 + 0,97*x; R 2 = 0,97. Viktade med inverterad varians för att tillåta linjär passning). Konfidensintervallet på 95 % för den genomsnittliga skillnaden mellan de två olika färgningsmetoderna vid HER2/CEN-17-förhållande = 2 befanns vara [0,007; 0,022]. Det betyder att en skillnad över 2 % inte är förväntad. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 42/54

43 Magcancer Kliniska data Klinisk säkerhet och effektivitet för trastuzumab (Herceptin ) har påvisats i BO18255-studien (ToGA-studien: En öppen, randomiserad, multicenter, fas III-studie av trastuzumab i kombination med cisplatin och en fluoropyrimidin (capecitabin eller 5-fluoruracil) (FC+H) jämfört med endast kemoterapi som första linjens behandling i patienter med HER2-positiv långt framskriden magcancer.)(28). Studien skapades som en öppen, randomiserad, multicenter fas III-studie av HER2-positiva patienter med långt framskridet adenocarcinom i magen eller gastroesofageala förbindelsen. I BO18255-studien definierades HER2-positivitet som antingen IHC-positiv (3+) med HercepTest (Dako) och/eller FISH-positiv (HER2/CEN-17 2,0) med HER2 FISH pharmdx Kit (Dako). Efter inklusion i studien randomiserades patienterna för att få kemoterapi (5-FU eller capecitabin och cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Det huvudsakliga måttet på effektivitet var total överlevnad (overall survival, OS) vid analys med stratifierat log rank-test. Den slutliga OS-analysen som baserades på 351 dödsfall var statistiskt signifikant (nominell signifikansnivå på 0,0193). En uppdaterad OS-analys utfördes också ett år efter den slutliga analysen. Medianen på 13,5 för total överlevnad på armen med Herceptin plus kemoterapi var signifikant längre jämfört med medianen på 11,0 månader för total överlevnad på armen med enbart kemoterapi. Effektivitetsresultaten för både de slutliga och uppdaterade analyserna summeras i tabell 16 och figur 11. Tabell 16. Total överlevnad i population avsedd för behandling (Intention to Treat, ITT). Slutlig total överlevnad Antal dödsfall (%) Median 95 % KI (mos.) Riskförhållande 95 % CI p-värde*, dubbelsidigt Uppdaterad total överlevnad Antal dödsfall (%) Median 95 % KI (mos.) Riskförhållande 95 % CI FC-arm N= 296 *Jämfört med den nominella signifikansnivån på 0, (62,2 %) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7 %) 11,7 (10,3, 13,0) 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) FC + H-arm N= (56,0 %) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2 %) 13,1 (11,9, 15,1) ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 43/54

44 Magcancer Figur 11. Uppdaterad total överlevnad i patienter med metastatisk magcancer En explorativ analys av OS baserad på genamplifiering (FISH) och test av proteinöveruttryck (IHC) finns summerad i tabell 17. Tabell 17. Undersökande analyser av HER2-status med resultat för uppdaterad total överlevnad. FISH+/IHC 0, 1+-undergrupp (N=133) Antal dödsfall/n (%) Medianlängd för OS (mos.) 95 % KI (mos.) FC FC+H N=296 a N=298 b 57/71 (80,3 %) 8,8 (6,4, 11,7) Riskförhållande (95 % KI) 1,33 (0,92, 1,92) FISH+ / IHC2+-undergrupp (N=160) Antal dödsfall/n (%) 65/80 (81 %) Medianlängd för OS (mos.) 10,8 95 % KI (mos.) (6,8, 12,8) Riskförhållande (95 % KI) 0,78 (0,55, 1,10) FISH+ eller FISH-/IHC3+ c -undergrupp (N=294) Antal dödsfall/n (%) Medianlängd för OS (mos.) 95 % KI (mos.) 104/143 (73 %) 13,2 (11,5 15,2) Riskförhållande (95 % KI) 0,66 (0,5, 0,87) Medianen för överlevnad uppskattades med hjälp av Kaplan-Meier-kurvor. 56/62 (90,3 %) 8,3 (6,2, 10,7) 64/80 (80 %) 12,3 (9,5, 15,7) 96/151 (64 %) 18,0 (15,5, 21,2) a Två patienter på FC-armen som var FISH+ men med okänd IHC-status uteslöts från analyserna. b Fem patienter på Herceptin -armen som var FISH+ men med okänd IHC-status uteslöts från analyserna. c Inkluderar 6 patienter på kemoterapiarmen, 10 patienter på Herceptin -armen med FISH-, IHC3+ och 8 patienter på kemoterapiarmen, 8 patienter på Herceptin -armen med okänd FISH-status, IHC3+. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 44/54

45 Magcancer Felsökning - Mage Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 2. Områden utan signal 1a. Reagens har utsatts för höga temperaturer under transport eller förvaring 1b. Mikroskopet fungerar inte tillfredsställande - Olämpligt filter insatt - inte rätt lampa - kvicksilverlampan för gammal - Smutsiga och/eller spruckna kollektorlinser - Olämplig immersionsolja 1a. Kontrollera förvaringsförhållandena. Kontrollera att torris fanns när IQFISH-probmixen och pepsinleveranserna togs emot. Kontrollera att reagensen har förvarats enligt specifikationerna. 1b. Kontrollera mikroskopet och att de använda filtren är lämpliga för användning med probmixens fluorokromer och att kvicksilverlampan är av rätt typ och inte har använts bortom sin förväntade livslängd (se Bilaga 5). Om du tvekar, kontakta mikroskopförsäljaren. 1c. Blekta signaler 1c. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponering från starka ljuskällor. 1d. Buffertar identifieras felaktigt 2. Luftbubblor fastnade under montering 1d. Byt ut bulkbuffertar och säkerställ korrekt registrering (på arbetsstationen) och identifiering (på pekskärmen) för bulkbuffertar. Se den grundläggande användarhandboken för Dako Omnis för mer information. Observera: ISH Pre-Treatment Solution är grön och ISH Stringent Wash Buffer är gul. 2. Undvik luftbubblor. Om sådana observeras knackar du försiktigt bort dem med en pincett. 3. Överdriven bakgrundsfärgning 3a. Olämplig vävnadsfixering 3a. Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används. 3b. Långvarig exponering av hybridiserat snitt för starkt ljus 3b. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starkt ljus. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 45/54

46 Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 4. Dålig vävnadsmorfologi 5. Hög nivå av grön autofluorescens på objektglas inkluderar områden utan FFPE-vävnad Magcancer 4a. Felaktig pepsinbehandling 4a. Byt till ett annat av de tre olika färgningsprotokollen. Se till att ISH Pepsin förvaras vid korrekt temperatur. 4b. Alltför lång pepsinbehandling eller mycket tunna snitt kan göra att spökceller eller donutceller visar sig. 5. Användning av utgångna eller icke-rekommenderade objektglas. 4b. Prova ett färgningsprotokoll med kortare pepsininkubationstid. Kontrollera att snittjockleken är 3 6 µm. 5. Välj objektglas enligt specifikationerna. Se till att objektglasens utgångsdatum inte har passerat. OBS! Om problemet inte kan härledas till någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna korrigeringsåtgärden inte löser problemet kontaktar du Dakos tekniska support för vidare assistans. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 46/54

47 Magcancer Bilaga 3 - Mage HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kod GM333 Poängschema Datum för körningen: Färgningskörningens logg-id: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lot: Prov-ID: Karakterisering av signalfördelning i vävnad: Homogen: Heterogen Fokal: eller Heterogen Mosaik: Kärna nr HER2- poäng (röd) Räkna signaler i 20 kärnor CEN-17- poäng Kärna nr (grön) Totalt (1-10) Totalt (11-20) HER2- poäng (röd) CEN-17- poäng (grön) För bestämning av HER2/CEN-17-kvoten räknar du antalet HER2 -signaler och antalet CEN-17- signaler i samma 20 kärnor och dividerar det totala antalet HER2 -signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Om HER2/CEN-17-kvoten är ett gränsfall (1,8-2,2) räknar du 40 olika kärnor och räknar om kvoten för de 40 kärnorna (se poängschemat för omräkning, Bilaga 4). Ett förhållande vid eller nära gränsen ( ) ska tolkas med försiktighet (se räkningsguiden). ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 47/54

48 Magcancer Total poäng (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- förhållande Kvot < 2: HER2-genamplifiering observerades inte Kvot 2: HER2-genamplifiering observerades Datum och namnteckning, laboratorieassistent: Datum och namnteckning, patolog: För poängriktlinjer: se Färgningstolkning. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 48/54

49 Magcancer Bilaga 4 - Mage HER2 IQFISH pharmdx, kod GM333 Poängschema för omräkning Datum för körningen: Färgningskörningens logg-id: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lot: Prov-ID: Signaler i ytterligare 40 kärnor (1-40) Kärna nr HER2 (röd) CEN17 (grön) Kärna nr HER2 (röd) CEN-17 (grön) Kärna nr HER2 (röd) CEN-17 (grön) Kärna nr HER2 (röd) CEN-17 (grön) Totalt (1-10) Totalt (11-20) Totalt (21-30) Totalt (31-40) För bestämning av HER2/CEN-17-kvoten räknar du antalet HER2 -signaler och antalet CEN-17-signaler i samma 40 kärnor och dividerar det totala antalet HER2 -signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Rapportera de totala poängen från de 1-40 kärnorna i tabellen nedan. Total poäng (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- förhållande ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 49/54

50 Magcancer Kvot < 2: HER2-genamplifiering observerades inte Kvot 2: HER2-genamplifiering observerades Datum och namnteckning, laboratorieassistent: Datum och namnteckning, patolog: För poängriktlinjer: se Färgningstolkning. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 50/54

51 Magcancer Bilaga 5 - Mage HER2 IQFISH pharmdx, kod GM333 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar följande utrustning för användning med HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Mikroskoptyp Epifluorescensmikroskop 2. Lampa 100 watt kvicksilverlampa (håll reda på brinntiden) 3. Objektiv För screening av vävnaden kan oljeimmersion 16x eller 20x objektiv användas För högre förstoring och för räkning av signaler rekommenderas endast oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 100x 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI filter i kombination med ett högkvalitativt Texas Red/FITC dubbelfilter. DAPI-filter, t.ex. Chroma filter # Texas Red/FITC, dubbelfilter, t.ex. Omega Optical filter # XF53 eller Chroma filter # Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse och för räkning Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är utomordentligt viktigt för tolkningen. Om du vill ha detaljerad information kontakta din mikroskopleverantör eller din Dako-representant. 5. Olja Icke-fluorescerande olja Försiktighetsåtgärder En kvicksilverlampa på 50 watt rekommenderas inte Rhodaminfilter kan inte användas Trippelfilter rekommenderas inte Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunden ska övervaka och följa tillverkarens rekommendationer för kvicksilverlampan. Mikroskopet ska underhållas och kvicksilverlampan ska vara rätt inriktad innan du försöker tolka resultaten. Man ska sträva efter att exponera provet så lite som möjligt för excitationsljuset för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar uppställningen av ditt särskilda mikroskop med tillverkaren innan du börjar med den fluorescerande in situ-hybridiseringen, eller tittar i litteraturen. ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 51/54

52 Referenser 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 52/54

53 19. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3): Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2- positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, openlabel, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 53/54

54 Symbolförklaringar Katalognummer Temperaturbegränsning Använd före Medicinsk enhet för in vitro-diagnostik Får ej förvaras i direkt solljus (se avsnittet om Förvaring) Tillverkare Läs bruksanvisningen Batchkod GHS-symbolen (se avsnittet om försiktighetsåtgärder) Tillverkad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tel Fax Distribuerad i USA av: Dako North America Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Tel. 805/ , Gratisnummer: 800/ Orderinformation: Tel. 800/ Fax Teknisk support: Tel. 800/ ( ) P04125SE_01_GM333/ s. 54/54