HercepTest för Automated Link-plattformar

Transkript

1 HercepTest för Automated Link-plattformar Kod SK001 Utgåva 20 ( ) P04083SE_01_SK / s. 1/40

2 Innehållsförteckning Sida Avsedd användning...3 Sammanfattning och förklaring - Bröst...4 Procedurens princip - Bröst...4 Medföljande material - Bröst...5 HercepTest kontrollpreparat...5 Material som behövs men inte medföljer - Bröst...6 Försiktighetsåtgärder - Bröst...7 Förvaring - Bröst...8 Provförberedning - Bröst...8 Provförberedning - Bröst...8 Färgningsprocedur - Bröst...9 Kvalitetskontroll - Bröst...10 Färgningstolkning - Bröst...12 Begränsningar - Bröst...14 Produktspecifika begränsningar - Bröst...14 Prestandaegenskaper - Bröst...14 Felsökning - Bröst...18 Sammanfattning och förklaring - Mage...20 Procedurprincip - Mage...20 Medföljande material - Mage...21 HercepTest kontrollpreparat...21 Material som behövs men inte medföljer - Mage...22 Försiktighetsåtgärder - Mage...22 Förvaring - Mage...24 Provförberedning - Mage...24 Provförberedning - Mage...24 Färgningsprocedur - Mage...25 Kvalitetskontroll - Mage...27 Begränsningar - Mage...31 Produktspecifika begränsningar - Mage...31 Prestandaegenskaper - Mage...32 Felsökning - Mage...36 Referenser...38 Symbolförklaringar...40 ( ) P04083SE_01_SK / s. 2/40

3 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. HercepTest är en semikvalitativ immuncytokemisk analys för att bestämma överexpression av HER2-protein i bröstcancervävnader, som behandlats rutinmässigt för histologisk bedömning och formalinfixerad, paraffininbäddad cancervävnad från patienter med adenocarcinom i magen inklusive gastro-esofageala förbindelsen. HercepTest indikeras som ett hjälpmedel vid bedömningen av patienter för vilka Herceptin (trastuzumab) behandling övervägs (se produktbladet för Herceptin ). OBS endast för bröstcancer: Alla patienter i de kliniska prövningarna med Herceptin utvaldes med användning av en undersökande immuncytokemisk klinisk prövningsanalys (CTA). Inga av patienterna i dessa prövningar utvaldes med användning av HercepTest. HercepTest jämfördes med CTA på en oberoende sats prover och befanns ge acceptabelt överensstämmande resultat. Den egentliga korrelationen mellan HercepTest och Herceptin kliniskt resultat har inte fastställts. OBS endast för magcancer: Samtliga patienter i fas III-studien BO18255 (ToGA) som sponsras av Hoffmann- La Roche valdes ut med användning av Dako HercepTest (IHC) och Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Studien påvisade den kliniska nyttan av båda testerna för bedömning av HER2-status hos patienter med lokalt framskriden cancer som inte går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen. För den aktuella satsen, kod SK001, har reagensvolymerna justerats speciellt för användning med Dako Automated Link-plattformar. Adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, kallas även magcancer i detta dokument. HercepTest och Herceptin är varumärken som tillhör Genentech, Inc., under licenser som innehas av Dako Denmark A/S och F. Hoffmann-La Roche Ltd. För bröstcancerapplicering, var god se sidorna För magcancerapplicering, var god se sidorna Viktigt: Observera skillnaderna för bröstcancervävnad och magcancervävnad, speciellt i avsnitten Tolkning av färgning. ( ) P04083SE_01_SK / s. 3/40

4 Bröstcancer Sammanfattning och förklaring - Bröst Bakgrund: Den humana HER2-genen, (även kallad ERBB2 ellerneu) kodar ett protein som ofta kallas HER2-protein eller p185 HER2. HER2-proteinet är ett membranreceptortyrosinkinas med homologi med den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1 8). HER2-proteinet är en normal komponent, som uttrycks av flera olika epitelialcelltyper (8). Hos en del av patienter med bröstcancer, överutrycks HER2-proteinet som en del av processen för malign transformering och tumörprogression (9). Överexpression av HER2-proteinet på ytan av bröstcancerceller, antydde att det kunde vara en målorganism för antikroppsterapi. Herceptin (trastuzumab) är en humaniserad monoklonal antikropp (10), som binder med hög affinitet till HER2-proteinet och har visat sig hämma proliferationen av humana tumörceller som överuttrycker HER2-protein in vitro och in vivo (11 13). Egenskaper HercepTest utvecklades för att tillhandahålla ett alternativ till den undersökande CTA, som användes vid de kliniska studierna med Herceptin. Prestandan hos HercepTest, för bestämning av överexpression av HER2-protein, utvärderades i en oberoende undersökning, där resultaten av HercepTest jämfördes med CTA hos 548 brösttumörprover, av vilka inga erhölls från patienter i de kliniska studierna med Herceptin. Resultaten indikerade 79 % konkordans mellan resultaten från de båda analyserna av dessa vävnadsprover. Konkordansdata indikerar även att en 3+ avläsning med HercepTest högst sannolikt skulle motsvara en positiv avläsning med CTA, vilket skulle ha uppfyllt inträdeskriterierna för prövningen (2+ eller 3+). Ett fynd av 2+ på HercepTest korrelerade inte lika väl med CTA-resultaten. Cirka 42 % (53/126) av HercepTest 2+ resultaten var negativa med CTA (0 1+), vilket inte skulle ha medgivit deltagande i de kliniska prövningarna med Herceptin. HercepTest tolkas som negativt för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ färgningsintensitet), svagt positiv (2+ färgningsintensitet), och starkt positiv (3+ färgningsintensitet). HercepTest är inte avsett att tillhandahålla prognostisk information till patienten och läkaren och har inte validerats för detta ändamål. Procedurens princip - Bröst HercepTest innehåller de reagenser som krävs för att fullborda en immuncytokemisk färgningsprocedur i två steg för rutinmässigt fixerade, paraffininbäddade prover. Efter inkubering med den primära kaninantikroppen mot humant HER2-protein, använder denna sats en bruksfärdig Visualization Reagent baserad på dextranteknik. Denna reagens består av både sekundära anti-kaninimmunglobulinmolekyler från get och pepparrotsperoxidasmolekyler bundna till en gemensam dextranpolymerryggrad, vilket sålunda eliminerar behovet av sekventiell applicering av länkantikropp och peroxidaskonjugerad antikropp. Korsreaktion av visualiseringsreagenset med humana immunoglobuliner och kalvfosterserum har avlägsnats genom absorption i fast fas. Den enzymatiska konverteringen av det därefter tillsatta kromogenet resulterar i att en synlig reaktionsprodukt bildas på antigenplatsen. Provet kan därefter motfärgas och förses med täckglas. Resultaten tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollpreparat som innehåller tre formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+ tillhandahålls för att validera färgningskörningarna. Färgningsintensiteten hos dessa cellinjer har korrelerats med antalet receptorer per cell. HercepTest för Automated Link-plattformar, kod SK001, passar för automatiserad färgning med användning av Dako Automated Link-plattformar. ( ) P04083SE_01_SK / s. 4/40

5 Bröstcancer Medföljande material - Bröst Kod SK001 Det uppräknade materialet nedan är tillräckligt för 50 tester (50 objektglas inkuberade med primärantikropp mot HER2-protein och 50 objektglas inkuberade med motsvarande negativt kontrollreagens). Antalet tester är baserat på användning av 200 µl per vävnadssnitt (22 mm x 22 mm) av varje reagens, förutom Epitope Retrieval Solution. Kitet innehåller tillräckligt med material för maximalt 10 individuella färgningskörningar. Kvantitet Beskrivning 1 x 22 ml HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent 3 % väteperoxid innehållande 15 mmol/l natriumazid (NaN 3). 1 x 12 ml HercepTest Rabbit Anti-Human HER2 Protein Bruksfärdig affinitetsisolerad antikropp. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, innehållande stabiliserande protein. Immunogen: Syntetiskt C-terminalt fragment (intracytoplasmisk del) av HER2-proteinet, bundet till keyhole limpet hemocyanin. Specificitet: HER2-protein. Reningsmetod: Antikroppen affinitetsisoleras med användning av en immobiliserad HIER2-proteinpeptid. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Dextranpolymer konjugerad med pepparrotsperoxidas och affinitetsisolerade antikaninimmunoglobuliner från get. Levereras i Tris/HCl-buffert innehållande stabiliserande protein och ett antimikrobiellt medel. 1 x 10 ml HercepTest Negative Control Reagent Immunglobulinfraktion av normalt kaninserum vid en ekvivalent proteinkoncentration som antikroppen mot HER2-protein. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, innehållande stabiliserande rotein. 2 x 22 ml HercepTest DAB Substrate Buffer Substratbuffertlösning, ph 7,5, innehållande < 0,1 % väteperoxid, stabilisatorer, förstärkare och antimikrobiellt medel. 1 x 1 ml HercepTest DAB Chromogen 5 % 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid kromogenlösning. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) 0,1 mol/l citratbuffert med antimikrobiellt medel. 2 x 5 objektglas HercepTest kontrollpreparat Varje kontrollpreparat innehåller snitt av tre formalinfixerade, paraffininbäddade bröstcancercellinjer, som representerar olika nivåer av expression av HER2-protein. MDA-231 (0), MDA-175 (1+), och SK-BR-3 (3+). Kontrollpreparaten har värmebehandlats för att snitten ska fästa bättre vid objektglasen. Eventuell ytterligare värmebehandling av kontrollpreparaten, som utförs för att förbättra snittens vidhäftning till objektglasen, kan äventyra färgningsresultaten. 10 x flaskor Påfyllningsbar reagensflaska, 12 ml kapacitet Varje flaska kan innehålla 12 ml reagens. Flaskorna ska användas för blandning och förvaring av substrat-kromogenlösning (se även avsnittet Reagensberedning). Levereras i en separat påse. OBS! Alla reagenser är specifikt utformade för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras. ( ) P04083SE_01_SK / s. 5/40

6 Bröstcancer Material som behövs men inte medföljer - Bröst Dako Wash Buffer, kod S3006 Motfärg: Hematoxylin, såsom Hematoxylin for Automated Link Platforms, (kod SK308) Täckglas Destillerat eller avjoniserat vatten Torkugn, som kan bibehålla 60 C eller lägre Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (4 40x objektivförstoring) Monteringsmedel, såsom Dako Faramount (kod S3025) eller Dako Glycergel (kod C0563) Positiva och negativa vävnader att använda som processkontroller (se avsnittet om Kvalitetskontroll) Objektglas, SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagda objektglas eller Dako Silanized Slides (kod S3003) Xylen, toluen eller xylensubstitut SK001 har anpassats speciellt för användning med Dako Automated Link-plattformar. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. ( ) P04083SE_01_SK / s. 6/40

7 Bröstcancer Försiktighetsåtgärder - Bröst 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ansamlas i avloppet (21). 4. HercepTest Peroxidase-Blocking reagens, innehåller 3 % väteperoxid. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 5. HercepTest anti-humant HER2-protein från kanin, HercepTest visualiseringsreagens och HercepTest negativt kontrollreagens innehåller material av animalt ursprung. 6. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 7. Kontrollglas och prover, före och efter fixering, samt alla material som exponerats för dessa, bör hanteras som potentiellt smittbärande och kasseras med lämpliga försiktighetsåtgärder (22). Pipettera aldrig reagenser med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagenser och prover. Om reagenserna kommer i kontakt med känsliga områden, tvätta med stora mängder vatten. 8. Minimera mikrobiell kontaminering av reagenser eftersom en ökning av icke-specifik färgning annars kan inträffa. 9. Andra inkubationstider, temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. För lång torkning i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller förlust av den specifika membran-associerade HER2-immunreaktiviteten (17). 10. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i minskad antigenfärgning. 11. Alla reagenser är specifikt utformade för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras. 12. HercepTest visualiseringsreagens och HercepTest DAB-kromogen kan påverkas negativt om de utsätts för höga ljusnivåer. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, såsom direkt solljus. 13. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. 14. Oanvänd lösning måste kasseras i enlighet med lokala och statliga föreskrifter Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. Användning av andra reagensvolymer än de som rekommenderas kan leda till förlust av synlig HER2-immunreaktivitet. Vävnadssnitt större än 22 mm x 22 mm kräver 2-3 x 200 µl reagens, applicerat på 2-3 automatiserade applikationsområden. 17. HercepTest DAB kromogen innehåller 1 5 % 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid (bifenyl-3,3,4,4 -tetrayltetraammoniumtetraklorid) och märks: Fara H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 18. Rester av paraffin kan leda till falska negativa resultat. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner (enligt EU-direktivet 94/33/EC). Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (MSDS). USA: 3,3 -diaminobensidin (DAB) kan vara farligt vid inandning, hudkontakt och förtäring. Materialet irriterar ögonen och huden. Om hudkontakt skulle förekomma, ska påverkade områden sköljas med tvål och vatten. OBS! Även om diaminobensidin är strukturellt relaterad till bensidin, finns inga bevis för carcinogenicitet hos diaminobensidin. Konsultera lokala eller statliga föreskrifter för kassering. ( ) P04083SE_01_SK / s. 7/40

8 Bröstcancer Förvaring - Bröst Provförberedning - Bröst Produkten ska förvaras vid 2 8 C när den inte anvä nds på Dako Automated Link-plattformar. HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer och HercepTest DAB Chromogen ska förvaras mörkt vid 2 8 C. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som är tryckt på förpackningen. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som anges i produktbladet (14a,14b). Observera att kontrollpreparaten också måste förvaras vid 2 8 C. Det finns inga tydliga tecken som tyder på instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller analyseras samtidigt med patientproverna. Kontakta omedelbart Dakos Tekniska Support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara problem med HercepTest. Biopsiprover måste hanteras så att vävnaden bevaras för immuncytokemisk färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling bör andvändas för alla prover (15). Paraffininbäddade snitt Vävnader konserverade i neutralbuffrat formalin eller Bouins fixativ för rutinbehandling och paraffininbäddning är lämpliga för användning. Exempelvis ska biopsiprover blockas till en tjocklek på 3 eller 4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Vävnaderna dehydreras därefter i en serie med alkohol och xylen, följt av en infiltration av smält paraffin vid en temperatur på högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader som uttrycker HER2-protein kommer att vara stabila länge före snittning och montering på objektglas, om de förvaras kallt (15-25 C) (15,16). I USA kräver Cli nical Laboratory Improvement Act, 1988 i 42 CFR (b) att Laboratoriet måste behålla färgade objektglas i minst tio år från undersökningsdatum och provblock i minst två år från undersökningsdatum (16). Vävnadsprover ska skäras i snitt på 4 5 µm, monteras på objektglas och lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar (eller tills de är torra), vid 37 C över natten eller vid 60 C i en timme. VARNING! För hög värme i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller fö rlust av den specifika membranassocierade HER2-immunreaktiviteten (17). För att bevara antigeniciteten bör snitt som monterats på objektglas (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine eller silaniserade objektglas) färgas inom 4 6 veckor efter snittning, vid förvaring vid rumstemperatur (20 25 C) (18). De preparat som behövs för utvärdering av HER2-protein och för att bekräfta närvaro av tumör ska framställas samtidigt. Minst 5 objektglas rekommenderas, 1 objektglas för tumörnärvaro, 2 objektglas för utvärdering av HER2-protein (1 för inkubation med anti-humant HER2-protein från kanin och 1 för inkubation med negativt kontrollreagens) och 2 objektglas för backup. Användning av HercepTest på avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. Se Dakos Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) och litteraturhänvisningarna 15 och 16 för ytterligare information om provpreparation. Bearbetning av vävnader före färgning En specifik epitopåtervinningsmetod i 0,01 mol/l citratbuffert måste användas för optimal analysprestanda. Epitopåtervinningslösningen medföljer HercepTest -satsen. Denna metod innefattar uppvärmning av snitt som monterats på objektglas som nedsänkts i 0,01 mol/l citratbuffert (20) i ett kalibrerat vattenbad eller Dako PT Link vid den erfordrade temperaturen (95 99 C). Laboratorier vid högre höjder bör bestämma den bästa metoden för att bibehålla den erfordrade temperaturen. Andra metoder för epitopåtervinning har testats och ger inte reproducerbara resultat. Avvikelse från den beskrivna proceduren kan påverka resultaten. Provförberedning - Bröst Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: Epitope Retrieval Solution Späd en tillräcklig kvantitet av HercepTest Epitope Retrieval Solution 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten för färgningsproceduren som planeras. Oanvänd spädd lösning kan användas i en vecka vid rumstemperatur eller förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den spädda lösningen om den är grumlig. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd av Dako Wash Buffer (kod S3006) 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan användas i en vecka vid rumstemperatur eller förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattform(ar) för ytterligare information. ( ) P04083SE_01_SK / s. 8/40

9 Bröstcancer Substrat-kromogenlösning (DAB) Bered substrat-kromogenlösning i de påfyllningsbara flaskorna genom att tillsätta 25 µl DAB-kromogen per 1 ml DAB substratbuffert och blanda. Beredd Substrate Chromogen Solution (DAB) är stabil i cirka 5 dagar när den förvaras vid 2 8 C. Denna lösning ska blan das ordentligt före användning. Eventuell utfällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. Den påfyllningsbara flaskan innehållande Substrate-Chromogen Solution måste definieras i Dako Automated Link-plattformen före användning. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. OBS! Färgen på flytande DAB-kromogen kan variera från klar till ljust lavendel-brun. Detta påverkar inte prestandan hos denna produkt. Späd enligt riktlinjerna i detta produktblad. Tillsats av överflödigt DAB-kromogen till DAB-buffrat substrat resulterar i försämring av den positiva signalen. Motfärg DAB-färgningsreaktionens färgade slutprodukt är olöslig i alkohol och vatten. Hematoxylin för Automated Linkplattformar (kod SK308) kan användas som en motfärg. De nödvändiga stegen och inkubationstiderna är förprogrammerade i programvaran för Dako Link. reagensberedning behövs. Monteringsmedel Ett icke-vattenhaltigt, permanent monteringsmedel rekommenderas. Vattenhaltig montering är emellertid också acceptabelt. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kod C0563) rekommenderas för vattenbaserad montering. Gör glycergel flytande genom att värma det till cirka 40 (± 5) C före användning. Färgningsprocedur - Bröst Proceduranmärkningar Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter och instrument innan de används (se avsnittet Försiktighetsåtgärder). Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. De nödvändiga stegen och inkubationstiderna för färgning är förprogrammerade i programvaran för Dako Link. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information om programmeringsprotokoll och laddning av objektglas och reagenser. Om färgningsproceduren avbryts kan glasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av primärantikroppen i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C) uta n att färgningsresultatet påverkas. Avparaffinering och rehydrering Före färgning måste vävnadsobjektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Undvik ofullständigt avlägsnande av paraffin. Kvarlämnat inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i absolut etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i 95 % etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i destillerat eller avjoniserat vatten i minst 30 sekunder. Påbörja färgningsproceduren enligt beskrivningen i färgningsprotokollavsnittet under Epitopåtervinning. Xylen- och alkohollösningar ska bytas efter 40 objektglas. Toluen eller xylenersättningar, t.ex. Histoclear, kan användas. OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer denna sats har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra analysresultaten ogiltiga för användning vid urval av patienter för Herceptin -terapi. Färgningsprotokoll Alla de nödvändiga stegen och inkubationstiderna för färgning är förprogrammerade i programvaran för Dako Link-plattformar. Efter avparaffinering, rehydrering och epitopåtervinning kommer instrumentet att behandla objektglasen enligt nedanstående beskrivning. ( ) P04083SE_01_SK / s. 9/40

10 Bröstcancer Steg 1: Epitopåtervinning Fyll Dako PT-modulkaren eller färgningskärl, t.ex. Coplin-burkar, med Epitope Retrieval Solution (se Reagensberedning). För Dako PT Link: Förvärm den spädda Epitope Retrieval Solution i Dako PT Link-karet till 85 C. Efter uppvärmning blir epitopåtervinnningslösningen grumlig. Placera de de rumstempererade, avparaffinerade snitten i Autostainer-ställ och sänk ned objektglasen i förvärmd Epitope Retrieval Solution. Låt Dako PT Link värmas upp till 97 ±C och inkubera i 40 (±1) minuter vid 97 C. Låt snitten svalna i Dako PT Link tills temperaturen når 85 C. Avlägsna PT Link-karen med snitten från Dako PT Link. Låt karen vara kvar på bordet i 10 minuter med locket av för ytterligare avsvalning. Skölj snitten med tvättbuffert. Ytterligare information finns i användarhandboken till Dako PT Link. För Coplin-kärl: Placera färgningskärl med spädd Epitope Retrieval Solution i vattenbad. Värm vattenbad och Epitope Retrieval Solution till C. Efter upp värmning blir epitopåtervinnningslösningen grumlig. Täck kärlen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda Epitope Retrieval Solution i färgningskärlen. Återställ temperaturen på vattenbadet och Epitope Retrieval Solution till C. Inkubera i 40 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med ob jektglas från vattenbadet. Låt objektglasen svalna i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minuter vid rumstemperatur. Hall ut Epitope Retrieval Solution och skölj snitten i tvättbufferten. För optimal prestanda ska snitten ligga i Wash Buffer i 5 20 minuter efter epitoputvinning och före färgning. OBS! Epitope Retieval Solution är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Färgningsprocedur Efter epitopåtervinning placeras objektglasen som placerats i instrumentställningar på Dako Automated Linkplattformarna. Instrumentet kommer att utföra färgningsprocessen genom att applicera lämpligt reagens, övervaka inkubationstiden och skölja objektglasen mellan reagenserna. Inkubationstiderna för reagensen är förprogrammerade i programvaran för Dako Link. Steg 3: Motfärg Objektglasen kan motfärgas med Hematoxylin för Automated Link-plattformar (kod SK308). Det finns två färgningsprotokoll i programvaran för Dako. Ett innefattar en hematoxylin motfärg och det andra innefattar inte detta. Inkubationstiden för hematoxylin är förprogrammerad i protokollet som inkluderar en motfärg. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information om programmering av protokoll. Steg 4: Montering Icke vattenhaltigt, pemanent monteringsmedium rekommenderas. Vattenhaltigt monteringsmedel är emellertid också acceptabelt. Prover kan monteras och förses med täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedel, såsom Dako Faramount (kod S3025) eller Dako Glycergel (kod C0563). OBS! Objektglasen kan avläsas när så är lämpligt. Viss blekning förekommer emellertid om objektglasen täcks med ett vattenhaltigt monteringsmedium och utsätts för starkt ljus under en period på en vecka. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekningen. Kvalitetskontroll - Bröst Avvikelser i vävnadsfixering, behandling och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt med regelbundna egna kontroller utöver användningen av kontrollpreparaten från Dako. För användare i USA, se riktlinjerna för kvalitetskontroll från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry samt även CLSI (f.d. NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23) och referens 24 för ytterligare information. Tabell 1: Syftet med daglig kvalitetskontroll. Vävnad: Fixerade och behandlade som patientprover Positiv kontroll: Vävnader eller celler som innehåller målantigen som ska detekteras (kan finnas i patientvävnad). Den ideala kontrollen är svagt positivt färgande vävnad eftersom denna är mest känslig för antikropps- eller antigendegradering. Specifika antikroppsoch detekteringssystem Kontrollerar alla stegen i analysen. Validerar reagenser och procedurer som används för HER2-proteinfärgning Icke-specifik antikropp* eller buffert plus samma detektionssystem som används med specifik antikropp Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning ( ) P04083SE_01_SK / s. 10/40

11 Bröstcancer Negativ kontroll: Vävnader eller celler som förväntas vara negativa (kunde lokaliseras i patientvävnad eller positiv kontrollvävnad) Detektion av oavsiktlig korsreaktivitet mellan antikropp och celler/cellulära komponenter Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Patientvävnad Detektion av specifik färgning Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Kontrollpreparat tillhandahålls av Dako Färgningsprocedur endast för kontroller * Serum från samma art som den specifika antikroppen, men inte riktade mot samma målantigen. För att detektera icke-specifik antikroppsbindning, t.ex. bindning av Fc-delen av antikroppen genom vävnaden. Kontrollglas (medföljer) Vart och ett av de medföljande kontrollpreparaten innehåller tre pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+. Ett objektglas bör färgas i varje färgningskörning. Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. Positiv kontrollvävnad Kontroller bör vara färska autopsi-/biopsi-/kirurgiska prover, som fixerats, behandlats och inbäddats så snart som möjligt på samma sätt som patientprovet (proverna). Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt preparerad vävnad och korrekt färgningsteknik. En positiv kontrollvävnad för varje sats testförhållanden bör inkluderas i varje färgningskörning. De positiva kontrollvävnaderna ska ge svag positiv färgning så att de kan detektera små förändringar i den primära antikroppens sensitivitet. Kontrollpreparaten som levereras med detta system eller prover som behandlats annorlunda än patientprover validerar endast reagensprestanda och verifierar inte vävnadspreparationen. Använd tidigare fastställt HER2-protein 2+, som överuttrycker invasiv (infiltrerande) human bröstcarcinomvävnad, som ideal positiv kontrollvävnad. OBS! Kända positiva kontrollvävnader bör endast användas för att övervaka korrekt prestanda av behandlade vävnader och testreagenser, INTE som ett hjälpmedel för att formulera en specifik diagnos av patientprover. Om positiva kontrollvävnader inte uppvisar riktig positiv färgning bör resultaten med testproverna anses som ogiltiga. Negativ kontrollvävnad Använd en negativ kontrollvävnad (som är känt HER2 -proteinnegativ), fixerad, behandlad och inbäddad på ett sätt som är identiskt med patientproverna, med varje färgningskörning för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppen och för att ge en indikation på specifik bakgrundsfärgning. Kolon, lever och sköldkörtel är lämpliga för negativ kontrollvävnad. Mångfalden av olika celltyper, som förekommer i de flesta vävnadssnitt, ger interna negativa kontrollsiter (detta måste verifieras av användaren). Normala bröstgångar kan användas som interna negativa kontroller. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden eller i den interna negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga och testet göras om. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information om programmering av kontrollpreparat. Icke-specifikt negativt kontrollreagens Använd det medföljande negativa kontrollreagenset istället för den primära antikroppen med ett snitt av varje patientprov för att utvärdera icke-specifik färgning och åstadkomma en bättre tolkning av specifik färgning på antigenplatsen. Inkuberingsperioden för negativt kontrollreagens bör motsvara inkuberingsperioden för den primära antikroppen. Analysverifiering Före den första användningen av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur ska användaren verifiera analysens resultat genom att testa den på en serie egna vävnader med kända IHC-prestandaegenskaper som representerar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurer som tidigare beskrivits i det här avsnittet av bipacksedeln och till kvalitetskontrollkrav i CAP Certification Program for Immunohistochemistry och/eller CLSI (före detta NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23). Dessa kvalitetskontrollprocedurer bör upprepas för varje ny sats med antikroppar eller när analysparametrarna ändras. Bröstcarcinom med kända HER2-proteinfärgningsintensiteter från 0 3+ och negativa vävnader, t.ex. kolon, lever eller sköldkörtel, är lämpliga för verifikation av analysen. ( ) P04083SE_01_SK / s. 11/40

12 Bröstcancer Färgningstolkning - Bröst För bestämning av överexpression av HER2-protein bör endast färgningsintensiteten och mönstret för membranet utvärderas med användning av den skala som anges i Tabell 2. Utvärdering av objektglas ska utföras av en patolog med användning av ett ljusmikroskop. För utvärdering av immuncytokemisk färgning och poängsättning är ett objektiv med 10x förstoring lämpligt. Användning av ett objektiv med 20 40x förstoring är användbart vid bekräftelse av poängen. Cytoplasmisk färgning bör anses som icke-specifik färgning och ingår inte i bedömningen av membran-färgningsintensitet (8). För hjälp med differentieringen av 0, 1+, 2+ och 3+ färgning, se Dakos HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer för representativa bilder av färgningsintensiteter. Endast prover från patienter med invasivt bröstcarcinom bör poängsättas. I fall med carcinoma in situ och invasivt carcinom i samma prov ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Tabell 2: Färgningsintensitetskriterier för cellmembran. Poäng (rapport till behandlande läkare) Bedömning av överexpression av HER2- protein (rapport till behandlande läkare) Färgningsmönster Frånvaro av färgning eller membranfärgning observeras i mindre än 0 Negativt 10 % av tumörcellerna. En svagt/knappt märkbar membranfärgning detekteras i mindre än 10 % av tumörcellerna. Cellerna färgas endast i 1+ Negativt delar av deras respektive membran En svag till måttlig fullständig membranfärgning observeras i mer än 2+ Svagt positiv 10 % av tumörcellerna. En stark, fullständig membranfärgning observeras i mer än 10 % av tumörcellerna 3+ Starkt positiv HercepTest tolkas som negativt för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ färgningsintensitet), svagt positiv (2+ färgningsintensitet), och starkt positiv (3+ färgningsintensitet). HercepTest är inte avsett att tillhandahålla prognostisk information till patienten och läkaren och har inte validerats för detta ändamål. Objektglasen bör undersökas för varje färgningskörning i den ordning som anges i Tabell 3, för att fastställa färgningskörningens validitet och möjliggöra semikvantitativ bedömning av färgningsintensiteten hos provvävnaden. Tabell 3: Preparatutvärderingens ordning. Preparatavläsningsordning 1. Kontrollpreparat innehållande de tre cellinjerna Logisk grund Närvaro av 3+ brun cellmembranfärgning (kantning) i 3+ kontrollcellinjen SK-BR-3, delvis brun kantning i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, och ingen färgning i 0 kontrollcellinjen MDA-231, indikerar en giltig analys. Punktad och diskontinuerlig membranfärgning är närvarande i ett litet till måttligt antal av cellerna i den svagt positiva 1+ kontrollcellinjen MDA-175. Även punktliknande immunfärgning av Golgi-regionen i cytoplasman kan observeras i denna cellinje. Närvaro av brun färgning i 0-kontrollcellinjen MDA-231 (negativ för HER2-proteinfärgning) indikerar att icke-specifik färgning förekom under analysen. Analysresultaten kan vara ogiltiga på grund av överfärgning. 2. Positiv kontrollvävnad Närvaro av brun membranfärgning bör observeras. Färgning av cytoplasman och negativa vävnader bör inte vara mer än Negativ kontrollvävnad FRÅNVARO av specifik färgning av den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik membranfärgning inträffar i de negativa kontrollvävnaderna ska resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. 4. Patient-vävnad som färgats med negativt kontrollreagens 5. Patient-vävnad som färgats med användning av den primära antikroppen Frånvaro av specifik membranfärgning bekräftar den specifika märkningen av målantigenen genom den primära antikroppen. Annan medelbrun eller brun färgning, som förekommer i cytoplasman hos provet som behandlas med den negativa kontrollreagensen, såsom i bindvävnad, leukocyter, erytrocyter eller nektrotisk vävnad, bör betraktas som icke-specifik bakgrundsfärgning och bör inte rapporteras i avsnittet Kommentarer i databladet. När överexpression av HER2-protein detekteras i provet kommer detta att uppträda som brun kantning lokaliserat på cellmembranet hos tumörcellerna som behandlats med den primära antikroppen. ( ) P04083SE_01_SK / s. 12/40

13 Bröstcancer 1. Kontrollpreparat (medföljer): Kontrollpreparatet, som färgats med HercepTest, bör undersökas först för att säkerställa att alla reagenser fungerar korrekt. Närvaron av en brun (3,3 -diaminobensidin, DAB) reaktionsprodukt på cellmembranet indikerar en positiv reaktivitet. Närvaro av periferisk, brun cellmembranfärgning (kantning) i 3+ kontrollcellinjen SK-BR-3, partiell brun kantning i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, och ingen färgning i 0 kontrollcellinjen MDA-231, indikerar en giltig analys. Om någon av kontrollcellinjerna är utanför dessa kriterier ska alla resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. 2. Positiv kontrollvävnad: Den positiva kontrollvävnaden bör undersökas därefter. Detta preparat verifierar att fixeringsmetoden och epitopåtervinningsprocessen är effektiva. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultaten eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt (25). Färgning bör observeras i tumörvävnad som brun cellmembranfärgning. Brun färgning av cytoplasman och negativa vävnader i provet bör inte motsvara mer än 1+ färgningsintensitetspoäng. 3. Negativ kontrollvävnad: Den negativa kontrollvävnaden bör undersökas efter den positiva kontrollvävnaden för att verifiera specificiteten av märkningen av målantigenen genom den primära antikroppen. Frånvaron av specifik färgning i den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativa kontrollvävnad, men detta måste verifieras av användaren. Notera att en svag reaktion (0 1+ färgningsintensitet) kan observeras i de flesta normala epitelialvävnader. Möjliga negativa kontrollvävnader innefattar: kolon, lever och sköldkörtel. Icke-specifik färgning, om sådan är närvarande, kommer att ha ett diffust utseende. Sporadisk färgning av bindvävnad kan också observeras i snitt från överdrivet formalinfixerade vävnader Patientvävnad: Undersök patientproverna som färgats med HercepTest sist. Positiv färgningsintensitet bör fastställas inom ramen för all icke-specifik bakgrundsfärgning med det negativa kontrollreagenset. Liksom med alla immuncytokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte detekterades, inte att antigenen var frånvarande i de analyserade cellerna/vävnaden. Se Sammanfattning och förklaring, Begränsningar, och Prestandaegenskaper för specifik information angående HercepTest immunreaktivitet. Ytterligare rekommendationer för tolkning av HercepTest -färgning De flesta metastatiska bröstcarcinom, som testats för överexpression av HER2-protein, ges en poäng på 0 eller 3+. Även om majoriteten av dessa fall är entydiga kan en liten del av de återstående 1+ och 2+ proven vara svårare att tolka. Använd följande riktlinjer för tolkning av HercepTest -färgning i ert laboratorium. 1. Utvärdera kontrollcellinjerna för att validera analysprestandan. 2. Utvärdera de positiva och negativa kontrollpreparaten. 3. En hematoxylin- och eosin- (H&E) färgning av vävnadsproven rekommenderas för den första utvärderingen. (Tumören kanske inte är uppenbar när man betraktar provet som färgats med HercepTest. Ett H&E färgat preparat krävs från patologen för att bekräfta närvaron av tumören.) HercepTestet bör utföras på ett parat snitt (seriesnitt) från samma paraffinblock av provet. 4. Utvärdera snitten som färgats för överexpression av HER2-protein först med låg förstoringeffekt. Majoriteten av positiva fall kommer att vara uppenbara vid låg förstoring med låg effekt. 5. Väl konserverade och välfärgade områden hos provet bör inte användas för att fastställa procentvärdet positiva tumörceller. 6. I allmänhet bör de flesta fall vara uppenbara vid låg förstoring. Om bestämning mellan 1+/2+ gränslinjefall är svårt vid låg förstoring är poängen vanligen Använd 20 40x objektivförstoring för att bekräfta membranfärgning. 8. Om de flesta tumörceller uppvisar fullständig membranfärgning är färgningen antingen 2+ eller 3+. Flytta upp till 20 40x objektivförstoring för att bekräfta poängen. 9. I de flesta 3+-fallen färgas minst 80 % av tumörcellerna och membranfärgningen är intensiv. 10. Om provet är nära gränsvärdet på 10 % positiva tumörceller, rekommenderas att minst 100 tumörceller räknas för att fastställa delen färgade celler. 11. Om en fullständig membranfärgning vid svag till måttlig intensitet förekommer i mer än 10 % av tumörcellerna är poängen för provet 2+. Detta åtföljs vanligen av ofullständig membranfärgning av de flesta återstående tumörcellerna. 12. Om mindre än 10 % av tumörcellerna har fullständig periferisk membranfärgning, trots att andra tumörceller kan uppvisa en ofullständig membranfärgning, är poängen Om mindre än 10 % av tumörcellerna har fullständig eller ofullständig periferisk membranfärgning, är poängen 0. ( ) P04083SE_01_SK / s. 13/40

14 Bröstcancer Begränsningar - Bröst Produktspecifika begränsningar - Bröst Prestandaegenskaper - Bröst 1. Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialutbildning vid val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, beredning av IHC-preparaten och tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, värmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan ge artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. 4. Den kliniska tolkningen av positiv färgning, eller frånvaron av densamma, måste utvärderas inom ramen för den kliniska anamnesen, morfologin och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av all färgning eller frånvaro av färgning, måste kompletteras med morfologiska undersökningar och korrekta kontroller, såväl som andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog, som är förtrogen med antikropparna, reagenserna och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under övervakning av en patolog, som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och tillförsäkrar att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (26). 6. Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnadstyper. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenexpression i neoplasmer eller andra patologiska vävnader (27). Rapportera dokumenterade oväntade reaktioner till Dakos Tekniska Support. 7. Falskt positiva resultat kan observeras på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. Detta kan även orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C) (27). 8. Färgningsproceduren kommer att utföras vid den förprogrammerade temperaturen (20 25 C). 1. Antigenen, som är närvarande i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, utsätts för degradering över tiden. Fastställ kontrollpreparatresultaten i samband med kontrollpreparatets utgångsdatum. Negativ färgning av MDA-175 cellerna kanske endast indikerar att kontrollpreparatet har degraderats. Kontrollpreparaten måste förvaras vid 2 8 C. 2. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover ska färgas inom 4 6 veckor efter montering av vävnaderna på objektglas, om de förvaras i rumstemperatur (20 25 C) (27). 3. Ersätt inte kitreagenser med reagenser med andra satsnummer eller med reagenser från andra tillverkare. 4. Falska resultat kan erhållas från utvärdering av cytoplasmisk färgning. Beakta endast intensiteten av cellmembranfärgningen vid tolkning av resultat. 5. Färgade kontrollpreparat bör endast användas för validering av färgningskörningen och bör inte användas som en riktlinje för att poängsätta färgningsreaktionen i vävnadssnitt. 6. Starkt fokal färgning (3+), dvs. hot spots, kan ibland observeras. Detta kan vara resultatet av ojämn fixering och/eller behandling av vävnad. Immunfärgning av ett andra vävnadsblock från samma prov rekommenderas. 7. Användning av HercepTest på prover som fixerats i andra fixativ än neutralbuffrat formalin eller Bouins fixativ, har inte validerats. 8. Normalt epitel i bröstvävnad bör färga mellan 0 och 1+. Om högre färgning av normalt epitel än 1+ observeras bör testet göras om. Observera att normalt tonsill- och esofagusepitel kan färga upp till 2+ intensitet. Bakgrund: Den kliniska prövningen (CTA), som användes för att identifiera patienter för kliniska prövningar med Herceptin, gjordes i undersökande syfte och är inte längre tillgänglig. HercepTest utvecklades för att tillhandahålla ett jämförbart alternativ till CTA. Säkerheten och effektiviteten med Herceptin utvärderades i en randomiserad kontrollerad klinisk prövning och en stor, open-labelled prövning (se produktbladet för Herceptin ). Alla patienter, som utvaldes för kliniska prövningar med Herceptin, uppvisade överexpression av HER2-protein genom immuncytokemisk testning, som utfördes med CTA vid ett centralt laboratorium. Patienter var kvalificerade för Herceptin -behandling om deras tumör hade 2+ eller 3+ nivåer av överexpression av HER2-protein (baserat på en 0 3+ skala, där 3+ utgjorde den högsta nivån). Undergruppsanalys av resultaten från dessa undersökningar antyder att patienter vars vävnader är starkt positiva (3+) för överexpression av HER2-protein, kan ha större behållning av Herceptin än patienter vars vävnader är svagt positiva (2+). Graden av överexpression av HER2-protein är potentiellt en viktig prediktor av effekten av Herceptin -behandling. Eftersom ingen av patienterna i Herceptin -undersökningarna utvaldes med användning av HercepTest, är korrelationen mellan graden av positivitet och sannolikheten av klinisk fördel av Herceptin-behandling okänd. ( ) P04083SE_01_SK / s. 14/40

15 Bröstcancer Jämförande undersökningar Två undersökningar utfördes för att karakterisera HercepTest. 1) Jämförelse med den kliniska prövningen (CTA). 2) Precision vid jämförelse med fem ytterligare analyser. Jämförelse med den kliniska prövningen (CTA) HercepTest jämfördes med den CTA som användes för att identifiera kvalificerade patienter för Herceptin terapi, med användning av 274 HER2-proteinpositiva (2+ eller 3+) och samma antal HER2-proteinnegativa vävnadsprover med bröstcancer. Tabell 4 visar resultaten i ett 2 x 2 diagram, där 0 och 1+ betraktades som negativa och 2+ och 3+ var positiva. Tabell 4: En 2 x 2 konkordans mellan HercepTest och klinisk prövning (antal prover). Klinisk prövning Positivt Negativt Totalt HercepTest Positivt Negativt Totalt Konkordans: 79 % (76 82%) 95 % konfidensintervall. Den totala binära konkordansen mellan HercepTest och CTA var 79 % (431/548), med ett tvåsidigt 95 % konfidensintervall på %. Tjugoen procent (21 %) av resultaten var oeniga mellan dessa båda metoder. HercepTest -resultaten rapporteras på en skala 0-3+, som tolkas som negativ för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ färgningsintensitet), svagt positiv (2+ färgningsintensitet), och starkt positiv (3+ färgningsintensitet). Tabell 5: En 3 x 3 konkordans mellan HercepTest och klinisk prövning. Klinisk prövning Totalt HercepTest Totalt Denna 3 x 3 framställning av konkordansundersökningen indikerar att en 3+ avläsning med HercepTest högst sannolikt skulle motsvara ett positivt resultat med CTA, vilket skulle ha uppfyllt inträdeskriterierna för prövningen med Herceptin (2+ eller 3+). Ett fynd av 2+ på HercepTest korrelerade inte lika väl med CTAresultaten. Cirka 42 % (53/126) av HercepTest 2+ resultat var negativa med CTA (0-1+), vilket inte skulle ha medgivit deltagande i de kliniska prövningarna med Herceptin. ( ) P04083SE_01_SK / s. 15/40

16 Bröstcancer Precision HercepTest testades även på två mikroskopglas innehållande paraffininbäddade vävnadssnitt från 168 brösttumörer. Dessa tumörer hade tidigare karakteriserats med fem olika metoder för bestämning av HER2- genamplifiering och överexpression av HER2-protein, inklusive egen Southern blot, fluorescens in situhybridisering (FISH) för amplifiering av DNA, Northern blot RNA-analys, Western blot och immuncytokemi (ICC) på frysta vävnader (28). Resultaten visas i Tabell 6. Tabell 6: Jämförelse mellan HercepTest och kombinerade resultat (OE) från genamplifieringstester och tester av överexpression av HER2-protein. Referens OE-klassificering + - Totalt HercepTest Positiv överensstämmelse: 43/69 = 62 % Negativ överensstämmelse: 99/99 = 100% Totalt Resultaten indikerade en 85 % (142/168) nivå av överensstämmelse (95 % konfidensintervall på %) mellan positiviteten (2+ och 3+) och negativiteten (0 och 1+) färgningsintensitet med HercepTest. Inga av proverna som var negativa med de fem olika metoderna var positiva med HercepTest, medan de kombinerade resultaten för de fem olika metoderna visade ett större antal positiva fall. Reproducerbarhet Reproducerbarhet inom körningar Reproducerbarhet inom körningar testades i ett laboratorium med fem prover av olika ICC färgningsintensitetspoäng. Varje prov kördes i triplikat i ett maskerat, randomiserat format. Detta protokoll användes med automatisk färgning. Alla prover gav 100 % reproducerbara resultat. Reproducerbarhet mellan körningar Reproducerbarheten mellan körningar testades vid tre laboratorier under fyra dagar med fem prover med olika färgningsintensitetspoäng, som randomiserats och maskerats med användning av automatisk metodologi. Utmärkt reproducerbarhet noterades för positiva kontra negativa resultat (0 och 1+ kontra 2+ och 3+) förutom två prover i ett laboratorium, som varierade mellan 1+ och 2+. Reproducerbarheten var 100 % för 2+ och 3+ proverna. Reproducerbarhet mellan laboratorier Reproducerbarheten mellan laboratorier testades vid tre geografiskt åtskilda laboratorier med 40 identiskt randomiserade och maskerade prover med olika ICC-färgningsintensitetspoäng. Färsksnittade preparat skickades till alla testlaboratorier för automatiserad färgning och bedömning av en patolog. Den procentuella överensstämmelsen mellan laboratorierna var från 83 % till 90 % vid en tvådelad positiv/negativ bestämning där 0 och 1+ var negativa och 2+ och 3+ var positiva för överexpression av HER2-protein. Jämfört med de resultat som erhölls vid referenslaboratoriet som utfört CTA, var 12,5 % (15/120) av jämförande resultat motsägande mellan negativa (0 eller 1+) och positiva (2+ eller 3+) bestämningar. Ytterligare 10 % (12/120) var motsägande mellan 2+ och 3+ poäng. ( ) P04083SE_01_SK / s. 16/40

17 Bröstcancer Immunreaktivitet Tabell 7 innehåller en sammanfattning av HercepTest immunreaktivitet med den rekommenderade panelen av normala vävnader: Alla vävnader formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med HercepTest enligt instruktionerna i produktbladet. Tabell 7. Sammanfattning av HercepTest normal vävnadsreaktivitet. Vävnadstyp (nr Testad) Binjure (3) Benmärg (3) Hjärna/cerebellum (3) Hjärna/cerebrum (3) Bröst (3) Cervix uteri (3) Kolon (3) Esofagus (3) Hjärta (3) Njure (3) Lever (3) Lunga (3) Mesotelceller (3) Äggstock (3) Bukspottkörtel (3) Bisköldkörtel (3) Perifer nerv (3) Hypofys (3) Prostata (3) Spottkörtel (3) Skelettmuskel (3) Hud (3) Tunntarm (3) Mjälte (3) Mage (3) Testis (3) Tymus (3) Sköldkörtel (3) Tonsill (3) Livmoder (3) Positiv färgning av vävnadselement och färgningsmönster Bröstkörtel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet) Tubuli i njurmedulla (3 av vävnader, 1 2+ i 5 50 % av celler, cytoplasmisk Prostatakörtel/gångar (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 50 % av celler, cytoplasmisk) Svettkörtlar (1 av 3 vävnader, 1+, 30 % av celler, cytoplasmisk) Cylinderepitel, yta (1 av 3 vävnader, 2+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Epitel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Skivepitel (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 80 % av celler) Den rapporterade färgningen i alla vävnader var membran, om inte annat anges. Alla tre prover av varje vävnadstyp hade samma färgningsintensitet, om inte annat anges. ( ) P04083SE_01_SK / s. 17/40

18 Bröstcancer Felsökning - Bröst Se avsnittet om Felsökning i Dakos ovannämnda handbok (19) för korrigeringsåtgärder, eller kontakta Dakos Tekniska Support för att rapportera ovanlig färgning. Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder 1. färgning av objektglasen. 1a. Programmeringsfel. Reagenserna har inte använts i korrekt ordning. 1a. Kontrollera objektglasens logg för att verifiera att korrekt program valts. 1b. Natriumazid i tvättlösning. 1b. Använd endast Dako Wash Buffer, 2. Svag färgning av objektglas. 3. Alltför kraftig bakgrundsfärgning av objektglas. 4. Fel slags objektglas används. 5. Alltför stark specifik färgning 1c. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan leda till förlust av synlig HER2- immunreaktivitet. kod S c. Vävnads-snitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torka vid 37 C över natten eller vid 60 C i maximalt en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2a. Otillräcklig epitopåtervinning. 2a. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att epitopåtervinning utförts på rätt sätt. 2b. Otillräckliga reagensinkubationstider 2c. Olämplig fixeringsmetod har använts. 2d. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan orsaka en signifikant minskning av synlig HER2-immunreaktivitet. 2e. Otillräcklig reagensvolym applicerad. 3a. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt. 3b. Stärkelsetillsatser använda vid montering av objektglasen. 3c. Objektglasen har inte sköljts ordentligt. 3d. Snitten torkade under färgningsproceduren. 3e. Olämplig fixeringsmetod har använts. 2b. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att inkubationstiderna är korrekta. 2c. Kontrollera att patientvävnaden inte överfixerats och att ett godkänt fixativ använts. 2d. Vävnads-snitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torka vid 37 C över natten eller vid 60 C i maximalt en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2e. Kontrollera vävnadssnittets storlek (22 mm x 22 mm) och applicerad reagensvolym. 3a. Använd färska avparaffineringslösningar. 3b. Använd inte stärkelsetillsatser för att fästa snitten vid objektglasen. Många tillsatser är immunreaktiva. 3c. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att objektglasen sköljts ordentligt. 3d. Verifiera att lämplig reagensvolym appliceras på objektglasen. 3e. Se till att ett godkänt fixativ använts. Alternativa fixativ kan orsaka överdriven bakgrundsfärgning. 3f. Kontrollera provets fixeringsmetod och att ingen nekros förekommer. 3f. Icke-specifik bindning av reagenser till vävnad. 4a. Föreslagen åtgärd 4a. Använd silaniserade objektglas såsom Dakos Silanized Slides (kod S3003), SuperFrost Plus eller poly- L-lysinbelagda objektglas. 5a. Olämplig fixeringsmetod har använts. 5b. Reagensinkuberingstiderna alltför långa. 5c. Olämplig tvättlösning har använts. 5a. Se till att bara godkända fixativ och fixeringsmetoder används. 5b. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att inkubationstiderna är korrekta. 5c. Använd endast Dako Wash Buffer, kod S3006. ( ) P04083SE_01_SK / s. 18/40

19 Bröstcancer 6. Svag färgning av cellinjen på kontrollpreparat Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid uppvärmning 8. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid förvaring (före uppvärmning) 6a. Felaktigt epitopåtervinningsprotokoll har följts. 6b. reaktion med substratkromogenlösning (DAB). 6a. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att epitopåtervinning utförts på rätt sätt. 6b. Kontrollera körningsloggen för att bekräfta att kromogenet prepareradts på rätt sätt. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att inkubationstiden för kromogenet är korrekt. 6c. Försämring av kontrollpreparat. 6c. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden på förpackningens utsida. 7. Lösningen blir grumlig när den värms upp 8. Lösningen har förvarats på felaktigt sätt eller också har lösningens utgångsdatum passerats 7. Detta är normalt och påverkar inte färgningen 8. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden på förpackningens utsida. Kassera epitopåtervinningslösningen OBS! Om problemet inte härrör från någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna åtgärden inte löser problemet, kontakta Dakos Tekniska Support för ytterligare hjälp. Ytterligare information om färgningstekniker och provframställning finns i Dakos ovannämnda handbok (19) (tillgänglig från Dako), Atlas of Immunohistology (29) och Immunoperoxidase Techniques. A practical approach to Tumor Diagnosis (30). ( ) P04083SE_01_SK / s. 19/40

20 Magcancer Sammanfattning och förklaring - Mage Bakgrund: Den humana HER2-genen, (även kallad ERBB2 ellerneu) kodar ett protein som ofta kallas HER2-protein eller p185 HER2. HER2-proteinet är ett membranreceptortyrosinkinas med homologi med den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR eller HER1) (1 8). HER2-proteinet är en normal komponent, som uttrycks av flera olika epitelialcelltyper (8). Överexpression av HER2-proteinet och amplifiering av HER2-genen i magcancer har påvisats i ett flertal olika studier (31). HER2-positivitet kan detekteras hops cirka 20 % av patienterna genom antingen IHC eller FISH (31). Förkliniska in vitro- och in vivo-studier har påvisat att trastuzumab (Herceptin ) är effektiv i olika magcancermodeller vilket således leder till att flera kliniska studier startas (31-35). I en fas III-studie BO18255, ToGA-prövningen, randomiserades HER2-positiva patienter med lokalt framskriden cancer som inte går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen för att få 5-FU eller capecitabine och cisplatin, antingen enbart eller i kombination med trastuzumab. En statistiskt signifikant ökning iav total överlevnad (OS) observerades hos patienter som fick en kombinerad behandling bestående av trastuzumab och kemoterapi (36, 37). Herceptin (trastuzumab) är en humaniserad monoklonal antikropp (10), som binder med hög affinitet till HER2-proteinet och har visat sig hämma proliferationen av humana tumörceller som överuttrycker HER2-protein in vitro och in vivo (32 35). Egenskaper 3803 patienter har screenats för HER2-status för medverkan i ToGA-studien. I denna studie uppmättes både överexpression av HER2-protein genom IHC (HercepTest, Dako) och HER2-genförstärkning genom FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). Giltiga testresultat erhölls i 3665 prover med antingen IHC- eller FISH-tester och i 3280 prover med båda testerna. Resultaten från ToGA-studien visade att 22,1 % av patienterna med långt framskriden magcancer var HER2- positiva enligt IHC eller FISH enligt definitionen av ToGA HER2 urvalskriterier (37). Se bipacksedeln för Herceptin för ytterligare information om användning av HercepTest vid bedömningen av patienter för vilka trastuzumab-behandling övervägs. Procedurprincip - Mage HercepTest innehåller de reagenser som krävs för att fullborda en immuncytokemisk färgningsprocedur i två steg för rutinmässigt fixerade, paraffininbäddade prover. Efter inkubering med den primära kanin-antikroppen mot humant HER2-protein, använder denna sats en bruksfärdig Visualization Reagent baserad på dextranteknik. Denna reagens består av både sekundära anti-kaninimmunglobulinmolekyler från get och pepparrotsperoxidasmolekyler bundna till en gemensam dextranpolymerryggrad, vilket sålunda eliminerar behovet av sekventiell applicering av länkantikropp och peroxidaskonjugerad antikropp. Korsreaktion av visualiseringsreagenset med humana immunoglobuliner och kalvfosterserum har avlägsnats genom absorption i fast fas. Den enzymatiska konverteringen av det därefter tillsatta kromogenet resulterar i att en synlig reaktionsprodukt bildas på antigenplatsen. Provet kan därefter motfärgas och förses med täckglas. Resultaten tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollpreparat som innehåller tre formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+ tillhandahålls för att validera färgningskörningarna. Färgningsintensiteten hos dessa cellinjer har korrelerats med antalet receptorer per cell. HercepTest för Automated Link-plattformar, kod SK001, passar för automatiserad färgning med användning av Dako Automated Link-plattformar. ( ) P04083SE_01_SK / s. 20/40

21 Magcancer Medföljande material - Mage Kod SK001 Det uppräknade materialet nedan är tillräckligt för 50 tester (50 objektglas inkuberade med primärantikropp mot HER2-protein och 50 objektglas inkuberade med motsvarande negativt kontrollreagens). Antalet tester är baserat på användning av 200 µl per vävnadssnitt (22 mm x 22 mm) av varje reagens, förutom Epitope Retrieval Solution. Kitet innehåller tillräckligt med material för maximalt 10 individuella färgningskörningar. Kvantitet Beskrivning 1 x 22 ml HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent 3 % väteperoxid innehållande 15 mmol/l natriumazid (NaN3). 1 x 12 ml HercepTest Rabbit Anti-Human HER2 Protein Bruksfärdig affinitetsisolerad antikropp. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN3, ph 7,2, innehållande stabiliserande protein. Immunogen: Syntetiskt C-terminalt fragment (intracytoplasmisk del) av HER2-proteinet, bundet till keyhole limpet hemocyanin. Specificitet: HER2-protein. Reningsmetod: Antikroppen affinitetsisoleras med användning av en immobiliserad HIER2- proteinpeptid. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Dextranpolymer konjugerad med pepparrotsperoxidas och affinitetsisolerade antikaninimmunoglobuliner från get. Levereras i Tris/HCl-buffert innehållande stabiliserande protein och ett antimikrobiellt medel. 1 x 10 ml HercepTest Negative Control Reagent Immunglobulinfraktion av normalt kaninserum vid en ekvivalent proteinkoncentration som antikroppen mot HER2-protein. Levereras i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, innehållande stabiliserande rotein. 2 x 22 ml HercepTest DAB Substrate Buffer Substratbuffertlösning, ph 7,5, innehållande < 0,1 % väteperoxid, stabilisatorer, förstärkare och antimikrobiellt medel. 1 x 1 ml HercepTest DAB Chromogen 5 % 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid kromogenlösning. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) 0,1 mol/l citratbuffert med antimikrobiellt medel. 2 x 5 objektglas HercepTest kontrollpreparat Varje kontrollpreparat innehåller snitt av tre formalinfixerade, paraffininbäddade bröstcancercellinjer, som representerar olika nivåer av expression av HER2-protein. MDA-231 (0), MDA-175 (1+), och SK-BR-3 (3+). Kontrollpreparaten har värmebehandlats för att snitten ska fästa bättre vid objektglasen. Eventuell ytterligare värmebehandling av kontrollpreparaten, som utförs för att förbättra snittens vidhäftning till objektglasen, kan äventyra färgningsresultaten. 10 x flaskor Påfyllningsbar reagensflaska, 12 ml kapacitet Varje flaska kan innehålla 12 ml reagens. Flaskorna ska användas för blandning och förvaring av substrat-kromogenlösning (se även avsnittet Reagensberedning). Levereras i en separat påse. OBS! Alla reagenser är specifikt utformade för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras. ( ) P04083SE_01_SK / s. 21/40

22 Magcancer Material som behövs men inte medföljer - Mage Försiktighetsåtgärder - Mage Dako Wash Buffer, kod S3006 Motfärg: Hematoxylin, såsom Hematoxylin for Automated Link Platforms, (kod SK308) Täckglas Destillerat eller avjoniserat vatten Torkugn, som kan bibehålla 60 C eller lägre Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (4 40x objektivförstoring) Monteringsmedel, såsom Dako Faramount (kod S3025) eller Dako Glycergel (kod C0563) Positiva och negativa vävnader att använda som processkontroller (se avsnittet om Kvalitetskontroll) Objektglas, SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagda objektglas eller Dako Silanized Slides (kod S3003) Xylen, toluen eller xylensubstitut SK001 har anpassats speciellt för användning med Dako Automated Link-plattformar. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ansamlas i avloppet (21). 4. HercepTest Peroxidase-Blocking reagens innehåller 3 % väteperoxid. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. 5. HercepTest anti-humant HER2-protein från kanin, HercepTest visualiseringsreagens och HercepTest negativt kontrollreagens innehåller material av animalt ursprung. 6. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 7. Kontrollglas och prover, före och efter fixering, samt alla material som exponerats för dessa, bör hanteras som potentiellt smittbärande och kasseras med lämpliga försiktighetsåtgärder (22). Pipettera aldrig reagenser med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagenser och prover. Om reagenserna kommer i kontakt med känsliga områden, tvätta med stora mängder vatten. 8. Minimera mikrobiell kontaminering av reagenser eftersom en ökning av icke-specifik färgning annars kan inträffa. 9. Andra inkubationstider, temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. För lång torkning i mer än en timme vid 0 C kan orsaka en signifikant minskning eller förlust av den specifika membran-associerade HER2-immunreaktiviteten (17). 10. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i minskad antigenfärgning. 11. Alla reagenser är specifikt utformade för användning med detta test. För att testet ska fungera som specificerat bör inga ändringar utföras. 12. HercepTest visualiseringsreagens och HercepTest DAB-kromogen kan påverkas negativt om de utsätts för höga ljusnivåer. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, såsom direkt solljus. 13. För korrekt tolkning av resultaten av HercepTest på färgade biopsiprover från adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, rekommenderas ett kluster om minst 5 färgade tumörceller. Ett kluster om minst 5 färgade tumörceller består av 5 länkade HER2-färgade tumörceller. 14. På grund av magcancerbiopsiprovernas heterogena natur är det viktigt att utföra HER2 IHCanalyserna på flera delar (7-8) av biopsier från olika regioner på tumören för att få fram ett tillförlitligt resultat. 15. Det rekommenderas att mer än ett vävnadsblock med resektat av magcancer testas när provet uppvisar en hög grad av heterogenitet (40). 16. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden Säkerhetsdatablad kan beställas av yrkesanvändare Oanvänd lösning måste kasseras i enlighet med lokala och statliga föreskrifter. Användning av andra reagensvolymer än de som rekommenderas kan leda till förlust av synlig HER2-immunreaktivitet. Vävnadssnitt större än 22 mm x 22 mm kräver 2-3 x 200 µl reagens, applicerat på 2-3 automatiserade applikationsområden. 20. HercepTest DAB kromogen innehåller 1 5 % 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid (bifenyl-3,3,4,4 -tetrayltetraammoniumtetraklorid) och märks: Fara H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 21. Rester av paraffin kan leda till falska negativa resultat. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt ( ) P04083SE_01_SK / s. 22/40

23 Magcancer utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner (enligt EU-direktivet 94/33/EC). Ytterligare information finns i databladet för materialsäkerhet (MSDS). USA: 3,3 -diaminobensidin (DAB) kan vara farligt vid inandning, hudkontakt och förtäring. Materialet irriterar ögonen och huden. Om hudkontakt skulle förekomma, ska påverkade områden sköljas med tvål och vatten. OBS! Även om diaminobensidin är strukturellt relaterad till bensidin, finns inga bevis för carcinogenicitet hos diaminobensidin. Konsultera lokala eller statliga föreskrifter för kassering. ( ) P04083SE_01_SK / s. 23/40

24 Magcancer Förvaring - Mage Provförberedning - Mage Produkten ska förvaras vid 2 8 C när den inte anvä nds på Dako Automated Link-plattformar. HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer och HercepTest DAB Chromogen ska förvaras mörkt vid 2 8 C. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som är tryckt på förpackningen. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som anges i produktbladet (14a,14b). Observera att kontrollpreparaten också måste förvaras vid 2 8 C. Det finns inga tydliga tecken som tyder på instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller analyseras samtidigt med patientproverna. Kontakta omedelbart Dakos Tekniska Support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara problem med HercepTest. Biopsier, excisioner eller resektioner som tagits från adenocarcinomprover i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen måste hanteras så att vävnaden bevaras för immuncytokemisk färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling bör användas för alla prover (15). Vid testning av små biopsiprover, måste man säkerställa att tumörmorfologin är intakt och att det finns tillräckligt många tumörceller för IHC-utvärdering. Om en HercepTest -analys utförs på ett biopsiprov, bör flera (7-8) biopsier från olika delar av tumören analyseras för att man ska uppnå en tillförlitlig bestämning av HER2-statusen. Paraffininbäddade snitt Endast vävnad bevarad i neutralbuffrat formalin och paraffininbäddning lämpar sig för användning. Proverna ska exempelvis göras till 3 4 mm tjocka block och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Biopsiproverna fixerades i 6-8 timmar i ToGA-prövningen (se (36) för studiereferens). Vävnaderna dehydreras därefter i en serie med alkohol och xylen, följt av en infiltration av smält paraffin vid en temperatur på högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader som uttrycker HER2-protein kommer att vara stabila under obegränsad tid före snittning och montering på objektglas om de förvaras kallt (15 25 C) (15,16). I USA kräver Clini cal Laboratory Improvement Act, 1988 i 42 CFR (b) att Laboratoriet måste behålla färgade objektglas i minst tio år från undersökningsdatum och provblock i minst två år från undersökningsdatum (16). Vävnadsprover ska skäras i snitt på 4 5 µm, monteras på objektglas och lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar (eller tills de är torra), vid 37 C över natten eller vid 60 C i en timme. VARNING! För hög värme i mer än en timme vid 60 C kan orsaka en signifikant minskning eller fö rlust av den specifika membranassocierade HER2-immunreaktiviteten (17). För att bevara antigeniciteten bör snitt som monterats på objektglas (SuperFrost Plus, poly-l-lysine eller silaniserade objektglas) färgas inom 4 6 veckor efter snittning, vid förvaring vid rumstemperatur (20 25 C) (18). Objektglas som krävs för HER2-proteinutvärdering och verifiering av tumörförekomst bör förberedas samtidigt. De preparat som behövs för utvärdering av HER2-protein och för att bekräfta närvaro av tumör ska framställas samtidigt. Minst 5 objektglas rekommenderas, 1 objektglas för tumörnärvaro, 2 objektglas för utvärdering av HER2-protein (1 för inkubation med anti-humant HER2-protein från kanin och 1 för inkubation med negativt kontrollreagens) och 2 objektglas för backup. Användning av HercepTest på avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. Se Dakos Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) och litteraturhänvisningarna 15 och 16 för ytterligare information om provpreparation. Bearbetning av vävnader före färgning En specifik epitopåtervinningsmetod i 0,01 mol/l citratbuffert måste användas för optimal analysprestanda. Epitopåtervinningslösningen medföljer HercepTest -satsen. Denna metod innefattar uppvärmning av snitt som monterats på objektglas som nedsänkts i 0,01 mol/l citratbuffert (20) i ett kalibrerat vattenbad eller Dako PT Link vid den erfordrade temperaturen (95 99 C). Laboratorier vid högre höjder bör bestämma den bästa metoden för att bibehålla den erfordrade temperaturen. Andra metoder för epitopåtervinning har testats och ger inte reproducerbara resultat. Avvikelse från den beskrivna proceduren kan påverka resultaten. Provförberedning - Mage Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: Epitope Retrieval Solution Späd en tillräcklig kvantitet av HercepTest Epitope Retrieval Solution 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten för färgningsproceduren som planeras. Oanvänd spädd lösning kan användas i en vecka vid rumstemperatur eller förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den spädda lösningen om den är grumlig. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd av Dako Wash Buffer (kod S3006) 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan användas i en vecka vid rumstemperatur eller förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. ( ) P04083SE_01_SK / s. 24/40

25 Magcancer Substrat-kromogenlösning (DAB) Bered substrat-kromogenlösning i de påfyllningsbara flaskorna genom att tillsätta 25 µl DAB-kromogen per 1 ml DAB substratbuffert och blanda. Beredd Substrate Chromogen Solution (DAB) är stabil i cirka 5 dagar när den förvaras vid 2 8 C. Denna lösning ska blan das ordentligt före användning. Eventuell utfällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. Den påfyllningsbara flaskan innehållande Substrate-Chromogen Solution måste definieras i Dako Automated Link-plattformen före användning. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information. OBS! Färgen på flytande DAB-kromogen kan variera från klar till ljust lavendel-brun. Detta påverkar inte prestandan hos denna produkt. Späd enligt riktlinjerna i detta produktblad. Tillsats av överflödigt DABkromogen till DAB-buffrat substrat resulterar i försämring av den positiva signalen. Motfärg DAB-färgningsreaktionens färgade slutprodukt är olöslig i alkohol och vatten. Hematoxylin för Automated Linkplattformar (kod SK308) kan användas som en motfärg. De nödvändiga stegen och inkubationstiderna är förprogrammerade i programvaran för Dako Link. reagensberedning behövs. Monteringsmedel Ett icke-vattenhaltigt, permanent monteringsmedel rekommenderas. Vattenhaltig montering är emellertid också acceptabelt. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kod C0563) rekommenderas för vattenbaserad montering. Gör glycergel flytande genom att värma det till cirka 40 (± 5) C före användning. Färgningsprocedur - Mage Proceduranmärkningar Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter och instrument innan de används (se avsnittet Försiktighetsåtgärder). Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. De nödvändiga stegen och inkubationstiderna för färgning är förprogrammerade i programvaran för Dako Link. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information om programmeringsprotokoll och laddning av objektglas och reagenser. Om färgningsproceduren avbryts kan glasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av primärantikroppen i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C) uta n att färgningsresultatet påverkas. Avparaffinering och rehydrering Före färgning måste vävnadsobjektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Undvik ofullständigt avlägsnande av paraffin. Kvarlämnat inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i absolut etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i 95 % etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 4. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i destillerat eller avjoniserat vatten i minst 30 sekunder. Påbörja färgningsproceduren enligt beskrivningen i färgningsprotokollavsnittet under Epitopåtervinning. Xylen- och alkohollösningar ska bytas efter 40 objektglas. Toluen eller xylenersättningar, t.ex. Histoclear, kan användas. OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer denna sats har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra analysresultaten ogiltiga för användning vid urval av patienter för Herceptin -terapi. Färgningsprotokoll Alla de nödvändiga stegen och inkubationstiderna för färgning är förprogrammerade i programvaran för Dako Link-plattformar. Efter avparaffinering, rehydrering och epitopåtervinning kommer instrumentet att behandla objektglasen enligt nedanstående beskrivning. ( ) P04083SE_01_SK / s. 25/40

26 Steg 1: Epitopåtervinning Fyll Dako PT-modulkaren eller färgningskärl, t.ex. Coplin-burkar, med Epitope Retrieval Solution (se Reagensberedning). Magcancer För Dako PT Link: Förvärm den spädda Epitope Retrieval Solution i Dako PT Link-karet till 85 C. Efter uppvärmning blir epitopåtervinnningslösningen grumlig. Placera de de rumstempererade, avparaffinerade snitten i Autostainer-ställ och sänk ned objektglasen i förvärmd Epitope Retrieval Solution. Låt Dako PT Link värmas upp till 97 ±C och inkubera i 40 (±1) minuter vid 97 C. Låt snitten svalna i Dako PT Link tills temperaturen når 85 C. Avlägsna PT Link-karen med snitten från Dako PT Link. Låt karen vara kvar på bordet i 10 minuter med locket av för ytterligare avsvalning. Skölj snitten med tvättbuffert. Ytterligare information finns i användarhandboken till Dako PT Link. För Coplin-kärl: Placera färgningskärl med spädd Epitope Retrieval Solution i vattenbad. Värm vattenbad och Epitope Retrieval Solution till C. Efter upp värmning blir epitopåtervinnningslösningen grumlig. Täck kärlen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda Epitope Retrieval Solution i färgningskärlen. Återställ temperaturen på vattenbadet och Epitope Retrieval Solution till C. Inkubera i 40 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med ob jektglas från vattenbadet. Låt objektglasen svalna i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minuter vid rumstemperatur. Hall ut Epitope Retrieval Solution och skölj snitten i tvättbufferten. För optimal prestanda ska snitten ligga i Wash Buffer i 5 20 minuter efter epitoputvinning och före färgning. OBS! Epitope Retieval Solution är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Färgningsprocedur Efter epitopåtervinning placeras objektglasen som placerats i instrumentställningar på Dako Automated Linkplattformarna. Instrumentet kommer att utföra färgningsprocessen genom att applicera lämpligt reagens, övervaka inkubationstiden och skölja objektglasen mellan reagenserna. Inkubationstiderna för reagensen är förprogrammerade i programvaran för Dako Link. Steg 3: Motfärg Objektglasen kan motfärgas med Hematoxylin för Automated Link-plattformar (kod SK308). Det finns två färgningsprotokoll i programvaran för Dako. Ett innefattar en hematoxylin motfärg och det andra innefattar inte detta. Inkubationstiden för hematoxylin är förprogrammerad i protokollet som inkluderar en motfärg. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information om programmering av protokoll. Steg 4: Montering Icke vattenhaltigt, pemanent monteringsmedium rekommenderas. Vattenhaltigt monteringsmedel är emellertid också acceptabelt. Prover kan monteras och förses med täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedel, såsom Dako Faramount (kod S3025) eller Dako Glycergel (kod C0563). OBS! Objektglasen kan avläsas när så är lämpligt. Viss blekning förekommer emellertid om objektglasen täcks med ett vattenhaltigt monteringsmedium och utsätts för starkt ljus under en period på en vecka. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekningen. ( ) P04083SE_01_SK / s. 26/40

27 Magcancer Kvalitetskontroll - Mage Avvikelser i vävnadsfixering, behandling och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt med regelbundna egna kontroller utöver användningen av kontrollpreparaten från Dako. För användare i USA, se riktlinjerna för kvalitetskontroll från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry samt även CLSI (f.d. NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23) och referens 24 för ytterligare information. Tabell 8: Syftet med daglig kvalitetskontroll. Vävnad: Fixerade och behandlade som patientprover Positiv kontroll: Vävnader eller celler som innehåller målantigen som ska detekteras (kan finnas i patientvävnad). Den ideala kontrollen är svagt positivt färgande vävnad eftersom denna är mest känslig för antikropps- eller antigendegradering. Negativ kontroll: Vävnader eller celler som förväntas vara negativa (kunde lokaliseras i patientvävnad eller positiv kontrollvävnad) Specifika antikroppsoch detekteringssystem Kontrollerar alla stegen i analysen. Validerar reagenser och procedurer som används för HER2-proteinfärgning Detektion av oavsiktlig korsreaktivitet mellan antikropp och celler/cellulära komponenter Icke-specifik antikropp* eller buffert plus samma detektionssystem som används med specifik antikropp Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Patientvävnad Detektion av specifik färgning Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning Kontrollpreparat tillhandahålls av Dako Färgningsprocedur endast för kontroller * Serum från samma art som den specifika antikroppen, men inte riktade mot samma målantigen. För att detektera icke-specifik antikroppsbindning, t.ex. bindning av Fc-delen av antikroppen genom vävnaden. Kontrollglas (medföljer) Vart och ett av de medföljande kontrollpreparaten innehåller tre pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade humana bröstcancercellinjer med färgningsintensitetspoäng 0, 1+ och 3+. Ett objektglas bör färgas i varje färgningskörning. Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. Positiv kontrollvävnad Kontroller bör vara färska autopsi-/biopsi-/kirurgiska prover, som fixerats, behandlats och inbäddats så snart som möjligt på samma sätt som patientprovet (proverna). Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt preparerad vävnad och korrekt färgningsteknik. En positiv kontrollvävnad för varje sats testförhållanden bör inkluderas i varje färgningskörning. De positiva kontrollvävnaderna ska ge svag positiv färgning så att de kan detektera små förändringar i den primära antikroppens sensitivitet. Kontrollpreparaten som levereras med detta system eller prover som behandlats annorlunda än patientprover validerar endast reagensprestanda och verifierar inte vävnadspreparationen. Använd nyligen bestämda HER2-protein 2+ överuttryckt adenocarcinom i mage eller gastro-esofageala förbindelsen som ideal positiv vävnadskontroll. OBS! Kända positiva kontrollvävnader bör endast användas för att övervaka korrekt prestanda av behandlade vävnader och testreagenser, INTE som ett hjälpmedel för att formulera en specifik diagnos av patientprover. Om positiva kontrollvävnader inte uppvisar riktig positiv färgning bör resultaten med testproverna anses som ogiltiga. Negativ kontrollvävnad Använd en negativ kontrollvävnad (som är känt HER2 -proteinnegativ), fixerad, behandlad och inbäddad på ett sätt som är identiskt med patientproverna, med varje färgningskörning för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppen och för att ge en indikation på specifik bakgrundsfärgning. Kolon, lever och sköldkörtel är lämpliga för negativ kontrollvävnad. Mångfalden av olika celltyper, som förekommer i de flesta vävnadssnitt, ger interna negativa kontrollsiter (detta måste verifieras av användaren). Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga. Se användarhandboken för Dako Automated Link-plattformar för ytterligare information om programmering av kontrollpreparat. Icke-specifikt negativt kontrollreagens Använd det medföljande negativa kontrollreagenset istället för den primära antikroppen med ett snitt av varje patientprov för att utvärdera icke-specifik färgning och åstadkomma en bättre tolkning av specifik färgning på antigenplatsen. Inkuberingsperioden för negativt kontrollreagens bör motsvara inkuberingsperioden för den primära antikroppen. ( ) P04083SE_01_SK / s. 27/40

28 Magcancer Analysverifiering Före den första användningen av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur ska användaren verifiera analysens resultat genom att testa den på en serie egna vävnader med kända IHC-prestandaegenskaper som representerar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurer som tidigare beskrivits i det här avsnittet av bipacksedeln och till kvalitetskontrollkrav i CAP Certification Program for Immunohistochemistry och/eller CLSI (före detta NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23). Dessa kvalitetskontrollprocedurer bör upprepas för varje ny sats med antikroppar eller när analysparametrarna ändras. Adenocarcinom i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen med kända HER2-proteinfärgningsintensiteter från 0 3+ och negativa vävnader, t.ex. kolon, lever eller sköldkörtel är lämpliga för analysverifiering. Färgningstolkning - Mage För bestämning av överexpression av HER2-protein bör endast färgningsintensiteten och mönstret för membranet utvärderas med användning av den skala som anges i Tabell 9. Utvärdering av objektglas ska utföras av en patolog med användning av ett ljusmikroskop. För utvärdering av immuncytokemisk färgning och poängsättning är ett objektiv med 10x förstoring lämpligt. Användning av ett objektiv med 5-40x förstoring är användbart för bekräftelse av intensiteten. Cytoplasmisk färgning bör anses som icke-specifik färgning och ingår inte i bedömningen av membran-färgningsintensitet (8). För hjälp med differentieringen av 0, 1+, 2+ och 3+ färgning, se Dakos HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer för representativa bilder på färgningsintensiteter och -mönster. Endast prover från patienter med adenocarcinom i magen, inklusive den gastroesofageala förbindelsen, ska poängsättas. I fall med intestinal metaplasi och gastriskt adenocarcinom i samma prov ska endast den gastriska adenocarcinomkomponenten poängsättas. För tolkning av HercepTest -färgade biopsier rekommenderas ett kluster med minst 5 färgade tumörceller. Ett kluster om minst 5 färgade tumörceller består av 5 länkade HER2-färgade tumörceller. Tabell 9. Tolkning och poängsättning av HER2-immunhistokemisk färgning Poäng Kirurgiskt prov Färgningsmönster reaktivitet eller ingen membranös reaktivitet i < 10 % av tumörceller En svag/knappt märkbar membranös reaktivitet i 10 % av tumörcellerna; cellerna är reaktiva i endast en del av sina membran En svag till måttlig fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet i 10 % av tumörcellerna. En stark, fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet i 10 % av tumörcellerna. Biopsiprov Färgningsmönster reaktivitet eller ingen membranös reaktivitet i någon (eller < 5 klustrade) tumörcell Tumörcellkluster ( 5 celler) med en svag/knappt märkbar membranös reaktivitet, oberoende av antalet färgade tumörceller Tumörcellkluster ( 5 celler) med en svag till måttlig, fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet, oberoende av antalet färgade tumörceller Tumörcellkluster ( 5 celler) med en stark, fullständig, basolateral eller lateral membranös reaktivitet, oberoende av antalet färgade tumörceller Bedömning av överexpression av HER2-protein Negativt Negativt Osäkert Positivt Riktlinjer baserade på Hofmann et al. (39). HercepTest tolkas som negativt för överexpression av HER2-protein (0 och 1+ poäng), svagt positiv (2+ poäng), och starkt positiv (3+ poäng). HercepTest är inte avsett att tillhandahålla prognostisk information till patienten och läkaren och har inte validerats för detta ändamål. Objektglasen bör undersökas för varje färgningskörning i den ordning som anges i Tabell 10, för att fastställa färgningskörningens validitet och möjliggöra semikvantitativ bedömning av färgningsintensiteten hos provvävnaden. ( ) P04083SE_01_SK / s. 28/40

29 Magcancer Tabell 10: Preparatutvärderingens ordning. Preparatavläsningsordning 1. Kontrollpreparat innehållande de tre cellinjerna Logisk grund Närvaro av 3+ brun cellmembranfärgning (kantning) i 3+ kontrollcellinjen SK-BR-3, delvis brun kantning i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, och ingen färgning i 0 kontrollcellinjen MDA-231, indikerar en giltig analys. Punktad och diskontinuerlig membranfärgning är närvarande i ett litet till måttligt antal av cellerna i den svagt positiva 1+ kontrollcellinjen MDA-175. Även punktliknande immunfärgning av Golgi-regionen i cytoplasman kan observeras i denna cellinje. Närvaro av brun färgning i 0-kontrollcellinjen MDA-231 (negativ för HER2-proteinfärgning) indikerar att icke-specifik färgning förekom under analysen. Analysresultaten kan vara ogiltiga på grund av överfärgning. 2. Positiv kontrollvävnad Närvaro av brun membranfärgning bör observeras. Färgning av cytoplasman och negativa vävnader bör inte vara mer än Negativ kontrollvävnad FRÅNVARO av specifik färgning av den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik membranfärgning inträffar i de negativa kontrollvävnaderna ska resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. 4. Patient-vävnad som färgats med negativt kontrollreagens 5. Patient-vävnad som färgats med användning av den primära antikroppen Frånvaro av specifik membranfärgning bekräftar den specifika märkningen av målantigenen genom den primära antikroppen. Annan medelbrun eller brun färgning, som förekommer i cytoplasman hos provet som behandlas med den negativa kontrollreagensen, såsom i bindvävnad, leukocyter, erytrocyter eller nektrotisk vävnad, bör betraktas som icke-specifik bakgrundsfärgning och bör inte rapporteras i avsnittet Kommentarer i databladet. När överexpression av HER2-protein detekteras i provet kommer detta att uppträda som brun kantning lokaliserat på cellmembranet hos tumörcellerna som behandlats med den primära antikroppen. 1. Kontrollpreparat (medföljer): Kontrollpreparatet, som färgats med HercepTest, bör undersökas först för att säkerställa att alla reagenser fungerar korrekt. Närvaron av en brun (3,3 -diaminobensidin, DAB) reaktionsprodukt på cellmembranet indikerar en positiv reaktivitet. Närvaro av periferisk, brun cellmembranfärgning (kantning) i 3+ kontrollcellinjen SK-BR-3, partiell brun kantning i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, och ingen färgning i 0 kontrollcellinjen MDA-231, indikerar en giltig analys. Om någon av kontrollcellinjerna är utanför dessa kriterier ska alla resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. 2. Positiv kontrollvävnad: Den positiva kontrollvävnaden bör undersökas därefter. Detta preparat verifierar att fixeringsmetoden och epitopåtervinningsprocessen är effektiva. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultaten eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt (25). Färgning bör observeras i tumörvävnad som brun cellmembranfärgning. Brun färgning av cytoplasman och negativa vävnader i provet bör inte motsvara mer än 1+ färgningsintensitetspoäng. 3. Negativ kontrollvävnad: Den negativa kontrollvävnaden bör undersökas efter den positiva kontrollvävnaden för att verifiera specificiteten av märkningen av målantigenen genom den primära antikroppen. Frånvaron av specifik färgning i den negativa kontrollvävnaden bekräftar bristen på korsreaktivitet mellan satsen och celler/cellulära komponenter. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden ska resultaten med patientproverna betraktas som ogiltiga. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativa kontrollvävnad, men detta måste verifieras av användaren. Notera att en svag reaktion (0 1+ färgningsintensitet) kan observeras i de flesta normala epitelialvävnader. Möjliga negativa kontrollvävnader innefattar: kolon, lever och sköldkörtel. Icke-specifik färgning, om sådan är närvarande, kommer att ha ett diffust utseende. Sporadisk färgning av bindvävnad kan också observeras i snitt från överdrivet formalinfixerade vävnader Patientvävnad: Undersök patientproverna som färgats med HercepTest sist. Positiv färgningsintensitet bör fastställas inom ramen för all icke-specifik bakgrundsfärgning med det negativa kontrollreagenset. Liksom med alla immuncytokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte detekterades, inte att antigenen var frånvarande i de analyserade cellerna/vävnaden. Se Sammanfattning och förklaring, Begränsningar, och Prestandaegenskaper för specifik information angående HercepTest immunreaktivitet. ( ) P04083SE_01_SK / s. 29/40

30 Magcancer Ytterligare rekommendationer för tolkning av HercepTest -färgning Adenocarcinom i magen eller gastro-esofageala förbindelsen, som testats för överexpression av HER2-protein, poängsätts från 0 till 3+. Även om 0 och 3+ fallen är entydiga kan en liten del av de återstående 1+ och 2+ proverna vara svårare att tolka. Använd följande riktlinjer för tolkning av HercepTest -färgning i ert laboratorium. 1. Utvärdera kontrollcellinjerna för att validera analysprestandan. 2. Utvärdera de positiva och negativa kontrollpreparaten. 3. En hematoxylin- och eosin- (H&E) färgning av vävnadsproven rekommenderas för den första utvärderingen. (Tumören kanske inte är uppenbar när man betraktar provet som färgats med HercepTest. Ett H&E färgat preparat krävs från patologen för att bekräfta närvaron av tumören.) HercepTestet bör utföras på ett parat snitt (seriesnitt) från samma paraffinblock av provet. 4. Utvärdera snitten som färgats för överexpression av HER2-protein först med låg förstoringeffekt. Majoriteten av positiva fall kommer att vara uppenbara vid låg förstoring med låg effekt. 5. För 1+ fallen, använd ett objektiv med 40x förstoring för att verifiera membranfärgningen. 6. För 2+ fallen, använd ett objektiv med 10 20x förstoring för att verifiera membranfärgningen. Kirurgiska prover 1. Väl konserverade och välfärgade områden hos provet bör inte användas för att fastställa procentvärdet positiva tumörceller. 2. Om de flesta tumörceller uppvisar fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning är färgningen antingen 2+ eller Om en fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning vid stark intensitet förekommer i 10 % eller fler av tumörcellerna i kirurgiska prover är poängen för provet Om en fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning vid svag till måttlig intensitet förekommer i 10 % eller fler av tumörcellerna i kirurgiska prover är poängen för provet Om 10 % eller fler av tumörcellerna i kirurgiska prover, som färgats i endast en del av deras membran, har en svag/knappt märkbar intensitet är poängen för provet Om mindre än 10 % av tumörcellerna i kirurgiska prover har färgats, oavsett färgningsmönster (t.ex. fullständig, basolateral eller lateral eller del av deras membran), är poängen Om ingen färgning observeras är poängen för det kirurgiska provet 0. Biopsiprov 1. Ett kluster om minst 5 färgade tumörceller består av 5 länkade HER2-färgade tumörceller. 2. Om det finns ett tumörcellkluster med minst 5 färgade tumörceller med en stark, fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning, är poängen för biopsiprovet 3+ oberoende av antalet färgade tumörceller. 3. Om det finns ett tumörcellkluster med minst 5 färgade tumörceller med en svag till måttlig, fullständig, basolateral eller lateral membranfärgning, är poängen för biopsiprovet 2+ oberoende av antalet färgade tumörceller. 4. Om det finns ett tumörcellkluster med minst 5 färgade tumörceller med en svag/knappt märkbar membranfärgning och cellerna är endast färgade i en del av deras membran, är poängen för biopsiprovet 1+ oberoende av antalet färgade tumörceller. 5. Om ingen färgning observeras är poängen för biopsiprovet Om membranfärgning (oavsett färgningens intensitet) observeras i färre än 5 tumörceller i kluster är poängen för biopsiprovet 0. ( ) P04083SE_01_SK / s. 30/40

31 Magcancer Begränsningar - Mage Produktspecifika begränsningar - Mage 1. Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialutbildning vid val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, beredning av IHC-preparaten och tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, värmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan ge artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3. Överdriven eller ofullständig motfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. 4. Den kliniska tolkningen av positiv färgning, eller frånvaron av densamma, måste utvärderas inom ramen för den kliniska anamnesen, morfologin och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av all färgning eller frånvaro av färgning, måste kompletteras med morfologiska undersökningar och korrekta kontroller, såväl som andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog, som är förtrogen med antikropparna, reagenserna och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under övervakning av en patolog, som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och tillförsäkrar att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (26). 6. Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnadstyper. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenexpression i neoplasmer eller andra patologiska vävnader (27). Rapportera dokumenterade oväntade reaktioner till Dakos Tekniska Support. 7. Falskt positiva resultat kan observeras på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. Detta kan även orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C) (27). 8. Färgningsproceduren kommer att utföras vid den förprogrammerade temperaturen (20 25 C). 1. Antigenen, som är närvarande i 1+ kontrollcellinjen MDA-175, utsätts för degradering över tiden. Fastställ kontrollpreparatresultaten i samband med kontrollpreparatets utgångsdatum. Negativ färgning av MDA-175 cellerna kanske endast indikerar att kontrollpreparatet har degraderats. Kontrollpreparaten måste förvaras vid 2 8 C. 2. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover ska färgas inom 4 6 veckor efter montering av vävnaderna på objektglas, om de förvaras i rumstemperatur (20 25 C) (27). 3. Ersätt inte kitreagenser med reagenser med andra satsnummer eller med reagenser från andra tillverkare. 4. Falska resultat kan erhållas från utvärdering av cytoplasmisk färgning. Beakta endast intensiteten av cellmembranfärgningen vid tolkning av resultat. 5. Färgade kontrollpreparat bör endast användas för validering av färgningskörningen och bör inte användas som en riktlinje för att poängsätta färgningsreaktionen i vävnadssnitt. 6. Starkt fokal färgning (3+), dvs. hot spots, kan ibland observeras. Detta kan vara resultatet av ojämn fixering och/eller behandling av vävnad. Immunfärgning av ett andra vävnadsblock från samma prov rekommenderas. 7. Användning av HercepTest på prover som fixerats i andra fixativ än neutralbuffrat formalin har inte validerats. 8. Observera att normalt tonsill- och esofagusepitel kan färga upp till 2+ intensitet. 9. Användning av icke hela magcancerprover och tolkning av artefaktuell färgning runt en biopsikant ska undvikas. ( ) P04083SE_01_SK / s. 31/40

32 Magcancer Prestandaegenskaper - Mage Bakgrund: Säkerheten och effektiviteten med trastuzumab (Herceptin ) har påvisats i en klinisk studie (ToGA-prövningen) (37, 38). Studien var utformad som en öppen, randomiserad, multicenter fas III-studie av HER2-positiva patienter med långt framskriden lokal cancer som inte går att operera, återkommande och/eller metastatiskt adenocarcinom i magen eller den gastro-esofageala förbindelsen. I ToGA-prövningen definierades HER2-positivitet som antingen IHC-positiv (3+), (HercepTest, Dako) och/eller positiv genom HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Efter inklusion i studien randomiserades patienterna för att få kemoterapi (5-FU eller capecitabine och cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Den primära slutpunkten i studien var total överlevnad (OS). I studien randomiserades sammanlagt 594 patienter och 584 patienter erhöll studieläkemedlet och inkluderades i FAS (Full Analyses Set) (full analysuppsättning). För den primära slutpunkten visade sig kombinationen av kemoterapi plus trastuzumab vara statistiskt överlägsen jämfört med behandling med endast kemoterapi. OS-medeltalet ökade från 11,1 till 13,8 månader (p=0,0046) med ett riskförhållande på 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Kaplan-Meier-kurvorna för OS visas i figur 1. Elulemuse tõenäosus 1,0 0,9 0,8 0,7 Logaritmiline astaktest P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 aeg (kuudes) Järelejäänute arv Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp ravirühm Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 1. Kaplan-Meier-kurva för OS (n=584). Förspecificerade utforskande analyser av undergrupper av HER2-status utfördes när data fanns tillgänglig. Två nya HER2-undergrupper definierades post hoc baserat på IHC-poängsättning: Grupp 1 ( grupp med lågt HER2-uttryck ): IHC 0/FISH+ och IHC 1+/FISH+ (n=131) Grupp 2 ( grupp med högt HER2-uttryck ): IHC 2+/FISH+ och IHC 3+ (FISH+ eller FISH- eller FISH inget resultat) (n=446) När den primära analysen av OS upprepades post hoc för gruppen med högt HER2-uttryck) (n=446) noterades en större fördel med den kombinerade behandlingen. OS-medeltalet för patientgruppen som hade fått kemoterapi plus trastuzumab ökade till 16,0 månader jämfört med 11,8 månader för patienter som endast fick kemoterapi. Riskförhållandet för denna analys minskade till 0,65 (95 % CI: 0,51-0,83). Kaplan-Meierkurvorna för OS för gruppen med högt HER2-uttryck visas i figur 2. ( ) P04083SE_01_SK / s. 32/40

33 Magcancer Elulemuse tõenäosus 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 aeg (kuudes) Järelejäänute arv Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp ravirühm Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 2. Kaplan-Meier-kurvorna för OS för gruppen med högt HER2-uttryck (n=446). ToGA-prövningen har visat att kombinationen av IHC- och FISH-testning är förutsägbar för effekten av den kombinerade behandlingen med kemoterapi och trastuzumab, men utforskande post hoc-analyser verkar indikera att det för patienter med högre nivåer av HER2-proteinuttryck (IHC2+/FISH+ och IHC3+) ger bättre fördelar. Detta kan förklaras av det faktum att proteinet utgör målet för trastuzumab. Ytterligare information om ToGA-prövningen finns i bipacksedeln för Herceptin. Reproducerbarhet Reproducerbarhet inom körningar Reproducerbarhet inom körningar testades i ett laboratorium med 3 prover av olika IHC-färgningspoäng. Varje prov kördes tredubbelt. Detta protokoll användes med automatisk färgning. Alla prover gav 100 % reproducerbara resultat. Reproducerbarhet inom körningar testades i ett laboratorium med 11 prover av olika IHC-färgningsintensitetspoäng. Varje prov kördes tredubbelt. Detta protokoll användes med manuell färgning. Alla prover gav 100 % reproducerbara resultat. Reproducerbarhet inom och mellan laboratorier: HercepTest -analys av 60 olika gastriska cancerprover från områden i magen eller den gastroesofageala förbindelsen som representerade kirurgiska resektioner och biopsier utfördes under fem icke på varandra följande dagar på tre olika studiekliniker. De 60 proverna i studien var jämnt fördelade över de tre HER2- statuskategorierna. Totalt 2040 HER2-poängsättningar utfördes av sex patologer. Överensstämmelsen från dag till dag (negativa, tvetydiga, positiva) varierade från 83,1 % till 98,3 %. Vid 47 av 60 möjliga jämförelser var överensstämmelsen 90,0 % eller högre. I Tabell 1 visas specifika exempel på jämförelserna dag för dag med en genomsnittlig överensstämmelse på 91,2 %, 92,5 % och 92,5 % för de tre klinikerna. Överensstämmelsen mellan de olika klinikerna var 82,7 %, 75,0 % respektive 88,0 % vid parvisa klinikjämförelser (se tabell 12). Enligt Fischers exakta test skiljde sig resultaten inte åt mellan klinikerna. Överensstämmelsen mellan observatörer för patologerna på de olika klinikerna var 88,0 %, 83,6 % respektive 81,0 % för de tre studieklinikerna (tabell 13). Sammanfattningsvis uppvisade HercepTest -analyserna av magcancerproverna på de tre studieklinikerna en god överensstämmelse mellan observationerna avseende dagar, kliniker och observatörer. ( ) P04083SE_01_SK / s. 33/40

34 Magcancer Tabell 11. Överensstämmelse dag för dag i procent - en undergrupp av 12 av 60 jämförelser Klinik 1 Klinik 2 Klinik 3 Dag 1 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 4 Dag 1 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 4 Dag 1 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 4 1 CI95 LL: 95 % nedre gräns för konfidensintervall. Observatör 1 Observatör 2 Genomsnittlig Överensstämmelsstämmelse CI95 LL 1 Överens- CI95 LL 1 överensstämmelse 85,0 74,4 93,3 84,9 93,3 84,9 93,3 84,9 95,0 87,3 83,1 72,0 96,7 89,7 95,0 87,3 90,0 80,5 91,7 82,7 96,7 89,7 91,7 82,7 91,2 92,5 92,5 Tabell 12. Övergripande överensstämmelse mellan klinikerna i procent Klinik 1 jämfört med klinik 2 Klinik 1 jämfört med klinik 3 Klinik 2 jämfört med klinik 3 Dag 1 jämfört med dag 1 Dag 2 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 3 Dag 4 jämfört med dag 4 Dag 5 jämfört med dag 5 Dag 1 jämfört med dag 1 Dag 2 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 3 Dag 4 jämfört med dag 4 Dag 5 jämfört med dag 5 Dag 1 jämfört med dag 1 Dag 2 jämfört med dag 2 Dag 3 jämfört med dag 3 Dag 4 jämfört med dag 4 Dag 5 jämfört med dag 5 1 CI95 LL: 95 % nedre gräns för konfidensintervall. Överensstämmelse CI95 LL 1 Genomsnittlig överensstämmelse 83,3 72,4 85,0 74,4 85,0 74,4 81,7 70,5 78,3 66,7 80,0 68,6 73,3 61,2 78,3 66,7 68,3 55,9 75,0 63,0 88,3 78,5 86,7 76,4 90,0 80,5 86,7 76,4 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 ( ) P04083SE_01_SK / s. 34/40

35 Tabell 13. Överensstämmelse mellan olika observatörer i procent Klinik 1 Klinik 2 Klinik 3 Överensstämmelse CI 95 LL 1 Genomsnittlig överensstämmelse Dag 1 91,7 82,7 Dag 2 91,7 82,7 Dag 3 93,3 84,9 88,0 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 80,0 68,6 Dag 1 86,4 76,0 Dag 2 83,3 72,4 Dag 3 83,3 72,4 83,6 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 81,7 70,5 Dag 1 80,0 68,6 Dag 2 78,3 66,7 Dag 3 80,0 68,6 Dag 4 78,3 66,7 Dag 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95 % nedre gräns för konfidensintervall. 81,0 Magcancer Immunreaktivitet Tabell 14 innehåller en sammanfattning av HercepTest immunreaktivitet med den rekommenderade panelen av normala vävnader. Alla vävnader formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med HercepTest enligt instruktionerna i produktbladet. Tabell 14. Sammanfattning av HercepTest normal vävnadsreaktivitet. Vävnadstyp (nr Testad) Positiv färgning av vävnadselement och färgningsmönster Binjure (3) Benmärg (3) Hjärna/cerebellum (3) Hjärna/cerebrum (3) Bröst (3) Cervix uteri (3) Kolon (3) Esofagus (3) Hjärta (3) Njure (3) Lever (3) Lunga (3) Mesotelceller (3) Äggstock (3) Bukspottkörtel (3) Bisköldkörtel (3) Perifer nerv (3) Hypofys (3) Prostata (3) Spottkörtel (3) Skelettmuskel (3) Hud (3) Tunntarm (3) Mjälte (3) Mage (3) Testis (3) Tymus (3) Sköldkörtel (3) Tonsill (3) Bröstkörtel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet) Tubuli i njurmedulla (3 av vävnader, 1 2+ i 5 50 % av celler, cytoplasmisk Prostatakörtel/gångar (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 50 % av celler, cytoplasmisk) Svettkörtlar (1 av 3 vävnader, 1+, 30 % av celler, cytoplasmisk) Cylinderepitel, yta (1 av 3 vävnader, 2+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Epitel (1 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 25 % av celler) Skivepitel (3 av 3 vävnader, 1+ färgningsintensitet, 80 % av celler) Livmoder (3) Den rapporterade färgningen i alla vävnader var membran, om inte annat anges. Alla tre prover av varje vävnadstyp hade samma färgningsintensitet, om inte annat anges. ( ) P04083SE_01_SK / s. 35/40

36 Magcancer Felsökning - Mage Se avsnittet om Felsökning i Dakos ovannämnda handbok (19) för korrigeringsåtgärder, eller kontakta Dakos Tekniska Support för att rapportera ovanlig färgning. Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärder 1. färgning av objektglasen. 1a. Programmeringsfel. Reagenserna har inte använts i korrekt ordning. 1a. Kontrollera objektglasens logg för att verifiera att korrekt program valts. 1b. Natriumazid i tvättlösning. 1b. Använd endast Dako Wash Buffer, 2. Svag färgning av objektglas. 3. Alltför kraftig bakgrundsfärgning av objektglas. 4. Fel slags objektglas används. 5. Alltför stark specifik färgning 6. Svag färgning av cellinjen på kontrollpreparat 1+. 1c. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan leda till förlust av synlig HER2- immunreaktivitet. kod S c. Vävnads-snitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torka vid 37 C över natten eller vid 60 C i maximalt en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2a. Otillräcklig epitopåtervinning. 2a. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att epitopåtervinning utförts på rätt sätt. 2b. Otillräckliga reagensinkubationstider 2c. Olämplig fixeringsmetod har använts. 2d. För hög värmning av monterade vävnadssnitt före avparaffinering och värmeinducerad antigenåtervinning kan orsaka en signifikant minskning av synlig HER2-immunreaktivitet. 2e. Otillräcklig reagensvolym applicerad. 3a. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt. 3b. Stärkelsetillsatser använda vid montering av objektglasen. 3c. Objektglasen har inte sköljts ordentligt. 3d. Snitten torkade under färgningsproceduren. 3e. Olämplig fixeringsmetod har använts. 2b. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att inkubationstiderna är korrekta. 2c. Kontrollera att patientvävnaden inte överfixerats och att ett godkänt fixativ använts. 2d. Vävnads-snitten lufttorkas vid rumstemperatur i minst 12 timmar eller tills de är torra. Alternativt kan de torka vid 37 C över natten eller vid 60 C i maximalt en timme. Torkning av vävnadssnitt vid förhöjda temperaturer får endast utföras i en kalibrerad ugn med jämn värmedistribution (17). 2e. Kontrollera vävnadssnittets storlek (22 mm x 22 mm) och applicerad reagensvolym. 3a. Använd färska avparaffineringslösningar. 3b. Använd inte stärkelsetillsatser för att fästa snitten vid objektglasen. Många tillsatser är immunreaktiva. 3c. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att objektglasen sköljts ordentligt. 3d. Verifiera att lämplig reagensvolym appliceras på objektglasen. 3e. Se till att ett godkänt fixativ använts. Alternativa fixativ kan orsaka överdriven bakgrundsfärgning. 3f. Kontrollera provets fixeringsmetod och att ingen nekros förekommer. 3f. Icke-specifik bindning av reagenser till vävnad. 4a. Föreslagen åtgärd 4a. Använd silaniserade objektglas såsom Dakos Silanized Slides (kod S3003), SuperFrost Plus eller poly- L-lysinbelagda objektglas. 5a. Olämplig fixeringsmetod har använts. 5b. Reagensinkuberingstiderna alltför långa. 5c. Olämplig tvättlösning har använts. 6a. Felaktigt epitopåtervinningsprotokoll har följts. 5a. Se till att bara godkända fixativ och fixeringsmetoder används. 5b. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att inkubationstiderna är korrekta. 5c. Använd endast Dako Wash Buffer, kod S a. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att epitopåtervinning utförts på rätt sätt. ( ) P04083SE_01_SK / s. 36/40

37 Magcancer 7. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid uppvärmning 8. Epitopåtervinningslösningen blir grumlig vid förvaring (före uppvärmning) 6b. reaktion med substratkromogenlösning (DAB). 6b. Kontrollera körningsloggen för att bekräfta att kromogenet prepareradts på rätt sätt. Kontrollera objektglasens logg för att bekräfta att inkubationstiden för kromogenet är korrekt. 6c. Försämring av kontrollpreparat. 6c. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden på förpackningens utsida. 7. Lösningen blir grumlig när den värms upp 8. Lösningen har förvarats på felaktigt sätt eller också har lösningens utgångsdatum passerats 7. Detta är normalt och påverkar inte färgningen 8. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden på förpackningens utsida. Kassera epitopåtervinningslösningen OBS! Om problemet inte härrör från någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna åtgärden inte löser problemet, kontakta Dakos Tekniska Support för ytterligare hjälp. Ytterligare information om färgningstekniker och provframställning finns i Dakos ovannämnda handbok (19) (tillgänglig från Dako), Atlas of Immunohistology (29) och Immunoperoxidase Techniques. A practical approach to Tumor Diagnosis (30). ( ) P04083SE_01_SK / s. 37/40

38 Magcancer Referenser 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985; 229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptorrelated protein. Nature 1986; 319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990; 45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990; 5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990; 2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an antip185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185her2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989; 9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185her2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993; 37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998; 58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003 b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, Dako California Inc., Data on file 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fourth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996; 4: Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989; 92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986 ( ) P04083SE_01_SK / s. 38/40

39 Magcancer 31. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78: Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastroesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 38. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 39. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04083SE_01_SK / s. 39/40

40 Magcancer Symbolförklaringar Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod Hanteras varsamt In vitro diagnostisk medicinsk apparat Förvaras i mörker Använd fore Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Läs bruksanvisningen Innehäller tillräckligt för <n> tester Tillverkare Tillverkad av: Distribuerad i USA av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/ , Avgiftsfritt: 800/ Orderinformation: Tel. 800/ Fax Teknisk Service: Tel. 800/ ( ) P04083SE_01_SK / s. 40/40