Metoder för detektion av norovirus i vatten

Transkript

1

2 Metoder för detektion av norovirus i vatten En sammanställning av genomförda projekt Elisabeth Hallin

3 Innehåll Bakgrund Syfte Informationsinhämtning Metoder och Resultat Slutsatser Sid

4 Bakgrund Norovirus är en vanlig orsak till gastroenterit världen över. Norovirus kan spridas via kontaminerat vatten. Finns olika genogrupper, svårt att odla. Norovirus, elektronmikroskop. Foto: Kjell-Olof Hedlund Flera vattenburna utbrott har konstaterats i Sverige där samma sekvens av norovirus har påvisats i vatten och patientprover. Flera forskargrupper håller på att utveckla metoder för att påvisa norovirus i vatten. Svenskt Vatten kontaktade Folkhälsomyndigheten med förslag om sammanställning av resulaten från olika projekt. Sid

5 Syfte Syftet med projektet är att sammanställa befintlig kunskap inom virus i vatten-området. Var står vi nu, vilken kunskap har vi och vilka kunskapsluckor finns? Projektresultat leder till bättre samordning inom området och att resurserna nyttjas effektivare. En typ av filtreringsutrustning. Sid

6 Informationsinhämtning Litteratursökning med hjälp av informationsspecialist på Folkhälsomyndigheten Genomgång av befintliga projektrapporter Genomgång av relevanta publikationer från Svenskt Vattens rapportdatabas. Inbjudan till aktörer inom virus i vatten-området att inkomma med egna eller förslag på andra gruppers arbete inom området Sid

7 Inkluderade projekt (avslutade) FOOD-VIRUS Reducing the risk from foodborne viruses in the Nordic countries, NORVID Humanpatogena virus i Svenska vattentäkter, VISK Virus i vatten Skandinavisk kunskapsbank, Viroclime Impact of climate change on the transport, fate and risk management of viral pathogens in water, Sid

8 Andra publikationer (urval) Schultz et al. 2011, Collaborative validation of a rapid method for efficient virus concentration in bottled water. International journal of food microbiology. Maunula et al. 2012, Presence of human noro- and adenoviruses in river and treated wastewater, a longitudinal study and method comparison. Journal of water and health. Grøndahl-Rosado et al. 2014, A One Year Study on the Concentrations of Norovirus and Enteric Adenoviruses in Wastewater and A Surface Drinking Water Source in Norway. Food and environmental virology. Petterson et al. 2015, Variability in the recovery of a virus concentration procedure in water: Implications for QMRA. Water research. Sid

9 NORVID Förfiltrering Flockulering Viruskoncentrering Eluering Sekundär koncentrering Nucleinsyraextraktion RT-PCR Realtids-PCR Glasfiberfilter MgCl 2 Hydrofilt filter Basisk triton-xlösning Neutralisera ph Ultrafiltrering QIAamp Viral RNA kit Illustra ready to go reverse transcriptase bead LUX Sid

10 Förfiltrering NORVID Glasfiberfilter Grøndahl-Rosado et al Flockulering Viruskoncentrering Eluering Sekundär koncentrering Nucleinsyraextraktion RT-PCR Realtids-PCR MgCl 2 Hydrofilt filter Basisk triton-xlösning Neutralisera ph Ultrafiltrering QIAamp Viral RNA kit Illustra ready to go reverse transcriptase bead LUX NanoCeram Basisk triton-xlösning PEG NucliSense easymag Norovirus: Superscript III TaqMan Sid

11 Förfiltrering/ Förbehandling NORVID Glasfiberfilter Grøndahl-Rosado et al Viroclime Justering av ph och konduktivitet Flockulering MgCl 2 Torrmjölk Viruskoncentrering Eluering Hydrofilt filter Basisk triton-xlösning NanoCeram Basisk triton-xlösning Omrörning Sedimentering Sekundär koncentrering Neutralisera ph Ultrafiltrering PEG Viruskonc. Resusep. Flocklarna centrifugeras Nucleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA kit NucliSense easymag QIAamp Viral RNA kit RT-PCR Realtids-PCR Illustra ready to go reverse transcriptase bead LUX Norovirus: Superscript III TaqMan Realtids- RT-PCR Ultrasense onestep Quantitative RT-PCR kit Sid

12 Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Sid

13 Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Sid

14 Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Norovirus påvisades i alla fyra provplatserna, framförallt under novfeb. Norovirus GII påvisades oftare och i högre halter än norovirus GI. Sid

15 Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Norovirus påvisades i alla fyra provplatserna, framförallt under novfeb. Norovirus GII påvisades oftare och i högre halter än norovirus GI. Har inte räknat upp resultat för processförlusten, osäkert hur många genom som är viabla och infektiösa. Sid

16 Resultat NORVID Spikade prover med humant norovirus vid utveckling av metoden. Utbytet varierade mellan 7-13 % för norovirus GI och 9-22 % för GII. Årslång provtagning genomfördes på 4 platser (Ringsjön, 2 platser i Mälaren, Göta Älv). Murint norovirus används som kontroll. Norovirus påvisades i alla fyra provplatserna, framförallt under novfeb. Norovirus GII påvisades oftare och i högre halter än norovirus GI. Har inte räknat upp resultat för processförlusten, osäkert hur många genom som är viabla och infektiösa. Modell med fiktivt vattenverk visar på låg risk för norovirusspridning till konsumenter vid beräkningar med MBA och MRA. Sid

17 Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Sid

18 Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Låg korrelation mellan utbytet för mengovirus och norovirus. Sid

19 Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Låg korrelation mellan utbytet för mengovirus och norovirus Under en ettårsstudie med prover från Glomma påvisades norovirus GI i 62 % och GII i 46 % av alla prover. Sid

20 Resultat Grøndahl-Rosado et al. 2014/ Petterson et al Utbytet var mindre än 2 % för mengovirus och mindre än 1 % för norovirus och adenovirus. Låg korrelation mellan utbytet för mengovirus och norovirus Under en ettårsstudie med prover från Glomma påvisades norovirus GI i 62 % och GII i 46 % av alla prover. Data från studien användes för att QMRA-beräkningar för två vattenverk (Överby och Nedre Romerike). Båda visade på god avskiljningsförmåga under normala förhållanden. Sid

21 Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Sid

22 Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Utbyte varierade med virus: 49 % för adenovirus, 8 % för norovirus GII Sid

23 Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Utbyte varierade med virus: 49 % för adenovirus, 8 % för norovirus GII Tillsats av saltvatten sänkte Cq med 1-2 cykler Sid

24 Viroclime Adenovirus 35 användes som processkontroll Utbyte varierade med virus: 49 % för adenovirus, 8 % för norovirus GII Tillsats av saltvatten sänkte Cq med 1-2 cykler Matrisen verkar påverka RT steget då man såg hämning av RNA virus men inte DNA virus. Sid

25 Maunula et al Ettårsstudie Förfiltrering /Förbehandling Köttglycinbuffert Viruskoncentrering Eluering /resuspendering Waterra Negativt filter Millipore AVL-buffert Nukleinsyraextraktion Realtids-RT-PCR QIAamp Viral RNA kit Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Adenovirus: in-house realtids-rt-pcr Sid

26 Maunula et al Ettårsstudie Metodjämförelse Förfiltrering /Förbehandling Waterra Waterra ph justering 3.5 Köttglycinbuffert - 80 C fryst prov Viruskoncentrering Negativt filter Millipore Negativt filter Millipore Glasull Frystorkning Eluering /resuspendering Nukleinsyraextraktion Realtids-RT-PCR AVL-buffert NucliSense lysisbuffert + dest. vatten Köttglycinbuffert Köttglycinbuffert Syraprecipitering centrifug. PBS QIAamp Viral RNA kit NucliSense NucliSense NucliSense Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Adenovirus: in-house realtids-rt-pcr Sid

27 Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, norovirus framförallt under vintermånaderna (dec-april). Sid

28 Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, 1 gång/månad 5 provplatser under ett år. Norovirus framförallt under vintermånaderna (decapril). Norovirus GII påvisades signifikant oftare än norovoris GI. Totalt påvisades norovirus i 30 % av proverna. Sid

29 Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, 1 gång/månad 5 provplatser under ett år. Norovirus framförallt under vintermånaderna (decapril). Norovirus GII påvisades signifikant oftare än norovoris GI. Totalt påvisades norovirus i 30 % av proverna. Jämförelsestudie genomfördes senare då man tog prover under februari, mars och maj vid 4 olika punkter. Sid

30 Maunula et al 2012 Ettårsstudie: prov från Vantaa river, 1 gång/månad 5 provplatser under ett år. Norovirus framförallt under vintermånaderna (decapril). Norovirus GII påvisades signifikant oftare än norovoris GI. Totalt påvisades norovirus i 30 % av proverna. Jämförelsestudie genomfördes senare då man tog prover under februari, mars och maj vid 4 olika punkter. Under tremåndersstudien påvisades inte norovirus i något prov. Adenovirus påvisades i 11 av 12 prover. Glasullmetoden påvisade adenovius oftast. Sid

31 Schultz et al Viruskoncentrering D Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Kött-glycin buffert ph 9.5 ph justering Sekundär koncentrering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid

32 Schultz et al Viruskoncentrering A D Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert Kött-glycin buffert ph 9.5 Sekundär koncentrering CIM QA monolitisk kolonn, anjonutbyte Ultracentrifugering ph justering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid

33 Schultz et al Viruskoncentrering A B D CIM QA monolitisk kolonn, anjonutbyte Positivt filter Zetapor Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert NucliSense easymag lysisbuffert Kött-glycin buffert ph 9.5 ph justering Sekundär koncentrering Ultracentrifugering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense easymag alt minimag NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid

34 Schultz et al Viruskoncentrering A B C D CIM QA monolitisk kolonn, anjonutbyte Positivt filter Zetapor Positivt filter Sartorius Positivt filter Zetapor Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert NucliSense easymag lysisbuffert Kött-glycin buffert ph 9.5 Kött-glycin buffert ph 9.5 ph justering Sekundär koncentrering Ultracentrifugering Ultracentrifugering Ultrafiltrering Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense easymag alt minimag QIAamp Viral RNA Mini kit NucliSense minimag Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr Sid

35 Schultz et al Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Sid

36 Schultz et al Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Metod B (positivt filter med easymag/minimag) hade signifikant lägre Ct för både felint calicivirus och hepatit A virus relativt till metod D jämfört med de andra metoderna. Sid

37 Schultz et al Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Metod B (positivt filter med easymag/minimag) hade signifikant lägre Ct för både felint calicivirus och hepatit A virus relativt till metod D jämfört med de andra metoderna. Metod B utvärderas vidare i en samarbetsstudie mellan olika laboratorier. Flaskvatten spikades med felint calicivirus, hepatit A virus, norovorius GI och norovorus GII. Sid

38 Schultz et al Vid utvärderingen av metoder användes felint calicivirus och hepatit A virus som processkontroll. Metod B (positivt filter med easymag/minimag) hade signifikant lägre Ct för både felint calicivirus och hepatit A virus relativt till metod D jämfört med de andra metoderna. Metod B utvärderas vidare i en samarbetsstudie mellan olika laboratorier. Flaskvatten spikades med felint calicivirus, hepatit A virus, norovorius GI och norovorus GII. Utbytet vid samarbetsstudien var i medelprocent 61 % för norovirus GI, 35 % för norovirus GII, 34 % för felint calicivirus och 51 % för hepatit A virus, men det var stor variation i utbyte mellan labben för samma virus. Sid

39 Slutsats Olika metoder varierar i Metodologin Förfiltrering/förbehandling (ingen, waterra, glasfiberfilter, ph, konduktivitet) Adsorption (negativa filter, postiva filter, glasull, flockulering, frystorkning) Elueringsmetod/lösning (AVL-buffert, kött-glycin, NucliSense lysisbuffert, fosfatbuffert, triton-x-lösning) Sekundär koncentrering (ingen, ultrafiltrering, PEG, ultracentrifugering) Nukleinsyraextraktion (QIAamp, NucliSense) Separat RT och realtids-pcr eller one-step Vilka virus som används som processkontroll Mengovirus, felint calicivirus, murint norovirus, hepatit A virus, adenovirus Om man anger utbyte och/eller koncentration Anger koncentration i genomkopior/l eller PCR units/l, utbyte i procent Sid

40 Slutsats I stort sett alla drar slutsatsen att det finns norovirus i ytvatten under framförallt de kalla månaderna. Det finns stora processförluster inom metoderna. Hämning sker i PCR-stegen. Vattenkvalitén verkar påverkar utbytet. Sid

41 Slutsats I stort sett alla drar slutsatsen att det finns norovirus i ytvatten under framförallt de kalla månaderna. Det finns stora processförluster inom metoderna. Hämning sker i PCR-stegen. Vattenkvalitén verkar påverkar utbytet. Gemensam syn på kontroller och utvärdering av metoderna! Sid

42

43 Mål Målet med projektet är att sammanställa vilken kunskap som finns i framförallt Sverige, men även i övriga Norden, om: Vilka metoder som används i Norden för analys av virus i vatten, samt vilka styrkor och svagheter dessa har Hur resultaten av analyserna tolkas Hur projekten har använt sina resultat i MRA/GDP beräkningar Vilka virushalter som har studerats och vilka halter som har uppmätts i olika typer av vatten Befintlig kunskap om olika barriärers effekt på virus i vatten Vad betydelsen för folkhälsan är Vilka kunskapsluckor som finns Sid

44 Förfiltrering/ Förbehandling Norvid Glasfiberfilter 4,5 l Grøndahl-Rosado et al Viroclime Justering av ph och konduktivitet 10 l Flocculering MgCl 2 4,5 l Torrmjölk 100 ml till 10 l vatten Viruskoncentrering Hydrofilt filter 4 l NanoCeram 5 l Omrörning 8-10 timmar Eluering Basisk triton-x-lösning 15 ml Neutralisera ph Basisk triton-x-lösning Eluering med 40 ml Sedimentering 8-10 timmar Sekundär koncentrering Ultrafiltrering, 50 kda 15 ml till 200 µl PEG Resuspenderas i 3 ml NucliSense lysis buffer Viruskonc. Resusep. Flocclarna centrifugeras Pellet löses i 10 ml PBS Nucleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA kit 60 µl NucliSense easymag 3 ml används, ger 25 µl QIAamp Viral RNA kit RT-PCR Illustra reday to go reverse transcriptase bead 8 µl används, ger 30 µl cdna Norovirus: Superscript III 11 µl RNA ger 20 µl cdna Realtids- RT-PCR Ultrasense one-step Quantitative RT-PCR kit Realtids-PCR LUX 2 µl cdna används TaqMan 2 µl cdna används Sid

45 Schultz et al Viruskoncentrering CIM QA monolitisk kolonn, anjon-utbyte 1,5 l Positivt filter Zetapor 1,5 l Positivt filter Sartorius 1,5 l Positivt filter Zetapor 1,5 l Eluering/ resuspendering Fosfatbuffert 15 ml NucliSense easymag lysisbuffert 3 ml Kött-glycin buffert ph ml Kött-glycin buffert ph ml ph justering 8,0 Sekundär koncentrering Ultracentrifugering Pellet resuspenderas i 560 µl AVL buffert Ultracentrifugering Pellet resuspenderas i 100 µl PBS buffert Ultrafiltrering 500 µl Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA Mini kit 100 µl NucliSense easymag alt minimag 100 µl QIAamp Viral RNA Mini kit 100 µl NucliSense minimag 100 µl Realtids-PCR Norovirus: RNA Ultrasense One-step qrt-pcr (Invitrogen) 5 ul RNA används Sid

46 Maunula et al bild 2 från pek. Ettårsstudie Metodjämförelse Förfiltrering /Förbehandling Waterra 3 l Waterra 3 l ph justering C fryst prov Kött-glycinbuffert 50 ml Kött-glycinbuffert 50 ml Viruskoncentrering Negativt filter HA 3 l Negativt filter HA 3 l Glasull 3 l Frystorkning ml Eluering /resuspendering AVL-buffert 1 ml NucliSense lysisbuffert + dest. vatten Totat 3,5 ml Kött-glycinbuffert Elueras till 50 ml Syraprecipitering, centrifugering Löses i 8 ml PBS PBS Prov löses i 1 ml Nukleinsyraextraktion QIAamp Viral RNA kit 60 µl NucliSense 3,5 ml extraheras NucliSense 1 ml extraheras NucliSense 1 ml extraheras Realtids-RT-PCR Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Norovirus: QuantiTect Probe realtids-rt-pcr Adenovirus: in-house realtids-rt-pcr Sid

47 Avgränsning Rapporten är inte en handlingsplan utan en kunskapssammanställning. Sammanställningen kommer inte rapportera om förhållanden utanför Norden, om inte dessa anses vara av särskilt intresse. Sid