HE4 EIA REF IVD FOR INFORMATION ONLY. WHEN PERFORMING THE ASSAY ALWAYS REFER TO PACKAGE INSERT SUPPLIED WITH THE KIT. Bruksanvisning.

Transkript

1 FOR INFORMATION ONLY. WHEN PERFORMING THE ASSAY ALWAYS REFER TO PACKAGE INSERT SUPPLIED WITH THE KIT IVD HE4 EIA REF SE Bruksanvisning DE Wenden Sie sich bitten an die deutsche Niederlassung um die geltende Gebrauch s anweisung zu erhalten. DK Kontakt venligst den danske distributør for gældende version af dansk brugsanvisning. ES FR Por favor contacte con su distribuidor para una versión válida de Instrucciones de uso en español Pour une version certifiée de la Notice en Français, veuillez contacter votre Distributeur. GR Παρακαλούµε όπως επικοινωνήσετε µε τον IT προµηθευτή σας για την έγκυρη απόδοση στα Ελληνικά των οδηγιων χρήσης Contattare il proprio Distributore per ottenere la versione ufficiale della traduzione in lingua Italiana delle Istruzioni per l Uso SE Vänligen kontakta Er distributör för gällande version av bruksanvisning på svenska. GB EXPLANATION OF SYMBOLS CS vysvětlení symbolů DE BEDEUTUNG DER SYMBOLE DK SYMBOLFORKLARING ES EXPLICACIÓN DE SÍMBOLOS FR EXPLICATION DES SYMBOLES GR ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΒΟΛΩΝ HU JELMAGYARÁZAT IT SIGNIFICATO DEI SIMBOLI NL PICTOGRAMMEN LT SIMBOLIŲ PAAIŠKINIMAI PL INTERPRETACJA SYMBOLI PT INTERPRETAÇÃO DE SÍMBOLOS RU ОБОНАЧЕНИЯ SE SYMBOLFÖRKLARING Use By/Použitelné do/ Verwendbar bis/holdbar til/ Fecha de caducidad/ Utiliser jusque/ημερομηνία λήξης/ Felhasználható/Utilizzare entro/ Houdbaar tot/sunaudoti iki/ Użyć przed/prazo de validade/ Использовать до/bäst före datum Batch code/číslo šarže/ Chargenbezeichnung/ Lotnummer/Codigo de lote/ Code du lot/αριθμός Παρτίδας/ Sarzsszám/Codice del lotto/ Lot nummer/partijos kodas/ Kod partii/código do lote/ Номер лота/lotnummer 1

2 REF Date of manufacture/ Datum výroby/herstellungsdatum/ Produktionsdato/ Fecha de fabricación/ Date de fabrication/ Ημερομηνία Παραγωγής/ Gyártás időpontja/ Data di fabbricazione/produktie datum Pagaminimo data/data produkcji Data de fabrico/дата производства/ Tillverkningsdatum Catalogue number/katalogové číslo/ Bestellnummer/Katalognummer/ Número de catálogo/ Référence du catalogue/ Αριθμός καταλόγου/ Katalógusszám/Numero di catalogo/ Catalogus nummer/katalogo numeris/ Numer katalogowy/ Referência de catálogo/ Номер по каталогу/produktnummer Manufacturer/Výrobce/Hersteller/ Producent/Fabricante/Fabricant/ Kτασκευαστής/Gyártó/Fabbricante/ Fabrikant/Gamintojas/Producent/ Fabricante/Производитель/ Tillverkare Contains sufficient for <96> tests/ Lze použit pro <96> testů/ Inhalt ausreichend für <96> Prüfungen/ Indeholder tilsttrækkeligt til 96 test/ Contenido suficiente para <96> ensayos/contenu suffisant pour 96 tests/περιεχόμενο επαρκές για «96» εξετάσεις/a doboz tartalma <96> vizsgálat elvégzéséhez elegendő/ Contenuto sufficiente per 96 saggi/ Inhoud voldoende voor 96 testen/ Turinys skirtas atlikti <96> tyrimus/ Wystarczy na wykonanie <96> testów/ Conteúdo suficiente para 96 ensaios/ Содержит достаточные количества для «96» определений/innehåller tillräckligt till 96 antal tester 2 o C IVD 8 o C In Vitro Diagnostic Medical Device/ In Vitro diagnostický zdravotnický prostředek/in Vitro Diagnostikum Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik/ Dispositivo medico-diagnostico in vitro/ Dispositif médical de diagnostic in vitro/ In Vitro Διαγνωστικό Ιατροτεχνολογικό προϊόν/in vitro diagnosztikum/ Dispositivo medico-diagnostico/ in vitro Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek/in Vitro Diagnostinė Medicinos Priemonė/Wyrób do diagnistyki In Vitro/Dispositivo médico para diagnóstico in vitro/ Только для диагностики/in Vitro Endast för in vitro-diagnostik Temperature limitation/ Teplotní rozmezí od do/ Temperaturbegrenzung/ Temperaturbegrænsning/ Límite de temperatura/ Limites de température/ Περιορισμοί θερμοκρασίας/ Hőmérséklettartomány/ Limiti di temperatura/ Temperatuurlimiet/ Temperatūriniai apribojimai/ Przestrzegać zakresu temperatury/ Limites de temperatura/ Температурный режим/ Temperaturbegränsning Consult Instructions for Use/ Viz návod k použití/ Gebrauchsanweisung beachten/ Se brugsanvisning/ Consulte las instrucciones de uso/ Consulter les instructions d utilisation/ Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης/ Nézze meg a Használati utasítást/ Consultare le istruzioni per l uso/ Raadpleeg de gebruiksaanwijzing/ Dėl naudojimo žiūrėkite instrukcijas/ Sprawdź w instrukcji obsługi/ Consulte as instruções de utilização/ Обратитесь к инструкции по применению/ Se bruksanvisning 2

3 CONT Biological risks/biologicky nebezpečné/biogefährdung/ Biologisk fare/riesgo biológico/risques biologiques/βιολογικοί κίνδυνοι/ Biológiai kockázat/rischio biologico/ Biologisch risico/biologinis pavojus/ Ryzyko biologiczne/risco biológico/ Биологическая опасность/ Biologisk risk Contents of kit/obsah soupravy/ Inhalt/Kittets indhold/contenido del kit/contenu du kit/περιεχόμενα του κιτ/a készlet tartalma/contenuto del kit/inhoud van de set/rinkinio turinys/ Zawartość zestawu/conteúdo do kit/ Компоненты набора/kitinnehål ORIG MOU ORIG HUM From mouse/myší/maus/maus/de ratón/de souris/απο ποντίκι/egérből Murino/Van muizen/pelės kilmės/ Mysia/Do rato/мышиного происхождения/från mus Human/Lidské/Human/Humant/ Humano/Humaine/δείγματα αναφοράς/humán/origine Umana/ Human/Žmogaus kilmės/cilvēku izcelsmes/human/человеческого происхождения/human 3

4 4

5 HE4 EIA SE Bruksanvisning Enzymimmunanalyskit För 96 bestämningar AVSEDD ANVÄNDNING HE4 EIA är en enzymimmunometrisk analys för kvantitativ bestämning av HE4 i humant serum. Analysen är avsedd att användas som hjälpmedel vid övervakning av behandlingssvar hos patienter med invasiv äggstocksepitelcancer. Seriell testning av patientens HE4-analysvärde ska användas tillsammans med andra kliniska metoder för övervakning av äggstockscancer. Den är vidare avsedd att användas tillsammans med antingen ARCHITECT CA 125 II eller CanAg CA125 EIA som ett hjälpmedel för att bedöma risken för äggstocksepitelcancer hos premenopausala och postmenopausala kvinnor med bäckenresistens. Resultaten måste tolkas tillsammans med andra metoder enligt gällande kliniska riktlinjer. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV ANALYSEN Humant epididymisprotein 4 (HE4) tillhör familjen "whey acidic four-disulfide core" (WFDC)-proteiner med misstänkta trypsinhämmande egenskaper. Andra proteiner i denna familj är SLPI, elafin och PS20 (WFDC1) (1, 2). HE4-genen kodar för ett 13 kd-protein som i sin mogna glykosylerade form är cirka kd och består av en enkel peptid med två WFDC-domäner (3). HE4 identifierades först i epitel från distal epididymis och ansågs ursprungligen vara en proteashämmare inblandad i spermiemognad (4, 5). HE4 har sedan dess rapporterats vara uttryckt i ett flertal normala vävnader, inklusive epitel i respiratoriska och reproduktiva vävnader samt även i äggstockscancervävnad (6 10). Utöver uttryck på cellulär nivå har höga nivåer av utsöndrat HE4 detekterats i serum från patienter med äggstockscancer. I en fall-/kontrollstudie som jämförde patienter med äggstockscancer med friska och benigna tillstånd fann Hellström et al. att HE4 detekterade äggstockscancer med en sensitivitet på 67 % vid en specificitetsnivå på 96 % (11). I en efterföljande studie som utvärderade olika kända biomarkörer för äggstockscancer visade HE4 den högsta sensitiviteten för detektion av äggstockscancer, särskilt sjukdom i ett tidigt stadium. I denna studie kunde kombinationen av HE4 och CA 125 förutsäga malignitet bättre än endera markör ensam med en sensitivitet på 76 % och en specificitet på 95 % (12). 5

6 Äggstockscancer är den fjärde vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken bland världens kvinnor. I Europa ligger mortaliteten på mellan 3,6 och 9,3 per kvinnor (13). Symptom på äggstockscancer är relaterade till förekomst av adnexal resistens och är ofta vaga och ospecifika. Det primära målet vid diagnostisk utvärdering vid adnexal resistens är att avgöra om resistensen är benign eller malign. Man har beräknat att 5 till 10 % av kvinnor i USA under sin livstid kommer att genomgå ett kirurgiskt ingrepp baserat på misstänkt äggstocksneoplasm och mellan 13 och 21 % av dessa kvinnor kommer att uppvisa en äggstocksmalignitet (14). American College of Obstetricians and Gynecologists Practice Bulletin som publicerades 2007 anger följande "Kvinnor med äggstockscancer vars vård hanteras av läkare med avancerad utbildning och expertis gällande behandling av kvinnor med äggstockscancer, t.ex. gynekologonkologer, har förbättrad total överlevnad jämfört med de som behandlas utan sådant samarbete" (15). Eftersom flertalet adnexala resistensfall är benigna är det viktigt att preoperativt bestämma om en patient har hög risk för äggstocksmalignitet för att därmed säkerställa rätt vård (15). Sedan den första rapporten 1988 har klinisk bedömning, CA125 i serum, ultraljud, datortomografi, MRT och CT/PET varit standarder vid bestämning av eventuell malignitet vid adnexal resistens (16). Medan det i den vetenskapliga litteraturen finns åtskilliga artiklar som beskriver vilken metod som ger säkrast svar ger en kombination av klinisk undersökning, CA125 och radiologi det högsta positiva förutsägande värdet (17 19). För att förbättra prioriteringen av patienter med bäckenresistens kan HE4 EIA användas tillsammans med antingen ARCHITECT CA 125 II eller CanAg CA125 EIA som ett hjälpmedel för att uppskatta risken att en patient bär på äggstocksepitelcancer. Resultaten måste tolkas tillsammans med andra metoder enligt gällande kliniska riktlinjer. Ett ytterligare användningsområde för HE4 EIA är som hjälpmedel vid övervakning av behandlingssvar hos patienter med invasiv äggstocksepitelcancer. Resultaten ska användas tillsammans med andra kliniska metoder för övervakning av äggstockscancer. TESTPRINCIP HE4 EIA är en icke-kompetitiv, fast fas-baserad immunanalys baserad på den direkta "sandwich"-tekniken med två monoklonala musantikroppar, 2H5 och 3D8, riktade mot två epitoper i C-WFDC-domänen i HE4. Kalibratorer, kontroller och patientprover inkuberas tillsammans med en biotinylerad monoklonal anti-he4-antikropp (MAb) 2H5 i streptavidin-belagda mikrostrips. HE4 som förekommer i kalibratorer eller prover adsorberas till streptavidin-belagda mikrostrips genom biotinylerad anti-he4 MAb under inkubationen. Stripsen tvättas sedan och inkuberas med HRP-märkt anti-he4 MAb 3D8. Efter tvätt tillsätts buffrat substrat-/kromogenreagens (väteperoxid och 3, 3, 5, 5 -tetrametylbensidin) till varje brunn och enzymreaktionen tillåts fortgå. Under enzymreaktionen utvecklas blå färg om antigen förekommer. Färgintensiteten är proportionell mot mängden HE4 i proverna. 6

7 Färgintensiteten bestäms i en mikroplattläsare vid 620 nm (eller alternativt vid 405 nm efter tillsats av stopplösning). Kalibreringskurvor konstrueras för varje analys genom att plotta absorbansvärdet mot koncentrationen för respektive kalibrator. HE4-koncentrationerna för patientproverna avläses sedan från kalibreringskurvan. REAGENSER Varje HE4 EIA-kit innehåller reagenser för 96 tester. Kitets utgångsdatum är angivet på etiketten på kitets låda. Använd inte kitet efter angivet utgångsdatum. Blanda inte reagenser från kit med olika lotnummer. Förvara kitet vid 2 8 C. Frys inte. Öppnade reagenser är stabila enligt tabellen nedan förutsatt att de inte kontaminerats och att de förvaras i återförslutna originalbehållare samt hanteras enligt anvisning. Förvara kitet vid 2 8 C omedelbart efter användning. Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter första användning MICROPLA Streptavidinmikroplatta 1 platta 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på plattan 12 x 8 avbrytbara streptavidin-belagda brunnar. Omedelbart efter användning placeras oanvända strips tillsammans med torkmedlet i foliepåsen. Foliepåsen ska återförslutas noga för att hålla brunnarna torra. CAL HE4 A HE4-kalibrator A 1 x 8 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Fosfatbuffrad saltlösning innehållande bovint serumalbumin, ett inert gult färgämne och ett antimikrobiellt icke azid-innehållande konserveringsmedel. Bruksfärdig. Används även för att späda prover. 7

8 Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter första användning HE4-kalibratorer B F 5 flaskor, Hållbarhet efter rekonstituering frystorkade 4 veckor vid 2 8 C 4 månader vid -20 C eller lägre CAL HE4 B 1 x 1 ml CAL HE4 C 1 x 1 ml CAL HE4 D 1 x 1 ml CAL HE4 E 1 x 1 ml CAL HE4 F 1 x 1 ml De frystorkade kalibratorerna innehåller HE4-antigen i en fosfatbuffrad saltlösning innehållande bovint serumalbumin, ett inert gult färgämne och ett antimikrobiellt icke azid-innehållande konserveringsmedel. Ska rekonstitueras med destillerat eller avjoniserat vatten före användning. OBS! Den exakta HE4-koncentrationen är lotnummerspecifik och anges på respektive flaskas etikett. HE4-kontroller 2 flaskor, Hållbarhet efter rekonstituering frystorkade 4 veckor vid 2 8 C 4 månader vid -20 C eller lägre CONTROL HE4 1 1 x 1 ml CONTROL HE4 2 1 x 1 ml De frystorkade kontrollerna innehåller HE4-antigen i en human serummatris och ett antimikrobiellt icke azid-innehållande konserveringsmedel. Ska rekonstitueras med destillerat eller avjoniserat vatten före användning. 8

9 Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter första användning BIOTIN Anti-HE4 Biotin anti-he4 1 x 15 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Monoklonal biotin anti-he4-musantikropp, cirka 1 µg/ml. Innehåller fosfatbuffrad saltlösning (ph 7,2), bovint serumalbumin, blockerande medel, detergent, ett inert rött färgämne och ett antimikrobiellt icke azid-innehållande konserveringsmedel. Bruksfärdig. CONJ Anti-HE4 Konjugat, HRP anti-he4 1 x 0,75 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Stamlösning av monoklonal HRP anti-he4-musantikropp, cirka 40 µg/ml. Innehåller ett antimikrobiellt icke azid-innehållande konserveringsmedel. Ska spädas med konjugat diluent före användning. DIL CONJ Konjugat diluent 1 x 15 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Innehåller fosfatbuffrad saltlösning (ph 7,2) med bovint serumalbumin, blockerande medel, detergent, ett inert blått färgämne och ett antimikrobiellt icke azid-innehållande konserveringsmedel Bruksfärdigt. SUBS TMB TMB HRP-substrat 1 x 12 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Innehåller buffrad väteperoxid och 3,3,5,5 -tetrametylbensidin (TMB). Bruksfärdigt. 9

10 Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter första användning STOP Stopplösning 1 x 15 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Innehåller 0,12 M saltsyra. Bruksfärdig. WASHBUF 25X Tvättkoncentrat 1 x 50 ml 2 8 C fram till utgångsdatum angivet på flaskan Tris-HCl-buffrad saltlösning med Tween 20. Innehåller Germall II som konserveringsmedel. Ska spädas med destillerat eller avjoniserat vatten 25 gånger före användning. Tecken på instabilitet TMB HRP-substratet ska vara färglöst eller svagt blåaktigt. Blåfärgning indikerar att reagenset har kontaminerats och ska kasseras. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER För in vitro-diagnostik. Varning Följ instruktionerna i bruksanvisningen. Analysresultatens tillförlitlighet kan inte garanteras om man avvikit från instruktionerna i denna bruksanvisning. Hantera alla patientprover som potentiellt smittsamma. Det rekommenderas att reagenser och prover av humant ursprung hanteras i enlighet med OSHA:s standard om blodburna patogener (20). Biosäkerhetsnivå 2 (21) eller andra lämpliga biosäkerhetsmetoder ska tillämpas för material som innehåller eller misstänks innehålla smittsamma ämnen. Följ lokala riktlinjer för avfallshantering. Material som används för beredning av reagens av humant ursprung har testats och befunnits vara negativa för HIV 1- och 2-antikropp, HCV-antikropp och hepatit B-ytantigen (HBsAg). Eftersom ingen metod fullständigt kan utesluta förekomst av blodburna sjukdomar ska hantering och kassering av reagenser av humant ursprung från denna produkt ske som om de var potentiellt smittsamma. 10

11 PROVTAGNING OCH PROVHANTERING HE4 EIA är avsedd att användas med serum (inklusive serum taget i serumseparationsrör (SST)). Plasma och andra kroppsvätskor har inte validerats för användning med HE4 EIA. Samla blod genom venpunktion och följ anvisningarna från rörtillverkaren för provrör. När serieprover ska utvärderas ska samma provtyp användas i hela studien. Serum kan förvaras vid 2 8 C i 3 dagar före testet. Under längre perioder ska prover förvaras vid -40 C eller lägre. Låt frysta prover tina till rumstemperatur och blanda NOGA genom att försiktigt vända röret upp och ned flera gånger före analys. Prover som innehåller grova partiklar ska centrifugeras vid x g i 10 minuter före användning för att eliminera partiklar som kan ha utvecklats vid upptiningsprocessen. FÖRFARANDE Nödvändigt material som inte medföljer kitet 1. Mikroplattskak Skakfrekvensen ska vara måttlig till kraftig med cirka oscillationer/ minut. 2. Mikroplattvätt Automatisk plattvätt med kapacitet för 1, 3 och 6 tvättcykler och med en fyllningsvolym på minst 350 µl/brunn/tvättcykel. En 8-kanalspipett med engångsspetsar av plast för 350 µl rekommenderas om en automatisk mikroplattvätt inte används. 3. Mikroplattspektrofotometer Läsare med en våglängd på 620 nm och/eller 405 nm samt ett absorbansintervall på 0 till 3,0. 4. Precisionspipetter Med engångsspetsar av plast för dispensering av mikrolitervolymer. En 8-kanalspipett eller repeterpipett med engångsspetsar av plast för 100 µl rekommenderas men krävs inte. Pipetter för dispensering av millilitervolymer. 5. Destillerat eller avjoniserat vatten För rekonstituering av HE4-kalibratorer, HE4-kontroller och för beredning av spädd tvättlösning. 11

12 Anmärkningar om förfarandet 1. En utförlig förståelse av denna bruksanvisning krävs för att säkerställa korrekt användning av HE4 EIA-kitet. Reagenserna som medföljer kitet är avsedda att användas som en integrerad enhet. Blanda inte identiska reagenser från kit med olika lotnummer. Använd inte kitreagenserna efter utgångsdatum angivet på etiketten på förpackningen. 2. Reagenserna ska anta rumstemperatur (20 25 C) före användning. Frysta prover måste blandas försiktigt men noga efter upptining. Analysen ska endast utföras vid temperaturer mellan 20 och 25 C för att erhålla tillförlitliga resultat. 3. Det rekommenderas att man märker stripsen innan man börjar pipettera kalibratorer och patientprover för att tydligt kunna identifiera proverna under och efter analysen. 4. Kravet på effektiv och grundlig tvätt för separation av bundna och obundna antigen och reagenser från de i fast fas bundna antikropp-antigenkomplexen är ett av de viktigaste stegen i en EIA. För att säkerställa effektiv tvätt ska man se till att alla brunnar är helt fyllda till den övre kanten med tvättlösning under varje tvättcykel, att tvättlösningen dispenseras med bra flödeshastighet, att aspirationen av brunnarna mellan och efter tvättcyklerna är fullständig samt att brunnarna är tomma. Om det finns vätska kvar ska man vända plattan upp och ned och försiktigt knacka den mot absorberande papper. - Automatisk stripstvättutrustning: Följ tillverkarens anvisningar för rengöring och underhåll ordentligt och utför det nödvändiga antalet tvättcykler före och efter varje inkubationssteg. Aspirations-/tvättutrustningen ska inte lämnas kvar med tvättlösning under långa perioder eftersom nålarna kan blockeras vilket resulterar i dålig tillförsel och aspiration av vätska. 5. TMB HRP-substratet är mycket känsligt för kontamination. För optimal hållbarhet för TMB HRP-substratet ska man hälla den nödvändiga mängden från flaskan till en noggrant rengjord behållare eller helst en engångsbehållare av plast för att undvika kontamination av reagenset. Se till att använda en ren engångspipettspets av plast (eller repeterpipettspets). 6. Se till att använda rena engångspipettspetsar av plast och en lämplig precisionspipetteringsteknik vid hantering av prover och reagenser. Låt inte pipettspetsen vidröra vätskeytan för att undvika korskontamination. En ordentlig pipetteringsteknik är särskilt viktig vid hantering av prover och TMB HRP-substratlösningen. 12

13 Beredning av reagenser Hållbarhet för berett reagens HE4-kalibratorer B F 4 veckor vid 2 8 C 4 månader vid -20 C eller lägre Tillsätt exakt 1,0 ml av destillerat eller avjoniserat vatten till varje flaska. Låt stå i minst 15 minuter för att rekonstituera och blanda försiktigt före användning. OBS! Kalibratorernas koncentration anges på etiketterna och ska användas för beräkning av resultat. HE4-kontroller 1 och 2 4 veckor vid 2 8 C 4 månader vid -20 C eller lägre Tillsätt exakt 1,0 ml av destillerat eller avjoniserat vatten till varje flaska och blanda försiktigt. Låt stå i minst 15 minuter för att rekonstituera och blanda försiktigt före användning. OBS! Kontrollernas intervall är angivna på etiketterna. Tvättlösning 2 veckor vid 2 25 C i en förseglad behållare Häll 50 ml tvättkoncentrat i en ren behållare och späd 25 gånger genom att tillsätta ml av destillerat eller avjoniserat vatten för att ge en buffrad tvättlösning. Arbetslösning konjugat 4 veckor vid 2 8 C i en förseglad behållare Bered en önskad mängd uppspätt konjugat genom att blanda 50 µl av konjugatet, HRP anti-he4, med 1 ml av konjugat diluent per strips (se tabellen nedan): 13

14 Antal Konjugat, HRP anti-he4 Konjugat diluent strips (µl) (ml) Se till att använda ett rent provrör av plast eller glas för beredning av arbets lösningen av konjugatet. Alternativt: Häll innehållet i flaskan med konjugat, HRP anti-he4, i flaskan med konjugat diluent och blanda försiktigt. Se till att hela innehållet i flaskan med konjugat, HRP anti-he4, överförs till flaskan med konjugat diluent. OBS! Arbetslösningen av konjugatet är stabil i 4 veckor vid 2 8 C. Bered inte mer arbetslösning av konjugatet än vad som ska användas inom perioden och se till att den förvaras korrekt. ANALYSFÖRFARANDE Utför varje bestämning i duplikat för både kalibratorer, kontroller och okända prover. En kalibreringskurva ska konstrueras vid varje analys. Alla reagenser och prover måste anta rumstemperatur (20 25 C) före användning. 1. Börja med att bereda kalibratorer B F, kontroller 1 och 2, tvättlösningen och arbetslösningen av konjugatet. Det är viktigt att använda rena behållare. Följ anvisningarna noga. 2. Överför nödvändigt antal mikroplattstrips till en stripsram. (Lägg omedelbart tillbaka återstående strips i aluminiumfoliepåsen med torkmedel och försegla den noga.) Tvätta varje strips en gång med tvättlösningen. Tvätta inte fler strips än vad som kan hanteras inom 30 minuter. 3. Pipettera 25 µl av varje HE4-kalibrator (KAL A, B, C, D, E och F), HE4-kontroll (K1, K2) samt okända prover (Okä) till stripsbrunnarna enligt följande schema: 14

15 etc. A Kal Kal 1:a A E Okä B Kal Kal 1:a A E Okä C Kal Kal 2:a B F Okä D Kal Kal 2:a B F Okä E Kal K1 C F Kal K1 C G Kal K2 D H Kal K2 D 4. Tillsätt 100 µl av biotin anti-he4 till varje brunn med hjälp av en 100 µl precisionspipett (eller en 100 µl 8-kanalsprecisionspipett). Låt inte pipettspetsen vidröra vätskeytan för att undvika korskontamination. 5. Inkubera plattan i 1 timme (± 10 min.) vid rumstemperatur (20 25 C) och se till att skaka plattan konstant med användning av en mikroplattskak. 6. Aspirera och tvätta varje strips 3 gånger efter den första inkubationen med användning av tvättförfarandet som beskrivs i Anmärkningar om förfarandet, punkt Tillsätt 100 µl arbetslösningen av konjugatet till varje brunn. Använd samma pipetteringsteknik som för punkt 4 ovan. 8. Inkubera stripsramen i 1 timme (± 5 min.) vid rumstemperatur (20 25 C) med konstant skakning. 9. Aspirera och tvätta varje strips 6 gånger efter den andra inkubationen med användning av tvättförfarandet som beskrivs i Anmärkningar om förfarandet, punkt Tillsätt 100 µl av TMB HRP-substrat till varje brunn med användning av samma pipetteringsteknik som för punkt 4 ovan. TMB HRP-substratet ska tillsättas brunnarna så fort som möjligt och tiden mellan tillsats till den första och sista brunnen får inte överstiga 5 minuter. 11. Inkubera stripsramen i 30 minuter (± 5 min.) vid rumstemperatur (20 25 C) med konstant skakning. Undvik exponering för direkt solljus. 12. Avläs omedelbart absorbansen vid 620 nm i en mikroplattspektrofotometer. 15

16 Alternativ Om laboratoriet inte har tillgång till en mikroplattläsare med kapacitet för avläsning vid 620 nm kan absorbansen bestämmas enligt en alternativ punkt 12 nedan: Alt. 12. Tillsätt 100 µl av stopplösning, blanda och avläs absorbansen vid 405 nm i en mikroplattspektrofotometer inom 15 minuter efter tillsats av stopplösningen. Mätintervall HE4 EIA mäter koncentrationer mellan 15 och 900 pm. Om HE4-koncentrationer förväntas ligga över mätintervallet rekommenderas att prover späds med HE4- kalibrator A före analys (se "Beräkning av resultat med spädda prover"). Kvalitetskontroll HE4-kontroll 1 och 2 ska användas för validering av varje analysserie. Intervall för förväntade resultat anges på flasketiketterna. HE4-analysresultaten ska anses giltiga om: - Medelvärdena för kontrolldubbletterna ligger inom specificerade intervall. - Dubblettreplikaten för kalibratorerna B F och kontrollerna överstiger inte en variationskoefficient på 15 %. - Dubblettreplikaten av kalibrator A (noll) skiljer sig inte mer från varandra än 0,06 absorbansenheter. Om en analys resulterar i en ogiltig kalibrator eller kontroll måste man utföra en fullständig kontroll av reagenser, pipetternas noggrannhet, prestanda för plattvätt och -läsare och analysen måste upprepas. Varje laboratorium kan även bereda egna serumpooler vid olika nivåer som kan användas som interna kontroller för att säkerställa analysens precision. Referensmaterial Eftersom inget allmänt referensmaterial finns tillgängligt för HE4-antigen tilldelas HE4 EIA-kalibratorvärden gentemot en uppsättning av interna referensstandarder. BERÄKNING AV RESULTAT Om man använder en mikroplattspektrofotometer med integrerat databeräkningsprogram, se handboken för spektrofotometern och skapa ett program med användning av koncentrationen som anges på etiketten på varje HE4-kalibrator. Det rekommenderas att man använder endera av följande metoder för automatisk beräkning av HE4-resultat: "Cubic spline"-kurvanpassningsmetod. Kalibrator A ska ingå i kurvan med värdet 0 pm. Interpolering med utvärdering punkt till punkt. Kalibrator A ska ingå i kurvan med värdet 0 pm. Kvadratisk kurvanpassningsmetod. Kalibrator A ska ingå i kurvan med värdet 0 pm. 16

17 OBS! Utvärderingsmetoderna 4-parametrisk eller linjär regression ska inte användas. En kalibreringskurva konstrueras för manuell utvärdering genom att plotta absorbansvärdena (A) för varje HE4-kalibrator mot motsvarande HE4-koncentration (i pm). De okända HE4-koncentrationerna kan sedan avläsas från kalibreringskurvan med användning av medelabsorbansvärdet för varje patientprov. Beräkning av resultat med spädda prover Om proverna i en initial analys ger HE4-nivåer som är högre än 900 pm ska proverna spädas 1/10 och 1/100 med HE4-kalibrator A för att erhålla korrekt HE4- koncentration för proverna. - 1/10 spädning = 50 µl prov µl HE4-kalibrator A - 1/100 spädning = 50 µl 1/10 spädning µl HE4-kalibrator A HE4-koncentrationen för det ospädda provet beräknas sedan: - Spädning 1/10: 10 x mätt värde - Spädning 1/100: 100 x mätt värde Algoritm för risk för äggstocksmalignitet (ROMA) för att uppskatta risken för äggstocksepitelcancer hos premenopausala och postmenopausala kvinnor med bäckenresistens Beräkning av prediktivt index Ett prediktivt index (PI) beräknas separat för premenopausala och postmenopausala kvinnor med användning av ekvationerna (1) och (2) nedan. Analysvärdena som erhålls från HE4 EIA och antingen ARCHITECT CA125 II- respektive CanAg CA125 EIA-analyser används för att beräkna PI och de förs in i tillämplig ekvation för algoritmen nedan, beroende på kvinnans menopausala status. (1) Premenopausal kvinna Prediktivt index (PI) = -12,0 + 2,38*LN[HE4] + 0,0626*LN[CA125] (2) Postmenopausal kvinna Prediktivt index (PI) = -8,09 + 1,04*LN[HE4] + 0,732*LN[CA125] Beräkning av ROMA-värde För att beräkna ROMA-värdet (dvs. förutsägande sannolikhet) ska man föra in det beräknade värdet för prediktivt index i ekvationen (3): (3) ROMA-värde (%) = exp(pi)/[1 + exp(pi)] *100 Exemplen nedan kan användas för att validera beräkningar av PI- och ROMAvärde: 17

18 Protokollblad HE4 EIA REF Bered komponenterna direkt före användning. Använd tvätt- och inkubationsförhållanden enligt anvisningarna. Obs! Analysen ska endast utföras vid temperaturer mellan 20 och 25 o C för att erhålla tillförlitliga resultat. Steg Flaska/platta Förfarande 1. Bered HE4-kalibratorer Bered HE4-kontroller CAL HE4 B, C, D, E, F 1, 2 CONTROL HE4 Tillsätt 1 ml av destillerat eller avjoniserat vatten till varje flaska och blanda försiktigt. Låt stå i minst 15 minuter. OBS! Den exakta koncentrationen av varje kalibrator anges på etiketten. Rekonstituerad hållbarhet: 4 veckor vid 2 8 o C. Bered tvättlösning CONTROL HE4 Späd 50 ml tvättkoncentrat med ml destillerat eller avjoniserat vatten. Bered arbetslösning av konjugat CONJ DIL CONJ Anti-HE4 Blanda 50 µl konjugat, HRP anti-he4, med 1 ml konjugat diluent per strips: Antal Konjugat, HRP anti-he4 Konjugat diluent strips (µl) (ml)

19 2. Tvätta 3. Tillsätt kalibratorer, kontroller och prover 4. Tillsätt biotin anti-he4 5. Inkubera 6. Tvätta 7. Tillsätt arbetslösning konjugat 8. Inkubera 9. Tvätta 10. Tillsätt TMB HRP-substrat 11. Inkubera 12. Avläs absorbans Alt. 12 Tillsätt stopplösning Alt. 13 Blanda Alt. 14 Avläs absorbans DIL CONJ CAL HE4 A, B, C, D, E, F CONTROL HE4 1, 2 BIOTIN Anti-HE4 MICROPLA MICROPLA TRACER WORKING SOLUTION MICROPLA MICROPLA SUBS TMB MICROPLA MICROPLA STOP MICROPLA MICROPLA Tvätta varje brunn en gång med tvättlösning Använd manuell eller automatisk tvätt 25 µl i varje brunn 100 µl i varje brunn 1 timmes skakning vid o C Tvätta varje brunn tre gånger med tvättlösning Använd manuell eller automatisk tvätt 100 µl i varje brunn 1 timmes skakning vid o C Tvätta varje brunn sex gånger med tvättlösning Använd manuell eller automatisk tvätt 100 µl i varje brunn 30 minuters skakning vid o C 620 nm 100 µl i varje brunn Blanda vid o C Avläs vid 405 nm inom 15 minuter 19

20 Menopausal status Premenopausal Premenopausal Postmenopausal Postmenopausal HE4 (pm) CA125 (E/ml) 37,5 74,9-12,0+(2,38*3,624) +(0,0626*4,316) 386,6 21,8-12,0+(2,38*5,957) +(0,0626*3,082) 66,7 11,3-8,09+(1,04*4,200) +(0,732*2,425) 383,1 22,7-8,09+(1,04*5,948) +(0,732*3,122) PI-beräkning PI ROMA (%) -3, ,29 2, ,5-1, ,5 0, ,4 BEGRÄNSNINGAR AV FÖRFARANDET Patienter med bekräftad äggstockscancer kan ha HE4-analysvärden i samma intervall som friska kvinnor. Vissa histologiska typer av äggstockscancer, t.ex. mucinösa eller könscellstumörer, uttrycker sällan HE4 och därför rekommenderas inte HE4 för övervakning av patienter med känd mucinös äggstockscancer eller könscellscancer i äggstock (7). Omvänt kan höga nivåer av HE4-antigen finnas hos personer med icke-malign sjukdom. Därför kan nivån av HE4 inte användas som ett absolut bevis på förekomst eller frånvaro av malign sjukdom och HE4-testet ska inte användas för cancerscreening. Testresultaten ska endast tolkas tillsammans med andra undersökningar och förfaranden vid diagnos av sjukdom och hantering av patienter och HE4-testet ska inte ersätta någon fastställd klinisk undersökning. Algoritmen för risk för äggstocksmalignitet har inte validerats för följande patientgrupper: patienter som tidigare behandlats för malignitet, patienter som för närvarande behandlas med kemoterapi och patienter < 18 år. Formen för den matematiska funktionen som beskrivs som algoritmen för risk för äggstocksmalignitet (ROMA) beror på en kvinnas premenopausala eller postmenopausala status. Den premenopausala eller postmenopausala statusen måste baseras på äggstocksfunktion som bestämts med tillgänglig information från klinisk utvärdering och anamnesen. ROMA-värdet omfattar inte ålder, familjehistorik, kliniska resultat eller radiologiresultat och ska tolkas tillsammans med dessa parametrar. Om HE4 EIA- och/eller CA125-analysen inte fungerar som tänkt eller om resultatberäkningen blir felaktig kan det leda till inkorrekt riskbedömning och olämplig hantering av patienten. Särskilt kan ett falskt lågt analysresultat leda till att patienten bedöms ha en lägre risk för äggstocksepitelcancer vilket gör att patienten prioriteras felaktigt med en mindre specialiserad vård som följd. Användning av analysresultat utan beaktande av andra laboratorieresultat, radiologiundersökningar och klinisk bedömning kan därför utgöra en risk. 20

21 Anti-reagensantikroppar (human antimus-antikropp (HAMA) eller heterofila antikroppar) i patientprovet kan ibland störa analysen, trots att specifika blockerande medel ingår i buffertarna. Analysen måste utföras i en temperaturkontrollerad omgivning eftersom inkubation vid temperaturer över det rekommenderade temperaturintervallet C kan ge falskt låga resultat. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Fördelningen av HE4-nivåer som bestämdes i prover visas i tabellen nedan: SYNBART FRISKA Fördelning av HE4-analysvärden Antal 0 150,1 300,1 > 500 personer 150 pm 300 pm 500 pm pm Kvinnor (premenopausala) Kvinnor (postmenopausala) BENIGNA TILLSTÅND Graviditet Benign gynekologisk sjukdom Annan benign sjukdom Hypertoni/kronisk Hjärtinsufficiens CANCER Äggstockscancer Bröstcancer Lungcancer Endometriecancer Gastrointestinal cancer I denna studie hade 94,4 % av de friska kvinnorna ett HE4-analysvärde på eller lägre än 150 pm. Det rekommenderas att varje laboratorium fastställer egna referensvärden för populationen av intresse. 21

22 Övervakning av sjukdomsstatus hos patienter diagnostiserade med äggstockscancer Effektiviteten av HE4 EIA som ett hjälpmedel för att övervaka sjukdomsstatus hos äggstockscancerpatienter bestämdes genom att bedöma ändringar av HE4-nivåer i serieserumprover från 80 patienter jämfört med ändringar av sjukdomsstatus. En studie utfördes som inbegrep totalt 354 par av observationer med ett medelantal på 4,4 observationer per patient. En positiv ändring av HE4 definierades som en ökning av värdet som var minst 25 % högre än det föregående värdet av testet. Denna ändringsnivå tar hänsyn till analysens variabilitet och den biologiska variabiliteten. 60% eller 76/126 av patientproverna med en positiv ändring korrelerade med sjukdomsprogression medan 75 % eller 171/228 av patientserieproverna utan signifikant positiv ändring av HE4-värdet korrelerade med utebliven progression. Den totala överensstämmelsen var 70 % eller 247/354. Följande tabell visar data i ett 2 x 2-format. Ändring av sjukdomsstatus per sekventiellt par Ökning av HE4-koncentration Progression Ingen progression Totalt > 25 % < 25 % Totalt Följande tabell visar fördelningen per patient. 93 % eller 54/58 av serumuppsättningarna per patient med en positiv ändring korrelerade med sjukdomsprogression medan 32 % eller 7/22 av serumuppsättningarna utan signifikant ändring av HE4- värdet korrelerade med utebliven progression. Den totala överensstämmelsen i denna studie var 76 % eller 61/80. Ändring av sjukdomsstatus per patient Ökning av HE4-koncentration Progression Ingen progression Totalt > 25 % < 25 % Totalt Uppskattning av risk hos patienter med bäckenresistens Effektiviteten av HE4 EIA i kombination med CA125 bestämdes med antingen ARCHITECT CA125 II- eller CanAg CA125 EIA-analysen för uppskattning av risken för äggstocksepitelcancer hos patienter med bäckenresistens bestämdes i en 22

23 prospektiv och dubbelblind klinisk multicenterprövning. En algoritm (ROMA, se sida 17) utvecklades för uppskattning av risken för äggstocksepitelcancer. Algoritmen tar hänsyn till HE4- och CA125-värdena samt patientens menopausala status. Algoritmen beräknar en förutsägande sannolikhet för att hitta äggstocksepitelcancer vid operation. I den prospektiva studien ingick totalt 502 patienter och man bestämde den förutsägande sannolikheten för äggstockscancer liksom möjligheten att kunna separera patienterna i en lågrisk- och en högriskgrupp baserat på ROMA-värden. Den kumulativa frekvensfördelningen av ROMA-värden för benigna fall och äggstockscancerfall, inklusive tumörer med låg malign potential (LMP), med algoritmen visas i figur 1 och 2 för analyskombinationen HE4 EIA och ARCHITECT CA125 II och i figur 3 och 4 för analyskombinationen HE4 EIA och CanAg CA125 EIA. Graferna med frekvensfördelning visar fördelningen av patienter med benign sjukdom och äggstocksepitelcancer (inklusive LMP) vid olika ROMA-brytpunkter. Fig. 1 Kumulativ frekvensfördelning av ROMA-värden för premenopausala kvinnor. Analyskombinationen HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II % benigna fall med lägre ROMA-värde Benigna (N=200) Cancer (N=34) % cancerfall med lägre ROMA-värde ROMA-värde: HE4 EI4 + CanAg CA125 23

24 Fig. 2 Kumulativ frekvensfördelning av ROMA-värden för postmenopausala kvinnor. Analyskombinationen HE4 EIA + ARCHITECT CA125 II Benigna (N=200) % benigna fall med lägre ROMA-värde Cancer (N=34) % cancerfall med lägre ROMA-värde ROMA-värde: HE4 EI4 + CanAg CA125 Fig. 3 Kumulativ frekvensfördelning av ROMA-värden för premenopausala kvinnor. Analyskombination HE4 EIA + CanAg CA125 EIA % benigna fall med lägre ROMA-värde Benigna (N=200) Cancer (N=34) % cancerfall med lägre ROMA-värde ROMA-värde: HE4 EI4 + CanAg CA125 24

25 Fig. 4 Kumulativ frekvensfördelning av ROMA-värden för postmenopausala kvinnor. Analyskombination HE4 EIA + CanAg CA125 EIA Benigna (N=200) % benigna fall med lägre ROMA-värde Cancer (N=34) % cancerfall med lägre ROMA-värde ROMA-värde: HE4 EI4 + CanAg CA125 Stratifiering i lågrisk- och högriskgrupper Algoritmen för risk för äggstocksmalignitet användes för att stratifiera kvinnor i riskgrupper för att hitta äggstocksepitelcancer. Följande brytpunkter användes för att ge en specificitetsnivå på 75 % för analyskombinationen HE4 EIA och ARCHITECT CA125 II: Premenopausala kvinnor ROMA-värde > 13,1 % = hög risk för att hitta äggstocksepitelcancer ROMA-värde < 13,1 % = låg risk för att hitta äggstocksepitelcancer Postmenopausala kvinnor ROMA-värde > 27,7 % = hög risk för att hitta äggstocksepitelcancer ROMA-värde < 27,7 % = låg risk för att hitta äggstocksepitelcancer Riskstratifieringen i hög risk för att hitta äggstocksepitelcancer hos alla patienter med adnexal resistens med användning av ROMA-värden vid en specificitetsnivå på 75 % visas i tabell 1, inklusive riskstratifieringen som erhölls för den separata premenopausala respektive postmenopausala patientgruppen. Sensitiviteten för stratifiering av patienter med äggstocksepitelcancer stadium I IV i högriskgruppen var 94 % och specificiteten var 75 %, så att 75 % av kvinnor med benign bäckenresistens klassificerades i lågriskgruppen. Det positiva och negativa prediktiva värdet var 58 % respektive 97 %. 25

26 Tabell 1: Riskstratifiering för hög risk för att hitta äggstocksepitelcancer (EOC) hos patienter med adnexal resistens med användning av analyskombinationen HE4 EIA och ARCHITECT CA125 II för att beräkna ROMA-värde. Premenopausal brytpunkt för stratifiering till högriskgruppen vid en specificitetsnivå på 75 % > 13,1 %. Postmenopausal brytpunkt för stratifiering till högriskgruppen vid en specificitetsnivå på 75 % > 27,7 %. Stadium I IV EOC och LMP, kombination Låg malign potential Stadium I II EOC Stadium I IIIC a EOC Stadium I IV EOC Premenopausala kvinnor n = 234 Postmenopausala kvinnor n = 268 Pre- och postmenopausala kvinnor, kombination n = /34 (76 %) 108/117 (92 %) 134/151 (89 %) 10/16 (63 %) 3/6 (50 %) 13/22 (59 %) 6/7 (86 %) 24/28 (86 %) 30/35 (86 %) 7/8 (88 %) 35/39 (90 %) 42/47 (89 %) 16/18 (89 %) 105/111 (95 %) 121/129 (94 %) a Stadium I IIIb och stadium IIIC (omentum-negativ, lymfknuta-positiv) äggstocksepitelcancer Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader i sensitiviteten och specificiteten för ROMA-värdet med användning av ARCHITECT CA125 II- eller CanAg CA125 EIA-värden för att differentiera mellan benigna sjukdomar och äggstocksepitelcancer. Med analyskombinationen CanAg CA125 EIA + HE4 EIA var sensitiviteten 93 % för att stratifiera patienter med äggstocksepitelcancer stadium I IV i högriskgruppen. Det positiva och negativa prediktiva värdet var 57 % respektive 97 %. Det bör anmärkas att olika brytpunkter för riskstratifiering till högrisk- respektive lågriskgruppen måste väljas beroende på vilken CA125-analys som används. 26

27 Följande brytpunkter användes för att ge en specificitetsnivå på 75 % för analyskombinationen CanAg CA125 EIA + HE4 EIA: Premenopausala kvinnor ROMA-värde > 12,5 % = hög risk för att hitta äggstocksepitelcancer ROMA-värde < 12,5 % = låg risk för att hitta äggstocksepitelcancer Postmenopausala kvinnor ROMA-värde > 14,4 % = hög risk för att hitta äggstocksepitelcancer ROMA-värde < 14,4 % = låg risk för att hitta äggstocksepitelcancer Frekvensen av falskt negativa värden och procentandelen av äggstocksepitelcancerfall som stratifierades till låg risk för att hitta äggstocksepitelcancer hos patienter med adnexal resistens med användning av ROMA-värdet vid en specificitetsnivå på 75 % visas i tabell 2. Stratifiering till lågrisk- och högriskgrupper för att hitta äggstocksepitelcancer med användning av ROMA-algoritmen vid en specificitetsnivå på 75 % resulterade i en total frekvens av falskt negativa värden på 6,2 %. Tre (3) % av alla fall som stratifierades till lågriskgruppen uppvisade äggstocksepitelcancer. Tabell 2: Frekvens av falskt negativa värden (FNR) och procentandelen av äggstocksepitelcancerfall av alla fall som stratifierades till lågriskgruppen hos patienter med adnexal resistens med användning av ROMA-värde. Premenopausal brytpunkt för stratifiering i lågriskgruppen vid en specificitetsnivå på 75 % < 13,1 %, postmenopausal brytpunkt för stratifiering i lågriskgruppen vid en specificitetsnivå på 75 % < 27,7 %. Äggstocksepitelcancer a Premenopausal Postmenopausal Alla patienter Frekvens av falskt negativa värden (FNR) Falskt Totalt FNR b negativa antal cancerfall cancerfall ,1 % ,4 % ,2 % Procentandel av cancerfall i lågriskgrupp Falskt Sant (%) c negativa cancerfall positiva benigna ,3 % ,0 % ,0 % a Tumörer av låg malign potential (LMP) ingår inte, b FNR = Falskt negativa fall/ (sant positiva fall + falskt negativa fall), c Falskt negativa fall/(sant negativa fall + falskt negativa fall) 27

28 PRESTANDAEGENSKAPER Precision Precisionen för HE4-analysen är < 15 % total variationskoefficient (CV). En studie utfördes enligt beskrivning i National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS (CLSI)-riktlinjen EP5-A2 (22). En panel av fyra serumprover analyserades med användning av två reagensloter, i replikat på två, vid två olika tillfällen per dag i 20 dagar. Data från studien sammanfattas nedan.* Prov Reagenslot n Medelkonc. SD inom CV % inom Total Total (pm) körning (pm) körning SD (pm) CV % ,3 0,81 1,6 2,34 4, ,0 0,69 1,4 2,17 4, ,3 1,81 2,4 2,96 3, ,4 1,73 2,4 4,70 6, ,68 2,2 12,0 4, ,21 2,2 12,8 5, ,22 1,5 14,5 3, ,71 2,3 21,6 5,6 *Representativa data, resultat för enskilda laboratorier kan variera. Detektionsgräns Detektionsgränsen för HE4 EIA-analysen är < 15 pm. Detektionsgränsen (LoD) motsvarar den övre gränsen i 95 % konfidensintervallet och representerar den lägsta koncentrationen av HE4-antigen som kan skiljas från noll. NCCLS-riktlinjen EP17-A (23) användes för att utforma experimenten för detektionsgränsen. En studie utfördes där HE4-kalibrator A (noll) och 4 prover från friska personer späddes till 5 pm med provspädningsmedel och testades i replikat på 24 per körning i 4 körningar under två olika dagar. Detektionsgränsen beräknades enligt följande: LoD (pm) = 5,0 pm x (1,65 x SD 0 + 1,65 x SD 5 )/(absorbansenhet 5 - absorbansenhet 0 ) Detektionsgränsen för HE4 EIA-kitet beräknades vara < 2,5 pm. Funktionell sensitivitet Den funktionella sensitiviteten för HE4 EIA-analysen är < 25 pm. Den funktionella sensitiviteten uttrycks som koncentrationen av en analyt vid vilken CV är 20 %. NCCLS-riktlinjen EP5-A2 (22) användes för att utforma experiment för bestämning av funktionell sensitivitet. En studie utfördes där en sensitivitetspanel med fem medlemmar testades i replikat på 4 i 2 körningar under 20 olika dagar med 2 reagenslotnummer. Den funktionella sensitiviteten som bestämdes för HE4 EIA var < 5 pm. 28

29 Utbyte Medelutbytet för HE4 EIA-analysen är 100 ± 15 %. En studie utfördes där spädningar av ett patientprov med kända HE4-koncentrationer tillsattes till normala humana serumprover. HE4-koncentrationen bestämdes med HE4 EIA-analysen och den resulterande procentandelen utbyte beräknades. Representativa data från denna studie sammanfattas i tabellen nedan*. Prov Endogent Tillsatt HE4- Observerat HE4- Procentandel analysvärde (pm) antigen (pm) analysvärde (pm) utbyte** % 1 44, , , , , , , , , , , , , Medelutbytet över fyra separata tillsatta koncentrationer som visas ovan befanns vara 97 %. *Representativa data, resultat för enskilda laboratorier kan variera. **% utbyte = observerad HE4-koncentration (pm)/endogen HE4-konc. (pm) + tillsatt HE4 (pm) 29

30 "High Dose Hook"-effekt "High Dose Hook"-effekt är ett fenomen då prover på mycket hög nivå kan avläsas inom analysens dynamiska intervall. För HE4 EIA observerades ingen "High Dose Hook"-effekt för prover med upp till pm nativ HE4-antigen. Spädningslinjäritet Medelspädningslinjäriteten för HE4 EIA-analysen är 100 ± 15 %. En studie utfördes för HE4 EIA modellerad efter NCCLS (CLSI)-riktlinjen EP6-A (24). Serumprover med förhöjda HE4-värden späddes med HE4-kalibrator A (noll). HE4- koncentrationen bestämdes för varje spädning och procentandel (%) utbyte beräknades. Representativa data från denna studie sammanfattas i tabellen nedan*. Prov Slutlig Erhållet Förväntat Procentandel spädningsfaktor värde (pm) värde (pm) utbyte** (%) 1 Ospätt 889,6 889, :1,25 720,0 711, :1,7 543,1 533, :2 450,6 444, :2,5 345,9 355,8 97,2 1:5 183,6 177, :10 97,6 89, :20 49,1 44, :40 25,9 22, Ospätt 697,0 697, :1,25 544,9 557,6 97,7 1:1,7 429,8 418, :2 361,1 348, :2,5 275,9 278,8 99,0 1:5 134,5 139,4 96,5 1:10 74,4 69, :20 39,1 34, :40 21,0 17, Ospätt 680,2 680, :1,25 499,7 544,2 91,8 1:1,7 354,4 408,1 86,8 1:2 296,7 340,1 87,2 1:2,5 247,2 272,1 90,9 1:5 124,9 136,0 91,8 1:10 61,7 68,0 90,7 1:20 34,6 34, :40 18,4 17,

31 Medelutbytet över tre spädda prover som visas ovan = 101 %. *Representativa data, resultat för enskilda laboratorier kan variera. **% utbyte = erhållen HE4-koncentration x spädningsfaktor/ospädd HE4- koncentration Analytisk specificitet Medelanalysspecificiteten för HE4 EIA-analysen är 100 ± 15 %. Studier av utbytet utfördes för att jämföra sera innehållande följande ämnen vid de angivna koncentrationerna med kontrollsera. NCCLS-riktlinjen EP7-A (25) användes för att utforma experimenten för interferens. Följande ämnen och koncentrationer testades och befanns inte störa testet. Endogena seruminterferenser Triglycerider Bilirubin Hemoglobin Totalprotein Testkoncentration 30 mg/ml 0,2 mg/ml 10 mg/ml 120 mg/ml Kemoterapeutiska läkemedelsinterferenser Karboplatin Cisplatin Klotrimazol Cyklofosfamid Dexametason Doxorubicin Leukovorin Melfalan Metotrexat Paklitaxel Testkoncentration 500 µg/ml 165 µg/ml 0,3 µg/ml 500 µg/ml 10 µg/ml 1,16 µg/ml 2,68 µg/ml 2,8 µg/ml 45 µg/ml 3,5 ng/ml Potentiellt interfererande kliniska tillstånd HE4 EIA-analysen utvärderades med användning av prover med HAMA och reumafaktor (RF) för att vidare utvärdera analysspecificiteten. Fem prover som var positiva för HAMA och fem prover som var positiva för RF utvärderades för % utbyte med tillsatt HE4-antigen i varje prov vid cirka 50 och 450 pm. Resultat av medelutbyte sammanfattas i följande tabell.* 31

32 Kliniskt tillstånd Antal prover Medelutbyte i % HAMA RF 5 95 *Representativa data, resultat för enskilda laboratorier kan variera. GARANTI Prestandadata som presenteras här erhölls med det angivna analysförfarandet. Eventuell ändring eller modifiering av förfarandet som inte rekommenderats av Fujirebio Diagnostics kan påverka resultaten och i det fallet friskriver Fujirebio Diagnostics sig från alla uttryckta, underförstådda eller lagstadgade garantier, inklusive underförstådd garanti om säljbarhet och lämplighet för ett visst ändamål. 32

33 REFERENSER 1. Israeli O, Goldring-Aviram A, Rienstein S, Ben-Baruch G, Korach J, Gold man B, Friedman E. In silico chromosomal clustering of genes displaying altered expression patterns in ovarian cancer. Cancer Genet Cytogenet 2005;160: Bouchard D, Morisset D, Bourbonnais Y, Tremblay GM. Proteins with wheyacidic-protein motifs and cancer. Lancet Oncol 2006;7: Bingle L, Singleton V, Bingle CD. The putative ovarian tumour marker gene HE4 (wfdc2), is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms. Oncogene 2002;21: Kirchhoff C, Habben I, Ivell R, et al. A major human epididymis-specific cdna encodes a protein with sequence homology to extracellular protease inhibitors. Biol Reprod 1991;45: Kirchhoff C. Molecular characterization of epididymal proteins. Rev Reprod 1998;3: Galgano MT, Hampton GM, Frierson HF Jr. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues. Mod Pathol 2006;19: Drapkin R, von Horsten HH, Lin Y, Mok SC, Crum CP, Welch WR, Hecht JL. Human epididymis protein 4 (HE4) is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas. Cancer Res 2005;65: Hough CD, Sherman-Baust CA, Pizer ES, Montz FJ, Im DD, Rosenshein NB, Cho KR, Riggins GJ, Morin PJ. Large-scale serial analysis of gene expression reveals genes differentially expressed in ovarian cancer. Cancer Res 2000;60: Schummer M, Ng WV, Bumgarner RE, Nelson PS, Schummer B, Bednarski DW, Hassell L, Baldwin RL, Karlan BY, Hood L. Comparative hybridization of an array of 21,500 ovarian cdnas for the discovery of genes overex pressed in ovarian carcinomas. Gene 1999;238: Gilks CB, Vanderhyden BC, et al. Distinction between serous tumors of low malignant potential and serous carcinomas based on global mrna expression profiling. Gynecol Oncol 2005;96: Hellstrom I, Raycraft J, et al. The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian cancer. Cancer Res 2003;63: Moore RM, Brown AK, Miller MC, et al. The use of multiple novel tumor markers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass. Gynecol Oncol 2008;108: