Biokemisk Analys och Separationsteknik

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Biokemisk Analys och Separationsteknik"

Lovisa Karolina Danielsson
för 8 år sedan
Visningar:

1 Biokemisk Analys och Separationsteknik Human Protein Atlas Proteinlokalisation i human vävnad Förarbete Produktion och kvalitetskontroll av detektionsreagens - I detta fall antikroppar

2 Biokemisk Analys och Separationsteknik Förarbete - bl a Proteinrening IMAC-rening Analys av renhetsgrad med SDS-PAGE Inbindningsstudier Imaging av cancertumörer mha Affibody-molekyler Biacore-data Immunohistokemi

med SDS-PAGE Inbindningsstudier Imaging av

3 Biokemisk Analys och Separationsteknik Förarbete - bl a Proteinrening IMAC rening SDS-PAGE - analys Strukturstudier Scanning Electron Microscopy Utveckling av spiber spindelfibrer Hjälp vid odling av mänsklig hud Biokompabilitet Immunohistokemi

Scanning Electron Microscopy Utveckling av spiber

4 Biokemisk Analys och Separationsteknik Koncentrationsbestämning av IgG exempelvis vid autoimmun sjukdom mha Gyrolab Bioaffy assay Förarbete Rening, inmärkning och kvalitetskontroll av detektionsreagens - I detta fall proteinet z

sjukdom mha Gyrolab Bioaffy assay Förarbete Rening,

5 Valet av metod Förutsättningarna hos analyten / provet / frågeställningen Exempel: Hur ta Biomarkör från att vara kandidat till klinisk tillämpning? Hur många prover resp. analyter krävs? Vilka tekniker kan över huvud taget användas? Leigh Andersson, PepTalk, San Diego 2007

till klinisk tillämpning? Hur många prover resp. analyter krävs?

6 Kvalitativ och kvantitativ analys (Kap 1.6) Välja metod vad avgör? Tillgång på utrustning Detektionsgränser metod/prov Antal prover Graden av komplexitet i provet Tänkbara risker metod/prov Kända/publicerade metoder

7 Förutsättningarna hos analyten / provet Graden av komplexitet i provet Human Plasma som exempel Human plasma mycket komplext prov. Dock användbart i såväl forskning som diagnostik och monitorering av behandlingsförlopp. Man tror att plasma innehåller kroppens alla proteiner Extremt dynamiskt fönster! Koncentrationsskillnader i storleksordningen (mg/ml till <<pg/ml) Totalmängden protein är ca 100 mg/ml protein, varav Albumin utgör drygt 50% Upptäkt, validering, diagnostisering, monitorering ställer olika tekniska krav

Man tror att plasma innehåller kroppens alla proteiner Extremt dynamiskt fönster!

8 Kvalitativ och kvantitativ analys (Kap 1.6) Metodens kvalitet Reproducerbarhet / precision Noggrannhet Accuracy Detektionsgräns LOD Limit of Detection Analytiskt fönster Detection range Specificitet Specificity Selectivitet Selectivity Robusthet Robustness

Accuracy Detektionsgräns LOD Limit of Detection Analytiskt

9 Kvantitativ analys (Kap 1.6) Experimentella fel Slumpmässiga eller systematiska Beror på Noggrannhet hos instrumentet - laboranten - - metoden Minskas med - Blankprov - Referens - Mer än en metod -SOP

10 Analytens omgivning - Buffertval (Kap 1.4) Önskvärda egenskaper hos en buffert Vattenlöslig Inte giftig Buffertkapacitet vid önskat ph-intervall och temperatur Hög renhet hos ingående kemikalier Ej absorbera UV eller synligt ljus Buffertkapacitet mycket viktig Koncentrations och temperaturberoende Konduktivitets [ms/cm] beroende

vid önskat ph-intervall och temperatur Hög renhet hos ingående kemikalier Ej

11 Analytens omgivning - Modellsystem In vivo modeller (vivus-levande) Man försöker studera händelser i ett normalt system hela organismer cellkulturer In vitro modeller (vitrum-glasflaska, glaskärl) Förenklade, cellfria system används för att studera ett visst förlopp cellhomogenat delar av organ

cellkulturer In vitro modeller (vitrum-glasflaska, glaskärl) Förenklade,

12 Produktion Odling Cellkulturer Vad odla Mikrobiella kulturer (jäst, svampar, bakterier) Vävnadskulturer av växter Mammaliecellkulturer Hur odla Batch Fed-batch Kontinuerlig

13 Cellkulturer att slå sönder cellen Mammalieceller ( 10 µm) är sköra och lätta att slå sönder Växtceller ( 100 µm) har rigida cellväggar, deras storlek gör att de ändå är rel. lätta att slå sönder Bakterier ( 1-4µm) tåliga och ganska svåra att förstöra Grampositiva Gramnegativa Svampar och jästceller är också relativt tåliga

14 Cellkulturer att slå sönder cellen Metoder för att krossa cellerna (1) Mixa i hushållsmaskin Vävnadsdelar blandas med lämplig buffert. Både för stor och liten skala Krossa tillsammans med slipmedel, sand eller dylikt i en mortel (växtceller och bakterier) Liten skala Glaskulekvarn Tryckförändring French press HPH Mellan och stor skala Liten skala Mellan och stor skala

Både för stor och liten skala Krossa tillsammans med slipmedel, sand eller dylikt i en

15 Cellkulturer att slå sönder cellen Metoder för att krossa cellerna (2) Enzymatiska metoder Lysozyme används för att bryta ner peptidoglycan Gramnegativa bakterier behöver även behandlas med detergent och EDTA (Ca+) Liten skala Lyticase eller zymolyase används till jästceller Kompletteras med osmotisk shock Liten skala Sonikering Ultraljud, >20kHz, skjuvkrafter Liten skala ty hög värmeutveckling Osmotisk shock Cellerna utsätts för hög osmotisk potential och sedan mycket låg, membranet går sönder. Periplasmatiska proteiner Liten och mellan skala

till jästceller Kompletteras med osmotisk shock Liten skala Sonikering Ultraljud, >20kHz, skjuvkrafter Liten skala ty hög värmeutveckling

16 Cellkulturer att få ut proteinet Metoder för att extrahera sitt målprotein (1) Extraktionsbuffert Isoton lösning: jonstyrka M, ph 7-8 Antioxidant, förhindra oxidation av fria S-grupper DTT, b-merkaptoetanol, cystein, GSH Enzyminhibitorer för att undvika nedbrytning av protein/dna/rna PMSF, DFP, IAA, Cystatin Låg temperatur (4 C) hämmar också enzymatisk aktivitet Enzymsubstrat co-faktorer tillsätts för att stabilisera målproteinet EDTA för att förhindra oxidation av thioler, -SH Fällning av fenolinnehållande ämnen PVP, används till växtceller Natriumazid, lösningar som ska sparas under längre perioder

protein/dna/rna PMSF, DFP, IAA, Cystatin Låg temperatur (4 C) hämmar också enzymatisk aktivitet Enzymsubstrat co-faktorer tillsätts för att stabilisera

17 Cellkulturer att få ut proteinet Metoder för att extrahera sitt målprotein (2) Membranproteiner kräver särskild omtanke: Perifera membranproteiner binder till ytan genom elektrostatiska interaktioner och vätebindningar - Går att få loss genom att öka salthalten ( 1M NaCl) Integrerade sträcker sig genom membranet, långa sekvenser med hydrofoba aminosyror - Detergenter behövs, oftast får man prova sig fram till vad som passar målproteinet (SDS, CTAB, CHAPS, Nonidet-40, Triton-X)

genom att öka salthalten ( 1M NaCl) Integrerade sträcker sig genom membranet, långa sekvenser med hydrofoba aminosyror -

18 Koncentrationsbestämning ett flertal metoder Absorbansmätning UV-ljus Peptidbindning l=190 nm Aromatiska sidogrupper l=280 nm Korrektionsfaktor för det önskade proteinet kan användas, förutsätter relativt rent material. Nukleinsyror absorberar också (260nm/280nm) Lowry - Beroende av peptidbindningar och aromatiska aminosyror (Cu2+=> Cu+) BCA - Bicinchoninic acid, liknar Lowry (Cu2+=> Cu+) Bradford - Coomassie Brilliant Blue, binder till arg och lys. Absorbtionsmax ändras vid inbindning. Bra standardkurva nödvändig Aminosyra analys - Provet degraderas till aminsyror och mängden av varje komponent bestäms mha kromtografi. Den mest noggranna metoden. Assays baserade på Immunologiska metoder ELISA, Gyrolab Bioaffy... Proteinmängden ofta viktig vid tolkning av resultat!

Nukleinsyror absorberar också (260nm/280nm) Lowry - Beroende av peptidbindningar och aromatiska aminosyror (Cu2+=> Cu+) BCA - Bicinchoninic acid, liknar Lowry (Cu2+=> Cu+) Bradford - Coomassie

19 Mikroskopering Olika förstoringsgrader och upplösningar ggr (0.2µm) Ljusmikroskopi Faskontrastmikroskopi Polariserat ljus Konfokalmikroskopi ggr (1nm) Elektronmikroskopi Transmissions elektronmikroskopi (TEM) (l 4*10-3 nm) tungmetaller Scanning elektronmikroskopi (SEM) Ny teknik Atomic force mikrosopi (AFM) lateralt nm, vertikalt nm

(1nm) Elektronmikroskopi Transmissions elektronmikroskopi (TEM) (l 4*10-3 nm) tungmetaller

20 Mikroskopering Val av metod utifrån studieobjektets storlek 0.1nm 1nm 10nm 100nm 1µm 10µm 100µm 1mm Small molecules Globular proteins Viruses Ribosomes QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. Organelles Bacteria Yeast Animal cells Embryos Plant cells Electron microscope Light microscope MRI Human eye

Ribosomes QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this

21 Confocal microscopy Labeled Antibody binding to the protein HER-2 Subcellular localisation: plasma membrane RT4 Human epithelial urinary bladder carcinoma

22 Elektronmikroskopbild av rer

23 Separation och analys av DNA/RNA Bygger på laddning och storlek. DNA och RNA negativt laddat

24 Aminosyror är optiskt aktiva undantag glycin Aminosyror i proteiner har alltid L-form

25 Aminosyror har flera pk a Glycin katjon zwitterjon anjon pi där aminosyran är oladdad

26 Alifatiska aminosyror Aromatiska aminosyror

27 Laddade aminosyror Polära aminosyror

28 Peptidbindning

29 Peptidbindning Endast ett pka relevant för de flesta aminosyrorna Undantag är de N- och C-terminala

30 Disulfider stabiliserar proteinstrukturer

31 Primär, sekundär, tertiär, kvartenär

Relevanta dokument

Kvalitativ analys. Kvantitativ analys. Biokemisk analys och separationsteknik. GLP = Good Laboratory Practice. GMP = Good Manufacturing Practice

Kvalitativ analys. Kvantitativ analys. Biokemisk analys och separationsteknik. GLP = Good Laboratory Practice. GMP = Good Manufacturing Practice Biokemisk analys och separationsteknik FDA (Food and Drug Administration), Läkemedelsverket GLP = Good Laboratory Practice GMP = Good Manufacturing Practice SOP = Standard Operating Procedures Kvalitativ