Kvalitativ analys. Kvantitativ analys. Biokemisk analys och separationsteknik. GLP = Good Laboratory Practice. GMP = Good Manufacturing Practice

Transkript

1 Biokemisk analys och separationsteknik FDA (Food and Drug Administration), Läkemedelsverket GLP = Good Laboratory Practice GMP = Good Manufacturing Practice SOP = Standard Operating Procedures Kvalitativ analys Kvantitativ analys

2 Kvantitativ analys Välja metod: Tillgång på utrustning Detektionsgränser metod/prov Antal prover Graden av komplexitet i provet Tänkbara risker metod/prov Kända/publicerade metoder Fel i analysen Noggrannhet hos laboranten instrumentet metoden

3 Minska de systematiska felen genom Blankprov Referens Mer än en metod SOP Metodens kvalité Reproducerbarhet/precision Noggrannhet Detektionsgräns Analytiskt fönster Specificitet Robusthet

4 Proteinernas/DNAts omgivning är viktig Önskvärda egenskaper hos en buffert:! Vattenlöslig! Inte giftig! Buffertkapacitet vid önskat ph-intervall och temperatur! Hög renhet hos ingående kemikalier! Ej absorbera UV eller synligt ljus Buffertkapacitet mycket viktig Koncentrations och temperaturberoende Konduktivitets [ms/cm] beroende In vivo modeller (vivus-levande) Man försöker studera händelser i ett normalt system hela organismer cellkulturer In vitro modeller!(vitrum-glasflaska, glaskärl) Förenklade, cellfria system används för att studera ett visst förlopp cellhomogenat delar av organ

5 Cellkulturer Mikrobiella kulturer (jäst, svampar, bakterier) Vävnadskulturer av växter Mammaliecellkulturer Att odla: #Batch #Fed-batch #Kontinuerlig För att kartlägga en viss funktion i en cell Mutationer " I genomet " Addera en funktion via plasmid Olika typer! Punktmutationer! Deletioner Effekt! Icke konditionella! Konditionella! Supressorkänsliga mutationer (sus)

6 1 500 ggr (0.2µm)! Ljusmikroskopi! Faskontrastmikroskopi! Polariserat ljus! Konfokalmikroskopi Mikroskopering ggr (1nm)! Elektronmikroskopi! Transmissions elektronmikroskopi (TEM) (!!4*10-3 nm) tungmetaller! Scanning elektronmikroskopi (SEM) Ny teknik! Atomic force mikrosopi (AFM) lateralt nm, vertikalt nm 0.1nm 1nm 10nm 100nm 1µm 10µm 100µm 1mm Viruses Yeast Small molecules Globular proteins Ribosomes Bacteria Plant cells Embryos Organelles Animal cells Electron microscope Light microscope MRI Human eye

7 To Perform High Quality Immunohistochemistry On Selected Human Tissues And Cells HPRK300030:!-HER-2 Subcellular localisation: plasma membrane RT4 (Human epithelial urinary bladder carcinoma)

8 Elektronmikroskopbild av rer Provberedning (1) Vävnadsfixering! kemisk (formaldehyd, glutaraldehyd) omgivande material vax el dyl! frysning Tunna skivor! Ljusmikroskopi =5-10µm, mikrotom! TEM "100nm, ultramikrotom

9 TMA - production Collection of tissues Annotation TMA design Analysis TMA construction TMA sectioning Provberedning (2) Färgning: Ospecifik:! Kemikalier som binder - eller +-laddade molekyler! ph indikatorer Specifik:! Utnyttja protein-protin interaktioner (Antikroppar)! Koppla ett signalprotein till en molekyl med känd/okänd lokalisering (GFP)! Utnyttja enzymatiska reaktioner (utfällning)

10 Proteinlokalisering P.Samuelson et al. Färgen berättar om ph i organellen ph"5 lysosom ph"5,5-6,5 endosom

11 Separation och analys av DNA/RNA Bygger på laddning och storlek. DNA och RNA negativt laddat Aminosyror är optiskt aktiva undantag glycin Aminosyror i proteiner har alltid L-form

12 Aminosyror har flera pk a Glycin katjon zwitterjon anjon pi där aminosyran är oladdad Alifatiska aminosyror Aromatiska aminosyror

13 Laddade aminosyror Polära aminosyror Peptidbindning

14 Peptidbindning Endast ett pka relevant för de flesta aminosyrorna Undantag är de N- och C-terminala Disulfider stabiliserar proteinstrukturer

15 Primär, sekundär, tertiär, kvartenär Proteinmängden viktig för att tolka resultat Absorbansmätning, UV-ljus! Peptidbindning!=190 nm! Aromatiska sidogrupper!=280 nm Korrektionsfaktor för det önskade proteinet kan användas, förutsätter relativt rent material. Nukleinsyror absorberar också (260nm/280nm) Lowry:! Beroende av peptidbindningar och aromatiska aminosyror (Cu 2+ => Cu + ) BCA! Bicinchoninic acid, liknar Lowry (Cu 2+ => Cu + ) Bradford Coomassie Brilliant Blue, binder till arg och lys. Absorbtionsmax ändras vid inbindning! Bra standardkurva nödvändig Aminosyra analys! Provet degraderas till aminsyror och mängden av varje komponent bestäms mha kromtografi

16 Att extrahera ut sitt målprotein (1) Extraktionsbuffert Isoton lösning: jonstyrka M, ph 7-8! Antioxidant, förhindra oxidation av fria S-grupper. DTT, "-merkaptoetanol, cystein, GSH! Enzyminhibitorer för att undvika nedbrytning av protein/dna/rna PMSF, DFP, IAA, Cystatin Låg temperatur (4 C) hämmar också enzymatisk aktivitet! Enzymsubstrat, co-faktorer tillsätts för att stabilisera målproteinet! EDTA för att förhindra oxidation av thioler, -SH! Polyvinylpyrrolidone (PVP) används till växtceller, fällning av fenolinnehållande ämnen! Natriumazid, lösningar som ska sparas under längre perioder Att extrahera ut sitt målprotein (2) Membranproteiner kräver särskild omtanke Perifera, binder till ytan genom elektrostatiska interaktioner och vätebindningar! går att få loss genom att öka salthalten (!1M NaCl) Integrerade, sträcker sig genom membranet, långa sekvenser med hydrofoba aminosyror! detergenter behövs, oftast får man prova sig fram till vad som passar målproteinet SDS, CTAB, CHAPS, Nonidet-40, Triton-X

17 Att extrahera ut sitt målprotein (3) Slå sönder cellen Mammalieceller (!10 µm)! är sköra och lätta att slå sönder Växtceller (!100 µm)! har rigida cellväggar, deras storlek gör att de ändå går ganska lätt att slå sönder Bakterier (!1-4µm)! tåliga och ganska svåra att förstöra! Grampositiva! Gramnegativa Svampar och jästceller är också relativt tåliga Metoder för att krossa cellerna (1) Mixa i hushållsmaskin Vävnadsdelar blandas med lämplig buffert.! Både för stor och liten skala Krossa tillsammans med slipmedel (sand el dyl) i en mortel (växtceller och bakterier)! Liten skala Glaskulekvarn! Mellan och stor skala Tryckförändring French press! Liten skala HPH! Mellan och stor skala

18 Metoder för att krossa cellerna (2) Enzymatiska metoder Lysozyme används för att bryta ner peptidoglycan! Gramnegativa bakterier behöver även behandlas med detergent och EDTA (Ca+)! Liten skala Lyticase eller zymolyase används till jästceller! Kompletteras med osmotisk shock! Liten skala Sonikering Ultraljud, >20kHz, skjuvkrafter! Liten skala ty hög värmeutveckling Osmotisk shock Cellerna utsätts för hög osmotisk potential och sedan mycket låg, membranet går sönder. Periplasmatiska proteiner! Liten och mellan skala