Jonbyteskromatografi

Transkript

1 Jonbyteskromatografi Den mest frekvent använda proteinreningsmetoden Bygger på laddad interaktion mellan målproteinet i lösning och en fast matris. Beroende av:! Lösningens ph! Målproteinet och kontaminanternas pka! Laddningskoncentrationen hos målproteinet och kontaminanterna Jonbyteskromatografi Hög upplösning Hög kapacitet Mångsidig Enkel både i teori och i praktik Katjonbytare: binder POSITIVT laddade molekyler NEGATIVT laddad matris Anjonbytare: binder NEGATIVT laddade molekyler POSITIVT laddad matris

2 Mekanism 1) Diffusion av jonen till matrisens laddade yta, snabbt 2) Diffusion av jonen in i matrisen 3) Jonbyte på ytan av matrisen, jämviktsprocess 4) Diffusion av den utbytta jonen ut ur matrisen 5) Selektiv desorption och den bundna molekylen mha ph eller laddningsförändring av bufferten Anjonbyteskromatografi

3 His Att tänka på Högre laddning hos proteinet ger starkare bindning Mer hydrofob omgivning ger starkare interaktion mellan laddade grupper pi hos målproteinet avgör (oftast) vilket ph som fungerar Jonbytarmatrisens laddning ska vara stabil vid det ph man använder ph vid matrisens yta skiljer sig från buffertens med ca en ph-enhet (!) Högre jonstyrka ger lägre inbindning, tävlande joner Laddade aminosyror Laddade grupper sitter oftast på proteinets yta ibland internt koordinerade av metalljoner Posttranslationella modifieringar kan påverka pka Aminosyra Struktur pka i pka Förekommer proteiner fri % Arg guanidin Asp carboxylat Cys tiol Glu carboxylat His imidazol Lys!-amino Tyr fenol "-amino amino "-carboxyl carboxylat

4 pi hos proteiner De flesta proteinerna har ett pi under 7 Basiska proteiner har ett överskott av basiska aminosyror pi sällan över 9.7 Sura proteiner, pi under 5 är också ovanliga Titreringskurvor kan göras för proteiner, info om pi och laddningsförändring i olika ph-intervall Vid pka bidrar en aminosyra med laddningen +/-0.5, en ph-enhet från pka är 91% titrerade Jonbytesmatrisen Starka jonbytare: Joniserade i ett brett ph-intervall -SO 3 - -N + R 3 Svaga jonbytare: Joniserade i ett smalare ph-intervall -COO- -HN + (CH 2 CH 3 ) 2

5 Kapacitet Total kapacitet bestäms genom titrering, meq jonbytande grupper som är tillgängliga (!mol/ml gel) Kapacitet kan också anges i mg protein/ml gel, mycket proteinberoende

6 Eluering Isokratisk eluering används ibland Provvolymen bör då ej överstiga 1-5% av kolonnvolymen (jmf gelfiltrering). Bra separation Stegvis eluering -> ger mer koncentrerat protein Gradienteluering används oftast ph svårt att få stabila ph-gradienter Kommer nära pi för proteinet Salt, oftast NaCl bra upplösning Mer utspätt än vid stegvis eluering Affinitetskromatografi Koncentrering och rening i samma steg Oftast mycket selektiv Bindningen måste vara reversibel Bra som första steg i en reningsprocess

7 Affinitetskromatografi + Hög specificitet Färre reningsteg Produktproteiner med låg koncentration kan renas - Dyra matriser Få ligander tillgängliga Proteinligander har låg stabilitet Tuffa elueringsförhållanden Exempel på ligander Li gand Antikroppar Enzyminhibitorer Lectin Nukleinsyror Hormoner, Vitaminer Socker Målprotein Antigen, Cell, Virus Enzymer Polysackarider, Glykoproteiner Proteiner som binder nukleinsyror Receptorer, Bindarproteiner Lectin, Sockerbindande proteiner

8 Egenskaper hos liganden Kunna bilda ett reversibelt komplex med målproteinet Specificiteten bör vara hög Affiniteten måste vara tillräckligt hög för att kunna retardera målproteinet (K a " ) Komplexet ska kunna brytas utan att förstöra målproteinet Liganden bör kunna bindas upp på en fast matris Matrisen Måste innehålla aktiva grupper som liganden kan bli kopplad till Måste vara stabil under hela kromatograficykeln Bör ej interagera med de molekyler som finns i startmaterialet Bör tåla höga flöden Makroporös för att tillåta att stora molekyler vandrar in i porerna

9 NHS-aktiverad matris: -NH 2 Kopplingskemi CNBr-aktiverad matris: -NH 2 Aktiverad CH matris: -NH 2 Epoxiaktiverad matris: -OH -SH (tioeter) -NH 2 Liten ligand kräver extra eftertanke när det gäller spacerarm för att komma ut från ytan Tiolpropylmatris: -SH (disulfid) EAH-aktiverad matris -COOH Gruppspecifika affinitetsligander Lectiner: Används för rening av gykosylerade proteiner Det finns olika lectiner med specificitet för olika sockerarter (glukos, mannos, galaktos ) Protein A & protein G: Används för rening av antikroppar Olika affinitet för olika species och klasser Heparin: Används för rening av koagulationsproteiner och även DNA-bindande enzymer

10 Rening Förfraktionering: Avläsgna fasta partiklar, celldebris (centrifugering/filtrering) Ställa in ph, jonstyrka (gelfiltrering/dialys) Inbindning - Tvätt - Eluering: Normalt bred och kort kolonn, snabb separation Om affiniteten är låg blir proteinet bara retarderat -> kolonnen behöver vara längre Ibland batchvis inbindning (eluering) Om inbindningskinetiken är långsam, långsamt flöde Låga flöden ger snyggare toppar, mer koncentrerat protein Gradienteluering om flera bindare finns Oftast sänker man ph (2-4) vid eluering ibland höjer man ph Ibland eluerar man med höjd salthalt Kompetitiv eluering, låga flöden, annars breda toppar, mild eluering Regenerering Vanligast på lab. att bara jämvikta kolonnen med startbuffert igen Industriellt används NaOH 0.1-1M för att avlägsna bundet material från matrisen Ofta ett problem när man har proteinligander på kolonnen då de normalt ej tål så höga phn

11 Kovalent kromatografi 1 S -S - N P -SH Kan användas då målproteinet har en fri cystein: Aktivering av matrisen med 2,2 -dipyridyldisulfid 2 S -S - P N H S Reducera målproteinet Bind till gelen, batchvis 3 S -S - P R -SH excess Tvätta med M NaCl Eluera med reduktionsmedel, oftast 10-25mM DTT 4 S -SH P -SH R- S -S -R Tiopyridyl lossnar lättare än proteinet, gradient eller steg Gelfiltrering Två möjligheter Genfusioner Nativt målprotein Tag Target Target Target Tag + General metod för många målproteiner + Fusionsystem finns att köpa - Reningstaggen kan störa + Rening av det nativa proteinet - Affinitetsligand kan vara svårt att få tag i

12 Några väl använda affinitetsvansar ProteinA 31kDa binder IgG elueras med lågt ph Z 7kDa binder IgG elueras med lågt ph ABP 5-25kDa binder HSA elueras med lågt ph GST 25kDa binder glutation elueras med glutation His6 6 aa binder metalljoner elueras med imidazol eller lågt ph Biotin 13kDa binder avidin elueras med biotin FLAG-peptid 8 aa binder till mono- elueras med lågt ph klonal antikropp elleredta Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC Metallbindande aminosyror (His, Cys, Trp) måste vara exponerade på ytan Aminosyrornas läge i förhållande till varandra är viktigt Jon-jon-interaktioner kan inhiberas med rätt buffertval ph-beroende Fler elueringssätt finns beskrivna (ph, kompetitiv eluering, organiska lösningsmedel, kelaterande ämnen)

13 När aminosyrainnehållet är känt Närvaro av His/Trp på ytan Me-joner som ger adsorption 1 His Cu 2+ > 1 His Cu 2+, Ni 2+ Kluster med His Cu 2+, Ni 2+, Zn 2+, Co 2+ Flera Trp Cu 2+ Reningshandtag, His 6 Genetisk fusion mellan målproteinet och en His 6 -svans Mycket vanligt vid produktion av rekombinanta proteiner Enkel, ganska specifik rening som är oberoende av målproteinet Går att rena vid denaturerande förhållanden, bra då proteinet bildar inklusionkroppar i värden och är allmänt olösligt Eluering sker men lågt ph eller imidazole (His)

14 Expanded bed adsorption (EBA) Minimera antalet steg i separationsprocessen Pumpa materialet på en kolonn direkt från odlingen Centrifugering/filtering kan undvikas Möjligheter Odling Odling Odling Odling Centrifugering Kromatografi kolonn Kromatografi Batchvis uppbindning Kolonn Kromatografi Fluidiserad bädd Kromatografi EBA

15 Expanded bed adsorption (EBA) Odling Första reningssteget EBA Målprotein Eluering kan även ske från en expanderad bädd Handhavande Bädden expanderas mha buffert som pumpas underifrån Den övre adaptorn flyttas upp en bit ovanför bädden Cellsuspension med målprotein appliceras Bädden expanderar vanligvis mer Tvätt med buffert tills den buffert som passerar kolonnen går ner i absorbans Buffertflödet vänds och toppadaptorn flyttas ner Eluering sker från packad bädd (oftast) CIP, Cleaning In Place, ofta NaOH och NaCl över natt

16 Expansion Flödet i kolonnen måste vara jämnt, adaptorerna rena och luftfria, viktigast i botten Kolonnen måste stå rakt Celldebris bör passera genom kolonnen, men matrisen ska stanna kvar Matrisens partiklar av olika storlek ( µm) och densitet ( g/cm 3 ) för en jämn distribution i kolonnen Matris Hög densitet nödvändig för att hålla kvar matrisen i kolonnen Höga flöden -> ej för kort kontakttid för målproteinet Agarose med kvarts i för att höja densiteten är den vanligaste matrisen De första försöken på Sepharose, mycket låga flöden Dextran-silika finns också

17 Kolonntvätt-Sanitation Viktigt då man laddar hela celler eller celldelar på kolonnen 0.5M NaOH i minst en timme CIP, Cleaning In Place Jonbytesmatriser och HIC-matriser tål detta, men problem med affinitetsmatriser med proteinligander Råmaterialet DNA-innehållet ger hög viskositet -> bädden blir instabil Anjonbyte -> negtiva laddningar på ytan samt negativt laddadt DNA kan ge kanaler i kolonnen (Benzoase)

18 Matrisen, att tänka på Mycket proteaser i den lösning man pumpar på kolonnen CIP nödvändigt Gruppselektiva ligander med hög stabilitet används ofta, tidigt reningssteg varför mycket hög selektion ej är nödvändigt