Utveckling av reningsmetod för cytokrom c-id1 från Ideonella dechloratans

Transkript

1 Fakulteten för teknik och naturvetenskap Johan Celander Utveckling av reningsmetod för cytokrom c-id1 från Ideonella dechloratans Optimization of a Purification Method for Cytochrome c-id1 from Ideonella dechloratans Kemi D-uppsats Datum/Termin: VT 2012 Handledare: Anna Smedja Bäcklund Examinator: Thomas Nilsson Löpnummer: X-XX XX XX Karlstads universitet Karlstad Tfn Fax Information@kau.se

2 Sammanfattning Syftet med arbetet var att utveckla en metod för att rena fram cytokrom c-id1 ur periplasma från Ideonella dechloratans. Inledningsvis undersöktes proteinets stabilitet vid låga ph. Flera olika kromatografiska metoder provades under arbetets gång. Till de inledande experimenten användes flowthrough fraktioner från rening av annat protein som startmaterial. Senare försök gjordes på periplasma från I. dechloratans. Stabilitetsundersökningen gjordes genom att proteinlösningens spektrum registrerades. Lösningen reducerades sedan med ditionit och ett nytt spektrum registrerades. Ett differensspektrum beräknades och absorbansmaximum vid 550 nm användes som mått på mängden cytokrom c-id1. Undersökningen visade att proteinet är stabilt vid ph ner till 3.0. Första försöken med respektive kromatografisk metod, förutom gelfiltrering, gick ut på att undersöka om proteinet kunde adsorberas till kolonnen eller inte. När proteinet adsorberats till kolonnen ändrades målet med försöken till att försöka eluera det så rent som möjligt. Den slutliga reningsmetoden innehåller tre kromatografiska steg, varav ett behöver optimeras ytterligare för att ge rent protein. Första steget i reningen är katjonbyteskromatografi. Det andra steget är hydrofob interaktionskromatografi och det sista steget är anjonbyteskromatografi. Efter reningen fanns små mängder föroreningar kvar. Två oönskade proteiner, båda i liten mängd fanns kvar i provet. För att få proteinet helt rent krävs ytterligare optimering av reningsmetoden. Störst potential till förbättring finns troligen i steget med anjonbytaren. Misstankar om att proteinet lätt dimeriserar eller reagerar på annat vis under lagring har funnits under hela arbetet. Resultat från bland annat gelfiltrering har indikerat att så är fallet. Arbetet har inte gett svar på om cytokrom c-id1 förändras med tiden eller inte. Bestämning av totala mängden protein samt mängden cytokrom c-id1 efter reningen gjordes. Dessa analyser visar att 69 µg protein, varav 36 µg cytokrom c-id1 återstod efter rening från en odling på fyra liter. Halten cytokrom c-id1 var alltså 52 %. 2

3 Abstract The aim of this study was to develop a method to purify cytochrome c-id1 from periplasmic extract of Ideonella dechloratans. First the stability of the protein at low ph was investigated. Several different chromatographic methods were tested during the study. In the first experiments the starting material was flow through fractions from purification of another protein. Later experiments were performed with periplasmic extract from I. dechloratans. The stability determination was made by recording a spectrum from the protein solution. Proteins were then reduced, by dithionite, and a new spectrum was recorded. A difference spectrum was calculated and the absorbance at 550 nm was used as a measure of the amount of cytochrome c-id1. The investigation showed that the protein is stable at ph 3.0 and higher. The first experiments with each chromatographic method, except gel filtration, were made in order to see whether the protein could be adsorbed to the column or not. When the protein had been adsorbed to the column the target of the experiments changed. The target was then to elude the protein as pure as possible. The resulting purification method contains three chromatographic steps. One of these needs to be further optimized in order to give pure protein. The first step is cation exchange chromatography. The second step is hydrophobic interaction chromatography and the last step is anion exchange chromatography. After purification with this method, small amounts of contaminants were still present. Two unwanted proteins are present, in small amounts. In order to get the protein completely pure further optimization of the method is required. The biggest optimization potential is probably in the anion exchange chromatography step. During this work there have been some indications that the protein easily dimerizes or reacts in some other way upon storage. Results from for example gel filtration have indicated that so is the case. This work has not given an answer to whether cytochrome c-id1 changes upon storage or not. The total amount of protein as well as the amount of cytochrome c-id1 after the purification was determined. The analyses showed that the total amount of protein was 69 µg and the amount of cytochrome c-id1 was 36 µg from four liters of culture. This means that cytochrome c-id1 content after the purification was 52 %. 3

4 Innehåll Sammanfattning... 2 Abstract... 3 Förkortningar... 6 Inledning... 7 Bakgrund... 7 Teori... 7 Syfte Material och metod Undersökning av stabilitet vid låga ph Anaerob odling av Ideonella dechloratans Periplasmapreparation SDS-PAGE Koncentrering av prover Katjonbyteskromatografi Hydrofob interaktionskromatografi Gelfiltrering Anjonbyteskromatografi Kromatografi med mixed mode ligand kolonn Katjonbyte med Mono S Bestämning av proteinhalt Pyridin Hemokrom analys Resultat och Diskussion Stabilitet Katjonbyteskromatografi Hydrofob Interaktionskromatografi Gelfiltrering Anjonbyteskromatografi Kromatografi med mixed mode ligand kolonn Katjonbyte med Mono S Nya försök med anjonbyteskromatografi Bestämning av proteinhalt

5 Pyridin hemokrom analys Slutsats Tack Referenser Bilagor Bilaga 1 Recept PC-medium Anox-medium Chockbuffert

6 Förkortningar 1,3-DAP AmSO 4 cv MES HIC kda LDS SDS SDS-PAGE TMBZ 1,3-diaminopropan Ammoniumsulfat Kolonnvolym(er) 2-(N-morfolino)etansulfonsyra Hydrofob interaktionskromatografi kilodalton Litiumdodecylsulfat Natriumdodecylsulfat SDS-polyakrylamidgelelektrofores 3,3 5,5 -tetrametylbenzidin 6

7 Inledning Bakgrund I vissa industriella processer, som t.ex. blekning av pappersmassa, bildas klorat som biprodukt. Oxoklorater (Perklorat, ClO 4 -, klorat, ClO 3 - och klorit, ClO 2 - ) kan vara skadliga för djur och växter om de kommer ut i naturen (Lehtinen et al. 1988). Därför är det viktigt att man renar det vatten som t.ex. massaindustrin släpper ut så att kloraterna inte släpps ut. Rening av klorater sker idag ofta med hjälp av kloratreducerande bakterier, som reducerar klorat under anaeroba förhållanden. Reningen av klorat skulle underlättas om man kunde få bakterierna att reducera klorat även under aeroba förhållanden. För att få det är kännedom om hur kloratreduktionen går till viktig. En viktig del i kartläggandet av kloratreduktionen är att kartlägga hur elektrontransporten går till i andningskedjan hos de kloratreducerande bakterierna. En av de bakterier som kan reducera klorat till klorid och syre under anaeroba förhållanden är Ideonella dechloratans, som isolerades 1994 från avloppsvatten i Malmö (Malmqvist et al. 1994). Man har tidigare renat fram cytokrom c-id1 ur periplasma från Ideonella dechloratans i små kvantiteter och karaktäriserat det med hjälp av masspektrometri. Utbytet vid rening var dock lågt (Bäcklund & Nilsson 2011). För att kunna utföra vidare analyser av proteinet behövs en metod för rening av proteinet som ger högre utbyte. Ett stort problem vid reningen har varit att proteinet inte adsorberas till katjonbytare vid ph 6.5 som är det som vanligen används. Teori I. dechloratans är en gramnegativ, stavformad bakterie som under anaeroba förhållanden kan reducera klorat. Reduktionen av klorat sker i två steg och ger klorid och syre som produkter. Syret används som elektronacceptor i andningskedjan (Malmqvist et. al. 1994). Reduktionen av klorat sker med hjälp av enzymerna kloratreduktas och kloritdismutas. Kloratreduktas katalyserar reduktionen av klorat till klorit. För den reaktionen krävs två elektroner. Kloritdismutas katalyserar reduktionen av den klorit som bildas till klorid och syre (Danielsson-Thorell et al. 2003). Vissa bakteriestammar kan dessutom reducera perklorat till klorat med hjälp av perkloratreduktas. Perkloratreduktas katalyserar både reduktionen av perklorat till klorat och klorat till klorit. I. dechloratans har inget perkloratreduktas. Cytokrom c-id1 är ett lösligt protein med kovalent bundet hem och molekylvikten ca 9.5 kda. Det transporterar elektroner till två olika enzymer i elektrontransportkedjan. Dels transporterar det elektroner till kloratreduktas men även till terminalt oxidas, cbb 3 oxidas, figur 1. Elektronerna får cytokrom c-id1 troligen från komplex III, bc 1. Kloratreduktas reducerar klorat till klorit och terminalt oxidas reducerar O 2 till H 2 O. Komplex III och terminalt oxidas sitter bundna i cellmembranet medan kloratreduktas är löst i periplasman (Bäcklund 2011, Bäcklund & Nilsson 2011). 7

8 Figur 1: Översikt över elektrontransport hos I. dechloratans.. Ritad av Anna Smedja Bäcklund. Kromatografi är en typ av analysmetod som används för att separera ämnen från varandra. Separationen sker genom fördelning mellan två faser. En mobil fas, vätska eller gas, rör sig över en stationär fas och provmolekylerna separeras genom att de fördelar sig olika mellan de två faserna. Den mobila fasen består oftast av någon form av buffertsubstans löst i vatten. Den kan också bestå av organiska lösningsmedel. Separationen kan ske med avseende på olika egenskaper hos ämnena, t.ex. laddning och storlek. Det finns flera olika typer av kromatografi. De vanligaste är adsorbtionskromatografi, fördelningskromatografi, jonbyteskromatografi, gelfiltrering och affinitetskromatografi. Den mest specifika typen är affinitetskromatografi (Harris 2007). I levande celler finns en stor mängd proteiner med olika funktioner. Många har som funktion att transportera molekyler eller joner, antingen över ett membran eller mellan två molekyler i samma fraktion. Proteiner kan vara antingen vattenlösliga eller membranbundna. De membranbundna proteinerna kan vara transmembranproteiner, proteiner som löper genom ett membran, eller lösliga proteiner vars ena ände är förankrad i ett membran. Gramnegativa bakterier, t.ex. I. dechloratans, har en fraktion mellan cellmembranet och periplasmamembranet. membranet. Denna fraktion heter periplasma och i den finns en stor mängd lösliga proteiner. Ett av proteinerna som hittas i periplasma från I. dechloratans är cytokrom c-id1. Osmotisk chock är ett sätt att extrahera proteiner ur celler. Genom att använda en lösning med hög jonstyrka får man vattnet att lämna cellerna för att jämna ut koncentrationen av lösta substanser i och utanför cellerna. Om man sedan behandlar cellerna med is blir periplasmamembranet permeabelt. När 8

9 bakterierna sedan överförs till en lösning med låg jonstyrka pumpas proteinerna i periplasman ut p.g.a. det osmotiska trycket. Proteiner är uppbyggda av aminosyror som har en central kolatom, α-kolet. Till α-kolet binder en amingrupp, en karboxylsyragrupp, ett väte och en sidokedja, figur 2. Det är sidokedjorna som skiljer olika aminosyror från varandra. Aminosyrorna binder till varandra genom peptidbindning, som är en kovalent bindning mellan karbonylkolet i en aminosyra och kvävet i amingruppen i en annan aminosyra. I vilken ordning aminosyrorna binder till varandra bestämmer proteinets primärstruktur. Bindningar kan ske mellan sidokedjorna på aminosyror som finns nära varandra i primärstrukturen och därigenom bilda strukturelement som kallas sekundärstruktur. Interaktioner mellan dessa sekundärstrukturer ger proteinet sin tertiärstruktur. Om ett protein består av fler än en peptidkedja har det också en tertiärstruktur som beskriver hur kedjorna är positionerade i förhållande till varandra (Petsko& Ringe 2009). Flera av aminosyrorna har sidokedjor som är antingen sura eller basiska. Dessa sidokedjor har olika laddning beroende på lösningens ph. Vid ett specifikt ph tar alla laddningar på sidokedjorna ut varandra så att proteinets nettoladdning blir noll. Den punkten kallas för proteinets isoelektriska punkt, pi. Om ph är lägre än pi har proteinet en positiv nettoladdning och vid ph högre än pi har proteinet en negativ nettoladdning. Även om ph, t.ex. är lägre än pi och proteinets nettoladdning är positiv kan en stor del av ytladdningen vara negativ. Detta sker om de positivt laddade aminosyrorna är positionerade så att det finns negativt laddade utanför. Oftast är proteinets ytladdning och nettoladdning lika. Figur 2: Modell av två aminosyror, sammanbundna med peptidbindning. Sidokedjorna markeras med R. Pilen markerar peptidbindningen. Olika delar av proteiner absorberar UV/VIS strålning vid olika våglängder. Peptidbindningen i sig absorberar vid 254 nm. Vid 280 nm absorberar sidokedjan i aminosyran tryptofan och vid 410 nm absorberar hemgruppen i proteiner som har sådan. Proteiners ytladdning kan utnyttjas för att separera dem från varandra. En metod som används för att separera proteiner med avseende på ytladdning är jonbyteskromatografi. Vid jonbyteskromatografi används en kolonn vars stationära fas innehåller laddade grupper. Proteinerna adsorberas på kolonnen genom elektrostatiska interaktioner mellan laddningarna på proteinerna och grupperna på kolonnen. När allt prov laddats på kolonnen tvättas den med lite startbuffert. På så vis gör man sig av med proteiner som inte adsorberats till kolonnen. Proteinerna elueras sedan genom att jonstyrkan i den mobila fasen ökas, oftast i en gradient med ökande salthalt. Ökningen kan också göras stegvis. När jonstyrkan ökas uppstår en konkurrenssituation mellan proteinerna och saltets joner om bindningsplatserna på kolonnmatrisen. Beroende på hur stor laddning proteinet har elueras det vid olika 9

10 saltkoncentration i gradienten. Ju mindre nettoladdningen på proteinets yta är desto mindre salt krävs för att få det att släppa från kolonnmatrisen och tvärt om. Alltså elueras proteiner med liten nettoladdning tidigt i gradienten och proteiner med större laddning elueras senare i gradienten. Jonbyteskromatografi är användbart för både anjoner och katjoner (Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing: Principles and Methods). En annan kromatografisk metod, som kan användas för att separera proteiner, är hydrofob interaktionskromatografi, HIC, som separerar proteiner med avseende på hur hydrofoba de är. Proteinerna i provet adsorberas på en hydrofob kolonn genom hydrofoba interaktioner mellan matrisen och hydrofoba aminosyror på proteinernas ytor. De hydrofoba interaktionerna förstärks genom att startbufferten och provet innehåller salt. Att hydrofoba interaktioner uppstår beror på att vattenmolekylerna i lösningen inte kan bilda vätebindningar till de hydrofoba ytorna. Vattenmolekylerna bildar då en välordnad yta mot den hydrofoba ytan. Den ordnade ytan ger en minskad entropi. Minskningen av entropi gör att Gibbs fria energi (ekvation 1), för att lösa en hydrofob substans i vatten, är positiv. Att Gibbs fria energi är positiv betyder att förloppet inte sker spontant. När hydrofoba ytor interagerar med varandra minskar entropin och därmed värdet på Gibbs fria energi. Det betyder att interaktioner mellan hydrofoba ytor är den spontana reaktion som sker. Många proteiner har laddade, hydrofila ytor. Det gör att de gärna löser sig i vatten. För att dessa proteiner ska interagera hydrofobt krävs att bufferten innehåller salt som höjer entropin (Queiroz et al. 2001). (1) För att ett protein ska vara kvar i lösningen krävs att en tillräckligt stor del av det har vattenmolekyler bundna till sig med vätebindningar. I en lösning med hög salthalt organiseras vattenmolekylerna runt jonerna i saltet, saltet solvatiseras. Att vattenmolekylerna solvatiserar saltet gör att det blir färre fria vattenmolekyler som kan solvatisera proteinet. Detta leder till att proteinet blir mer hydrofobt och interagerar därför i större utsträckning med den hydrofoba kolonnen. Efter att provet laddats på kolonnen elueras det med en gradient med sjunkande saltkoncentration. Ju mer hydrofobt ett protein är desto mindre behöver det saltet i bufferten för att binda till kolonnen. De mest hydrofoba proteinerna kommer därmed att elueras sist i gradienten (Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography: Principles and Methods). Det salt som oftast används vid HIC är ammoniumsulfat (AmSO 4 ) men även andra salter, som t.ex. NaSO 4, kan användas (Dias-Cabral et al. 2003). Vid rening av proteiner behöver man ibland byta buffert i provet mellan två reningssteg, oftast för att sänka salthalten innan jonbyteskromatografi. Det vanligaste sättet att göra detta är genom dialys. Vid dialys har man provet i en semipermeabel slang som sänks ned i en behållare med den buffert man vill ha provet i efter dialysen, t.ex. startbufferten för nästa jonbytessteg. Små substanser som vatten, buffertsubstanser och salter kan diffundera genom slangen, vilket proteiner inte kan eftersom de är för stora. Tack vare det osmotiska trycket diffunderar buffertsubstans och salter i provet ut ur slangen och buffertsubstans utifrån diffunderar in i den. Detta eftersom samtliga substanser diffunderar mot lösningen där koncentrationen av dem är lägst. 10

11 Renheten på fraktioner som erhålls vid kromatografisk rening kan bestämmas med SDS-PAGE. Vid SDS- PAGE denatureras proteinerna genom att de tillförs natriumdodecylsulfat, SDS, som är en surfaktant med en 12 kol lång kedja och en negativt laddad sulfatgrupp. Den hydrofoba kolkedjan binder till proteinet och eftersom sulfatgrupperna repellerar varandra sträcks proteinet ut. Efter denatureringen laddas proteinerna på en gel bestående av polymeriserad akrylamid. En spänning kopplas sedan över gelen, vilket får de laddade proteinerna att börja vandra mot den positiva änden. Ju mindre proteinet är desto snabbare vandrar det. Eftersom storleken på proteiner är avgörande för vandringssträckan i SDS- PAGE kan metoden även användas för att bestämma storleken på de proteiner som finns i lösningen. I det system som använts under arbetet används LDS i stället för SDS. LDS har samma funktion som SDS men katjonen är litium i stället för natrium. Syfte Syftet med det här arbetet har varit att utveckla en reningsmetod för cytokrom c-id1 så att rent protein kan erhållas från periplasma med så högt utbyte som möjligt. En del av arbetet var att undersöka om proteinet är stabilt vid låga ph samt om det adsorberas till katjonbytare vid låga ph. Tidigare har cytokrom c-id1 inte adsorberats till katjonbytare vid ph 6.5, trots att det har pi 10 och borde vara positivt laddat vid ph 6.5. Den optimerade metoden bör vara reproducerbar för att kunna användas till rutinmässig rening av cytokrom c-id1. 11

12 Material och metod Undersökning av stabilitet vid låga ph Stabiliteten vid låga ph undersöktes genom att en proteinlösning, innehållande cytokrom c-id1 späddes 1:10 med buffert. Som buffert användes MES (ph 6.5 och 6.0), malonsyra (ph 5.5), acetat (ph 5.0, 4.5 och 4.0) eller format (ph 3.5 och 3.0). Ett absorbansspektrum mellan 650 och 350 nm registrerades för den oxiderade formen med hjälp av UV-1601 PC Spektrometer (Shimadzu Scientific Instruments). Proteinet reducerades med NaS 2 O 4 och ett nytt spektrum togs upp. Med hjälp av mjukvaran UVPC (Shimadzu Scientific Instruments) beräknades därefter ett differensspektrum, genom att spektrum för den oxiderade formen subtraherades från den reducerade. Differensen vid 550 nm avsattes som funktion av ph, vilket ger en stabilitetskurva för proteinet. Anaerob odling av Ideonella dechloratans Fryskulturer av I. Dechloratans väcktes genom att 10 µl fryskultur ympades i 5 ml PC-medium (bilaga 1). Kulturen inkuberades sedan i 37 C i Lambda Polynom skakinkubator (New Brunswick Scientific, Edison, N.J. USA) över natt. Nästa dag överfördes var och en av kulturerna till en 100 ml E-kolv med Anoxmedium (bilaga 1). Klorat tillsattes till en slutkoncentration av 0.01 M. E-kolvarna förseglades med lufttäta lock och kulturerna inkuberades under ett dygn i 37 C. Efter inkubationen fördes varje kultur över till en 1 liter flaska med Anox-medium. Locket skruvades sedan på hårt och kulturerna sattes på inkubation ytterligare ett dygn innan de togs till periplasmapreparation. Periplasmapreparation Fyra liter anaerobt odlade dygnskulturer av I. dechloratans skördades genom centrifugering 10 minuter vid x g och 4 C. Efter centrifugering avlägsnades all supernatant och pelleten vägdes. Pelleten resuspenderades sedan i chockbuffert (bilaga 1), 45 ml buffert per 10 g pellet, och homogeniserades med hjälp av Potter-Elvehjem homogenisator (Arthur H. Thomas Company, Philadelphia, Pa., USA). Cellsuspensionen inkuberades 10 minuter i rumstemperatur och centrifugerades vid x g och 4 C under 10 minuter. Supernatanten avlägsnades och pelleten resuspenderades i iskall MgCl 2 (0.5 mm) med hjälp av Potter-Elvehjem homogenistor. Samma volym MgCl 2 som chockbuffert användes. Suspensionen inkuberades 10 minuter på is innan den centrifugerades 20 minuter vid x g och 4 C. Efter sista centrifugeringen sparades supernatanten, vilken är periplasman. SDS-PAGE 9 µl prov och 3µl NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) (Invitrogen Life Technologies, Stockholm, Sverige) blandades i eppendorfrör. Proverna inkuberades 10 minuter i rumstemperatur. Provblandningen (12 µl) applicerades på en NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel (Invitrogen Life Technologies). I en av brunnarna applicerades Markör (8 µl SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard eller 10 µl Novex Sharp Pre-Stained Protein Standard (Invitrogen Life Technologies)). Elektroforesen utfördes 35 minuter (200 V). Efter elektroforesen färgades gelen för att detektera proteiner. För detektion av protein användes Coomassie SimplyBlue SafeStain (Invitrogen Life Technologies), enligt Microwave Protocol. För detektion av kovalent bundet hem färgades gelen med TMBZ och H 2 O 2, genom att 15 mg TMBZ löstes upp i 10 ml etanol. Gelen placerades i en lösning av 21 ml 0.25 M NaAc och 10 ml TMBZ-lösning. Efter ca 30 minuter tillsattes 92 µl H 2 O 2. Efter ytterligare minuter hälldes färglösningen av (Thomas et al. 12

13 1976). För detektion av protein i låga koncentrationer användes SYPRO Ruby Protein Gel Stain (Invitrogen Life Technologies) enligt Rapid Protocol. Samtliga geler fotograferades efter färgning med hjälp av ImageQuant 400 (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Koncentrering av prover Koncentrering av prover utfördes med Amicon Stirred Cell 8050, M.W.C.O (Millipore AB, Solna, Sverige) för volymer mellan ml. För små volymer (0.5 ml) användes Amicon Ultra filter med cut off 3 kda (Millipore AB), 30 minuter vid x g och 4 C. Katjonbyteskromatografi Innan katjonbyteskromatografi dialyserades periplasman mot 50 mm acetatbuffert, ph 4.0. Förhållandet mellan prov och buffert var 1:50 och dialysen pågick under 24 timmar. Dialysbufferten byttes till färsk efter så nära halva tiden som möjligt. Efter dialysen centrifugerades provet 10 minuter vid x g. Katjonbyteskromatografi utfördes med ÄKTApurifier-10 kromatografisystem (GE Healthcare). HiTrap SP FF kolonn (GE Healthcare) användes. För undersökning om vilket ph som var optimalt användes 50 mm acetatbuffert, ph 4.0 och 4.5 samt 50 mm formatbuffert, ph 3.5. Startbuffertarna var saltfria medan elueringsbuffertarna innehöll 1 M NaCl. Gradienterna 0-1 M NaCl över 20 cv och M NaCl över 20 cv provades. När provet laddats på kolonnen tvättades kolonnen med 2 cv startbuffert. Flowthrough och tvättfraktionen samlades var för sig. Under gradienten samlades fraktioner om 1 ml. Hydrofob interaktionskromatografi Innan de laddades på kolonn för hydrofob interaktionskromatografi koncentrerades de fraktioner som poolats efter katjonbyte till ca 4 ml. ph justerades till 7.0 med 1 M Na 2 HPO 4. AmSO 4 tillsattes till koncentrationen 2 M. Provet centrifugerades 5 minuter vid x g. För HIC användes ÄKTApurifier- 10 system (GE Healthcare). Buffertarna som användes var 50 mm fosfat, ph 7.0, både 1 och 2 M AmSO 4 provades i startbufferten medan elueringsbufferten var saltfri. HiTrap Phenyl FF 1 ml kolonn (GE Healthcare) användes. Flow-through fraktion samlades upp. Efter att provet laddats på kolonnen tvättades den med 2 cv startbuffert. Olika gradienter provades, en linjär mellan 2-0 M AmSO 4 och två med ett inledande tvättsteg om 5 cv (1.3 och 1.5 M AmSO 4 ) följt av linjär gradient till 0 M AmSO 4 över 20 cv. Tvättstegen samlades i egna fraktioner och under gradienterna samlades fraktioner om 1 ml. Gelfiltrering För gelfiltreringen användes HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution kolonn (GE Healthcare). En 50 mm fosfatbuffert med ph 7.0 och 0.15 M NaCl användes. Innan försöket jämviktades kolonnen med två cv buffert. 3.5 ml prov laddades på kolonnen. Buffertens flöde var 0.5 ml per minut. Fraktioner om 1 ml samlades under hela försöket. Gelfiltreringen utfördes med ÄKTApurifier-10 system (GE Healtcare). Anjonbyteskromatografi För anjonbyteskromatografin användes HiTrap Q FF 1 ml kolonn (GE Healthcare). Buffertarna var 20 mm 1,3-DAP, ph 11.0, med 1 M NaCl i elueringsbufferten. En gradient mellan 0-1 M NaCl över 20 cv användes. Samtliga försök utfördes med ÄKTApurifier-10 system (GE Healthcare). Innan provet laddades på kolonnen dialyserades det mot startbuffert. 50 gånger så mycket buffert som provets volym användes. Dialysen gjordes antingen under ett dygn med byte av buffert så nära halva tiden som möjligt 13

14 eller också ett dygn och en natt med två byten av buffert. Efter dialys centrifugerades provet 5 minuter vid x g. Kromatografi med mixed mode ligand kolonn Försök gjordes med Capto MMC mixed mode ligand kolonn (GE Healthcare). Kromatografisystemet som användes var ÄKTApurifier-10 (GE Healthcare). Två olika buffertsystem testades. Det ena bestod av 50 mm fosfat ph 7.0 som startbuffert och 20 mm 1,3-DAP, ph M NaCl som elueringsbuffert. Det andra systemet bestod av 50 mm acetat, ph 4.0 som startbuffert och 50 mm fosfat, ph M NaCl som elueringsbuffert. Flödet var 1 ml per minut. Tre olika gradienter, % elueringsbuffert över 20 cv, 0-80 % elueringbuffert över 20 cv och 5 cv tvättsteg med 50 % elueringsbuffert följt av gradient mellan % elueringsbuffert över 20 cv provades. Flow-through och tvättfraktionen samlades var för sig. Under gradienten samlades 1 ml fraktioner. Katjonbyte med Mono S För katjonbyte med Mono S dialyserades provet som vid katjonbyte med HiTrap. Centrifugeringen gjordes 5 minuter i stället för 10. Kolonnen som användes var Mono S 5/50 GL (GE Healtcare). Vid detta jonbyte användes samma buffertar som vid katjonbyte med SP FF kolonn, 50 mm acetat ph 4.0, 1 M NaCl i elueringsbufferten. Flödet var 2 ml per minut. Försök gjordes med gradient M NaCl över 15 cv och 0-1 M NaCl över 20 cv. Försöken utfördes på ÄKTApurifier-10 system (GE Healthcare). Bestämning av proteinhalt Totala halten protein efter vart och ett av reningsstegen bestämdes med hjälp av Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, Sverige). Standarder och working reagent blandades enligt medföljande instruktion. Analysen utfördes enligt Microplate Procedure men absorbansen mättes vid 550 nm. Koncentrationen i respektive prov beräknades med hjälp av upprättad standardkurva. Pyridin Hemokrom analys Halten cytokrom c i var och en av fraktionerna bestämdes med hjälp av pyridin hemokrom analys. En stamlösning med 50 mm NaOH och 20 % (v/v) pyridin samt en 0.01 M K 3 Fe(CN) 6 lösning användes. 50 µl prov, 50 µl stamlösning och 3 µl av K 3 Fe(CN) 6 lösningen blandades i kyvett. Ett spektrum registrerades mellan nm. Lösningen reducerades med ditionit och ett nytt spektrum registrerades. Lösningen reducerades ytterligare och nya spektrum registrerades tills dess att det inte var någon skillnad mellan de två senaste spektrumen. Spektra för den oxiderade formen subtraherades från den reducerade och maximala absorbansen vid 550 nm användes för att beräkna koncentrationen cytokrom c i lösningen. Mängden cytokrom c-id1 beräknades med Lambert-Beers lag och det värde på ε som tidigare rekommenderats (Berry & Trumpower 1987) användes. 14

15 Resultat och Diskussion Stabilitet Stabilitetsundersökningen visade att cytokrom c-id1 är stabilt i lösning vid ph ner till 3.0. Absorbansen varierade något mellan de olika ph värdena men ingen tydlig tendens till nedbrytning kunde ses. Att absorbansen vid 550 nm i provet med ph 3.0 var lägre än övriga kan vara ett tecken på att proteinet håller på att falla ut där. Men eftersom inga mätpunkter finns vid lägre ph än 3.0 kan man inte avgöra om proteinet håller på att brytas ner. Fraktioner vid samtliga undersökta ph analyserades med SDS- PAGE som färgades med TMBZ. Gelen visade liknande intensitet för samtliga band av cytokrom c-id1 utom det vid ph 3.0 som var en aning försvagat. Vid ph 4.0 sågs ingenting. Troligen gick den brunnen tom p.g.a. att något gick fel då provet applicerades i brunnen. Att bandet på gelen vid ph 3.0 var svagare än övriga band är ytterligare en indikation på att proteinet kan vara på väg att brytas ned. Två indikationer på nedbrytning har nu setts vilket inte är oväntat vid så lågt ph som 3.0. Eftersom proteinet visade stabilitet vid låga ph gick undersökningen över till att ta reda på om det adsorberas till katjonbytare vid dessa ph. Katjonbyteskromatografi När periplasman dialyserades föll ett flertal proteiner ut ur lösningen. Vid centrifugering efter dialys erhölls en stor röd pellet. Analys av den på SDS-PAGE visade att den innehåller en mängd olika proteiner. Det protein som fanns i störst mängd var troligen kloritdismutas. Bandet på gelen var av den storlek som förväntas för kloritdismutas. Pelleten var dessutom kraftigt röd vilket tyder på att den innehåller hemprotein, vilket kloritdismutas är. Första försöket på katjonbytare gjordes vid ph 4.0. Proteinet adsorberades till kolonnen och kunde elueras ut med en gradient mellan 0-1 M NaCl över 20 cv. Eftersom fraktionerna med cytokrom c-id1 även innehöll många andra proteiner testades att ändra gradienten till M NaCl över 20 cv. Eftersom detta ledde till att fler föroreningar fanns kvar beslutades att 0-1 M NaCl över 20 cv skulle användas. För att se hur separationen påverkades om ph ändrades testades även ph 3.5 och 4.5. Proteinet adsorberades och eluerades vid båda dessa ph. Separationen förbättrades dock inte och därför beslöts att fortsatta försök ska göras vid ph 4.0. Målet med att testa flera olika ph var att något eller några proteiner skulle adsorberas hårdare eller svagare till jonbytaren och därigenom separeras från målproteinet. När försök gjordes med mer protein i startmaterialet blev kolonnen överladdad. Därför beslutades att byta till 5 ml kolonn. När färre proteiner konkurrerar om bindningarna blir bindningen mellan varje protein och jonbytaren starkare. Därför förskjöts toppen något mot högre salthalt. Inga försök gjordes att optimera separationen med den större kolonnen. Cytokrom c-id1 eluerades mellan M NaCl (19-28 ms/cm), figur 3. För att försöka förbättra reningen ändrades gradienten till M NaCl i stället för 0-1 M NaCl. Fördelen med en flackare gradient kan vara att topparna hamnar längre ifrån varandra men samtidigt blir topparna också bredare. Det är alltid en avvägning vilken av dessa effekter som är viktigast. I det här fallet blev breddningen av topparna för stor i förhållande till avståndet mellan dem och den brantare gradienten var därför den bättre av de två som undersöktes. Målproteinet spreds dock inte över fler fraktioner med den planare gradienten men flera andra proteiner hamnade i samma fraktioner som cytokrom c-id1. 15

16 Figur 3: Kromatogram från katjonbyte (HiTrap SP FF 5 ml kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm) och grön kurva är halten elueringsbuffert (%). Fraktion A6 och A7 poolades för vidare rening. Figur 4: Gel på fraktioner från katjonbyte, färgad med Coomassie SimplyBlue SafeStain (Invitrogen Life Technologies). I brunnarna 1: Markör, SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard (Invitrogen Life Technologies), 2: Fraktion X2, 3-6: Fraktion A5-A8, 7: Fraktion A10 och 8: Fraktion A11. Molekylvikten (kda) för de fyra minsta banden i markören har angetts. 16

17 Fraktionerna A6 och A7 polades och togs vidare för HIC. Även fraktion A8 innehöll en mindre mängd cytokrom c-id1 men då den också innehöll föroreningar som inte fanns i A6 och A7, figur 4, togs den inte med. Målet med första steget i reningen var att få så högt utbyte av målproteinet och samtidigt bli av med största möjliga mängd föroreningar. På grund av de extra föroreningar som fanns i A8 kunde den inte tas med vilket resulterade i minskat utbyte. Hydrofob Interaktionskromatografi Vid försök med 1 M AmSO 4 adsorberades inte cytokrom c-id1 till kolonnen. Slutsatsen av det försöket var att högre salthalt behövdes. Därför gjordes försök med 2 M AmSO 4, då adsorberades proteinet och kunde också elueras. Dock eluerades det tillsammans med de flesta andra proteinerna. För att bli av med föroreningar provades en planare gradient. När inte det hjälpte provades att ta med ett tvättsteg innan gradienten. Tvättstegets syfte skulle vara att stöteluera proteiner som är mindre hydrofoba än målproteinet innan gradienten påbörjades. Först provades 1.3 M AmSO 4 i tvättsteget. Följden av detta blev att cytokrom c-id1 började släppa från kolonnen under tvättsteget. Därför höjdes halten AmSO 4 i tvättsteget till 1.5 M. Följden av det blev att proteinet satt kvar under hela tvättsteget och eluerades i gradienten medan andra proteiner eluerades i tvättsteget. Trots att reningen förbättrats kvarstod en mängd föroreningar i provet. Ytterligare försök med att förändra gradienten gav dock ingen förbättring av renheten och därför ansågs HIC vara optimerad och uppgiften att få bort resterande föroreningar lades i stället på ett tredje steg i reningen. Cytokrom c-id1 eluerades mellan 1.3 och 0.65 M AmSO 4 ( ms/cm), figur 5. Toppen var ganska bred och kom ut vid något varierande saltkoncentrationer i olika försök. Ett annat hemprotein fanns i samma fraktioner som cytokrom c-id1 och detta andra protein eluerades vid något varierande salthalter i olika försök. På grund av variationen hos det andra proteinet var kurvans maximala absorbans inte vid samma salthalt i samtliga försök. 17

18 Figur 5: Kromatogram från HIC (HiTrap Phenyl FF 1 ml kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm) och grön kurva är halten elueringsbuffert (%). Fraktion A3-A10 poolades för vidare rening. Figur 6: Gel på fraktioner från HIC, färgad med specifik hemfärgning. I brunnarna 1:Fraktion X3, 2: A3, 3: A4, 4: A6, 5: A9, 6: A11, 7: A12. När geler med fraktioner från HIC analyserades fanns ytterligare ett protein, utöver cytokrom c-id1, som också kan vara intressant för vidare forskning, figur 6. Detta protein är intressant som en kandidat till att vara det c-cytokrom vars gen man tidigare identifierat i genklustret för kloratrespiration i I. dechloratans 18

19 (Bohlin et al. 2010). Proteinet har en predikterad molekylvikt på 10 kda. Proteinet har ännu inte identifierats i nativ form. Bandet på gelerna som hemfärgats motsvarade ca 10 kda molekylvikt. Gelfiltrering Vid gelfiltreringen erhölls två toppar på kurvan för hemprotein, figur 7. De två topparna var mycket dåligt separerade från varandra. När fraktionerna analyserades på gel visade det sig att båda topparna innehöll cytokrom c-id1. Eftersom koncentrationen av protein var mycket låg erhölls ingen information om totala proteininnehållet på gel. Gelen visade att halten cytokrom c-id1 var högst i den första av topparna. Att två toppar av samma protein erhålls på gelfiltrering är en indikation på att någon typ av heterogenitet hos proteinet kan förekomma. En möjlighet kan vara att proteinet bildar dimerer. Det skulle antigen kunna bilda en homodimer eller dimerisera med ett annat protein. Eftersom cytokrom c- Id1 är det enda hemproteinet som detekteras på gel bör det i så fall inte vara ett annat hemprotein som det dimeriserar med. De dubbla topparna skulle också kunna förklaras med att proteinet delvis brutits ned. Om en liten del kluvits bort från proteinet skulle det resultera i två toppar mycket nära varandra. En sådan nedbrytning borde dock ge två band på gel. Men eftersom proteinet ser ut att ha mindre molekylvikt på gel (ca 6 kda) än det egentligen har (ca 9.5 kda) kan det vara möjligt att man bara får ett band trots att en liten del kluvits bort. Trots att det första försöket med gelfiltrering gav oönskade resultat kan det vara möjligt att använda gelfiltrering i annan form. Om man inte lyckas rena proteinet med ett tredje steg, efter katjonbyte och HIC, kan gelfiltrering bli aktuellt som ett fjärde steg. Om de dubbla topparna orsakades av heterogenitet är det intressant att undersöka vad den heterogeniteten består i. Figur 7: Kromatogram från gelfiltrering (HiPrep 16/60 kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm). 19

20 Anjonbyteskromatografi Vid första försöket med fraktioner från HIC på anjonbytare kom det mesta av cytokrom c-id1 ut i flowthrough och tvättfraktionerna. En liten mängd adsorberades på kolonnen och kom ut under gradienten, figur 8. När fraktionerna undersöktes på gel och färgades med SimplyBlue SafeStain och TMBZ var cytokrom c-id1 det enda protein som detekterades i flow-through och tvättfraktionerna. Dessa fraktioner, samt tre fraktioner från gradienten, koncentrerades därför och kördes på ytterligare en gel. En annan gel kördes med dessa fraktioner och färgades med SYPRO Ruby Protein Gel Stain. Inga spår av andra proteiner kunde ses, varken i flow-through eller tvättfraktionen, på någon av dessa geler. Ytterligare ett försök gjordes med fraktioner från HIC på anjonbytare. Den här gången kom allt cytokrom c-id1 ut i flow-through och tvättfraktionerna. Tyvärr kom också de flesta andra proteiner ut i dessa fraktioner. Eftersom resultatet inte kunde upprepas gjordes försök med andra metoder. Figur 8: Kromatogram från anjonbyte (HiTrap Q FF 1 ml kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm) och grön kurva är halten elueringsbuffert (%). Kromatografi med mixed mode ligand kolonn Vid försök med buffertsystemet bestående av fosfat/1,3-dap adsorberades inte cytokrom c-id1 på kolonnen. Det buffertsystemet förkastades därför. Att proteinet inte fastnade är inte konstigt eftersom det laddas på katjonbytare vid ph 4.0 och på HIC med 2 M AmSO 4. Inget av detta uppfylldes av startbufferten. Vid försök med acetat/fosfat som buffertsystem adsorberades proteinet på kolonnen och det kunde också elueras. Både när gradienten var % och 0-80 % elueringsbuffert kom samtliga proteiner ut i en topp. Dock kunde man se en viss antydan till separation i kromatogrammet då 0-80 % elueringsbuffert användes. Separationen var inte god nog så försök gjordes med ett tvättsteg innan gradienten och sedan en plan gradient. Detta ledde till att några proteiner eluerades i tvättsteget men flera fanns fortfarande kvar och dessa eluerades tillsammans med målproteinet, figur 9Figur 9. 20

21 Separationen mellan topparna i gradienten var inte nämnvärt förbättrad när tvättsteget användes jämfört med innan. Tvättsteget ledde i alla fall till att några proteiner renades bort. Figur 9: Kromatogram från mixed mode ligand kromatografi (HiTrap Capto MMC 1 ml kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm) och grön kurva är halten elueringsbuffert (%). Att separationen inte blev bättre med Capto MMC kan bero på att metoden inte optimerats tillräckligt. Eftersom buffertarna som användes bara innehöll 1 M NaCl är det möjligt att den hydrofoba delen av stationära fasen inte utnyttjades. Vid HIC eluerades cytokrom c-id1 vid ca 1.3 M AmSO 4. Kanske hade bättre separation erhållits med högre salthalt i elueringsbufferten. Det är dock svårt att förutse hur proteinet skulle reagera på ändrade förutsättningar i Capto MMC. Dels uppträder inte alltid proteinet på det förväntade sättet och dels är det svårt att förutspå vad som kommer att hända i en mixed mode ligand kolonn. Detta eftersom blandningen av stationärfas (katjonbytare och HIC) gör att det som eluerar från den ena borde få proteinet att adsorberas till den andra. Hög salthalt borde t.ex. eluera från katjonbytaren men få proteinet att adsorberas till HIC delen. Katjonbyte med Mono S Vid katjonbyte med Mono S erhölls smala toppar och god separation för de flesta proteiner. Cytokrom c-id1 däremot kom i en svansande topp över nio fraktioner och ut i tvättfraktionen efter gradientens slut, figur 10. Denna tvättfraktion hamnade i slasken. En anledning till att toppen svansade kraftigt kan vara att det sitter någon förorening kvar på kolonnen sedan tidigare försök. Därför gjordes blankkörningar och tvättar av kolonnen. Efter att kolonnen tvättats och en blankkörning gjorts där stabil baslinje erhölls under hela gradienten gjordes ett nytt försök med prov. Till andra försöket poolades 21

22 samtliga fraktioner från första försöket som innehöll protein och 5 ml av detta laddades på kolonnen. Denna gång testades gradienten 0-1 M NaCl över 20 cv. Även denna gång erhölls smala toppar för de flesta proteiner men cytokrom c-id1 gav kraftigt svansade toppar även vid detta försök. Att problemet med svansning skulle bero på skadad kolonn utesluts eftersom det bara var ett protein som gav en svansad topp. Det är troligen någon egenskap hos proteinet som orsakde svansningen. En möjlig orsak skulle kunna vara hydrofoba interaktioner mellan proteinet och kolonnmatrisen. Figur 10: Kromatogram från katjonbyte (Mono S 5/50 GL kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm) och grön kurva är halten elueringsbuffert (%). Vid andra försöket med Mono S kom proteinet som kan vara det tidigare eftersökta 10 kda c- cytokromet ut i endast en fraktion, fraktion A6 i figur 10. Denna fraktion koncentrerades med Amicon ultra centrifug filter (Millipore AB) och analyserades på gel. Gelen visade att fraktionen även innehöll andra proteiner även om det misstänkta 10 kda c-cytokromet fanns i störst mängd. Nya försök med anjonbyteskromatografi Proteinerna som fastnade på kolonnen första gången anjonbyteskromatografi provades har troligen mycket liten negativ laddning vid ph Det antagandet grundas i att de kommer ut mycket tidigt i gradienten. Vid andra försöket med anjonbytaren var konduktiviteten i provet ca 3 ms/cm högre än vid första försöket. Att endast mycket små mängder protein adsorberades till kolonnen vid dessa försök stärker teorin om att laddningarna är mycket små. För att lösa detta och få proteinerna att adsorberas till kolonnen kan man göra på två sätt. Antingen kan man höja ph något på provet och buffertarna eller så justerar man dialysen för att om möjligt minska salthalten ytterligare i provet. Genom ökat antal 22

23 buffertbyten i dialysen bör salthalten i provet minska. Den effekten kan också fås om man ökar mängden buffert man dialyserar mot. Att höja ph i buffertarna bör också göra att proteinerna adsorberas hårdare till kolonnen. Efter att andra metoder provats utan att ge positivt resultat provades anjonbytaren igen. Först provades samma förutsättningar som tidigare. Det ledde till att så gott som ingenting adsorberades på kolonnen, precis som vid andra försöket. Ett nytt försök gjordes. Vid det försöket dialyserades provet ett dygn och en natt, med två byten av dialysbuffert, innan det laddades på kolonnen. Vid det försöket adsorberades alla proteiner, även cytokrom c-id1, till kolonnen, figur 11. Samtliga proteiner eluerades tidigt i gradienten. I fraktionen med cytokrom c-id1 kunde bara två andra proteiner ses på gel och båda var i liten mängd. Cytokrom c-id1 eluerades mellan 0.15 och 0.20 M NaCl (6-11 ms/cm). Figur 11: Kromatogram från anjonbyte (HiTrap Q FF 1 ml kolonn). Blå kurva är absorbans vid 280 nm (mau), röd kurva är absorbans vid 410 nm (mau), brun kurva är konduktivitet (ms/cm) och grön kurva är halten elueringsbuffert (%). Fraktion A4 innehåller huvudsakligen cytokrom c-id1. Bestämning av proteinhalt Undersökningen med BCA protein assay kit visade att halten protein minskade efter varje steg. När en standardkurva upprättades var linjäriteten dålig. För att få linjära standardkurvor delades standarderna upp i två kurvor. En kurva gjordes för standarderna mellan µg/ml och en kurva för standarderna mellan µg/ml. Inget av proverna låg i intervallet mellan µg/ml. Halterna protein efter respektive steg visas i tabell I. Att halten efter anjonbyte är högre än efter HIC beror på att den inte gjorts med samma startmaterial. De prover som använts i reningen som ledde fram till anjonbytet har inte sparats. Kromatogrammen vid de försök som sparats hade samma utseende som vid de försök som ledde fram till anjonbytet. Proverna som analyserats ger därför en bra bild av hur 23

24 mängden protein minskar steg för steg i reningen. Ingen information om utbytet i steget med anjonbytaren fås dock. Men eftersom halten protein är hög i provet efter anjonbytessteget kan det antas ha bra utbyte. Tabell II: Mängd protein efter de olika reningsstegen, bestämd med BCA protein assay kit, mängd cytokrom c-id1, bestämd med pyridin hemokrom analys, och kvoten mellan mängd hem och mängd protein. Steg Mängd protein (µg) Mängd cytokrom c-id1 (µg) Andel cytokrom c- Id1 Periplasma Dialyserad periplasma Efter katjonbyte Efter HIC Efter anjonbyte När prov från de olika stegen analyserades med SDS-PAGE, figur 12, sågs att mängden protein minskar i varje steg, precis som BCA visade. Störst mängder protein renas bort i de första stegen, dialys och katjonbyte. I HIC steget avlägsnas endast små mängder protein. Steget med anjonbyte ger i nuläget bra rening men det kan kanske ge ännu bättre rening. Figur 12: Gel som visar renhet efter vart och ett av stegen i metoden, färgad med Coomassie SimplyBlue SafeStain (Invitrogen Life Technologies). I brunnarna 1: Markör, Novex Sharp Protein Standard (Invitrogen Life Technologies), 2: Periplasma, 3: Dialyserad periplasma, 4: Efter katjonbyte, 5. Efter HIC, 6: Efter anjonbyte. Molekylvikten (kda) för de minsta banden i markören har angetts. Pyridin hemokrom analys Pyridin hemokrom analysen visade att mängden c-cytokrom minskar steg för steg i reningen. Analysen visar mängden hem i provet och eftersom cytokrom c-id1 är ett monohemprotein antas förhållandet mellan hem och cytokrom c-id1 vara 1:1. I samtliga prov, utom efter anjonbyte, har andra proteiner än cytokrom c-id1 detekterats på geler som färgats med TMBZ. Både pyridin hemokrom analys och färgning med TMBZ detekterar kovalent bundet hem, vilket gör att mängden hem inte är ekvivalent med 24

25 mängden cytokrom c-id1. Utbytet av cytokrom c-id1 över hela metoden är endast 7.8 %, enligt dessa beräkningar. Andelen c-cytokrom i lösningarna har genom reningen ökat från 0.20 till 0.52 (m/m). Att kvoten mellan mängden protein och mängden cytokrom c-id1 är orimligt hög efter HIC beror med stor sannolikhet på fel i BCA undersökningen. Samtliga kvoter har misstänkt felaktiga värden. Mängden c- cytokrom i respektive fraktion är beräknad med molekylvikten för cytokrom c-id1, vilket gör att halten i de fraktioner som även innehåller andra c-cytokrom egentligen är högre. På den avslutande gelen, figur 12, ser det ut att vara mer än 52 % cytokrom c-id1 efter anjonbytet. Troligen ligger största delen av felet i dessa undersökningar i BCA analysen men även hemokromanalysen kan innehålla missvisande resultat. Eftersom resultaten av båda analyserna kan ifrågasättas är inte heller kvoterna helt tillförlitliga. 25

26 Slutsats Den metod som utvecklats för rening av cytokrom c-id1 innehåller tre steg, varav det sista behöver optimeras ytterligare. Metoden innefattar katjonbyteskromatografi, hydrofob interaktionskromatografi och anjonbyteskromatografi. För att få cytokrom c-id1 helt rent krävs ytterligare arbete. Några olika saker kan vara värda att prova för att få det helt rent. Först och främst behöver fler försök göras med anjonbytaren för att reda ut om det går att upprepa resultaten. Om det visar sig att det senaste resultatet går att upprepa gäller det att bli av med de sista föroreningarna. Kanske kan de avlägsnas med hjälp av gelfiltrering. Föroreningarna ser ut att ha liknande storlek som cytokrom c-id1 på SDS-PAGE men eftersom det är en denaturerande metod kan föroreningarna vara betydligt större i sin nativa form. En undersökning med nativ PAGE skulle ge svar på frågan om föroreningarnas storlek i sin nativa form. Ett annat alternativ kan vara att avlägsna dem genom att optimera gradienten i anjonbytessteget. Alla proteiner elueras i en liten del av gradienten och topparna är mycket smala. Det ger bra förutsättningar för att kunna eluera dem med en planare gradient. Om en planare gradient inte löser problemet kanske en högupplösande kolonn kan vara till hjälp. Med samma förbättring i anjonbytessteget som en högupplösande katjonbytare gav skulle nog cytokrom c-id1 vara rent, förutsatt att det inte svansar på anjonbytaren. När reningsmetoden är maximalt optimerad går forskningen över till att karaktärisera och undersöka cytokrom c-id1 vidare. Bland annat kan det vara viktigt att undersöka hur proteinet påverkas av lagring under tid, t.ex. om det dimeriserar eller bryts ner, vilket vissa försök under arbetet indikerat. 26