Extraktion och isolering av naturprodukter

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Extraktion och isolering av naturprodukter"

Anders Fredriksson
för 8 år sedan
Visningar:

1 Extraktion och isolering av naturprodukter Anders Herrmann 1) Teori och metoder för olika isoleringsarbeten 2) Praktisk isoleringsarbete Vad är en naturprodukt? Alla biologiska molekyler är egentligen naturprodukter, men man brukar generellt avse sekundära metaboliter (mw< 1500) som produceras av en organism men inte har en direkt livsupprätthållande funktion. Jämför med många makromolekyler som proteiner, DNA, RNA etc. som utgör själva maskineriet för livet. RGANISM bservation Selection BILGICAL ACTIVITY Man ska dock komma ihåg att sekundära metaboliter alltid ger någon sorts fördel för organismen. Annars skulle de inte har producerats (Zähner, 1982). Separation Identification Pure substances STRUCTURE Bioassay Correlation Complex biomass Basic research Applications Det kostar mycket energi för en organism att producera sekundära metaboliter! DRUGS HERBAL DRUGS PHARMACL. TLS FUNCTINAL FD Bruhn, J. and Bohlin, L., Drug Discovery Today, 2, , 1997 Claeson, P. and Bohlin, L., Trends in Biotechnology.,15, , 1997

funktion. Jämför med många makromolekyler som proteiner, DNA, RNA etc. som utgör själva maskineriet för livet.

2 i) känd förening med en biologisk aktivitet ii) En speciell organism som producerar en viss substans +? iii) En grupp av föreningar från en organism som tillhör samma substansklass iv) Metaboliter som produceras av en och samma organism men inte produceras av en kontroll ( t ex två växter som växer under olika förhållanden) H H C H H Me Me H 3 C H 3 C H + H

iii) En grupp av föreningar från en organism som tillhör samma substansklass iv)

3 v) Kemisk undersökning av en organisms metabolitproduktion för att t ex klarlägga ekologiska och fylogentiska egenskaper Syfte för isolering av en substans Viktigt att veta då olika mängd och renhet krävs för olika syften då arbetsinsatsen är beroende av denna! Myristicaceae Ej full strukturutredning (MS, jämförelse med ref) Aristolochiaceae Piperaceae Magnoliaceae Annonaceae Me Me H H 3 C H 3 C H H Stabilitetsmätning, kemiska modifieringar etc Full strukturutredning (MS+NMR etc.) Biologisk testning (bioassay) Biologisk karaktärisering Maximal mängd Krav på renhet Kravet på renhet styr vilka isoleringmetoder som kan användas Test om substans finns i fraktion för vidare upparbetning Behöver ej rena bort minsta föroreningar Bekräftelse av förekomst där referensprov finns Full strukturutredning (NMR, MS) % Biologisk testning >99% (föroreningar kan bidra till aktivitet) Renhet vs mängd: Viktiga beslut med eftertanke Inget reningssteg utan förluster! Det kan vara svårt eller t o m omöjligt att gå från 99.5% till 99.9% renhet. Det är därför viktigt att tidigt veta den mängd och renhet man behöver Renhet/mängd vs arbetsinsats/kostnad: Är det värt tid och pengar att få X mg med Y% renhet?!

Myristicaceae Ej full strukturutredning (MS, jämförelse med ref) Aristolochiaceae Piperaceae Magnoliaceae Annonaceae Me Me H H 3 C H 3 C H H Stabilitetsmätning, kemiska modifieringar etc Full

4 min min Kemisk och biologisk assay guidad isolering Kemisk assay: Analys av fraktioner med kemiska analyser Man följer substansen genom isoleringen med t ex TLC, HPLC och MS. Ganska rent och fint? Cleanest cut Biologisk assay: Analys av fraktioner med en biologisk assay. Man följer aktiviteten genom isoleringen. Förlust av ca 20% av materialet! Egenskaper hos din substans Vilka egenskaper hos din förening är viktiga för isoleringsarbetet? i) Polaritet! Pröva att lösa extrakt i olika lösningsmedel med varierande polaritet ii) Syra/basegenskaper! Variera ph i en vattenlösning och se vart substanserna fördelar sig iii) Laddning! Addera olika jonbytarmaterial till alikvoter av vattenaxtrakt iv) Stabilitet! Se om substansens UV/VIS-spektra ändras vid t ex ändrat ph, temperatur, enzymnärvaro etc. v) Storlek! Size-exclusion, MS Ett bra första steg kan vara att köra en HPLC-gradienteluering och jämföra kromatogrammet med tidigare genomförda isoleringsarbeten. Relative abundance (%) Viola odorata ( radix) July Time (min) Relative abundance (%) Viola odorata ( radix) Septemeber Time (min) Variations in cyclotide expression in Viola species M. Trabi, E. Svangård, A. Herrmann, U. Göransson, P. Claeson, L. Bohlin, D.J. Craik * J Nat Prod May;67(5):

Egenskaper hos din substans Vilka egenskaper hos din förening är viktiga för isoleringsarbetet? i) Polaritet!

5 Löslighetstest Löslighet vid olika ph H 2 AcN CH 2 Cl 2 1 ml 1 ml 1 ml ph 3 ph 7 ph 10 Torka in 3x1 ml av extraktet Återlös i vatten, acetonitril och diklorometan MeH MeH MeH 3 ml 3 ml 3 ml Torka in 3x3 ml av extraktet Lös vid tre olika ph Analysera med t ex HPLC Centrifugera och ta vara på supernatanten Torka och lös upp i MeH Analysera med t ex HPLC Strategi för extraktion 3 huvudsteg: Extraktion m alla substanser är av intresse (t ex vid bioassay guidad isolering) använder man en serie av lösningsmedel med olika polaritet. 1) Extraktion (och borttagande av bulk) - t ex borttagande av alla växtdelar efter extration 2) Fraktionering och anrikning av substans av intresse - t ex vätske-vätske extraktion 3) Finputsning/slutlig rening - ofta med högupplösande tekniker som HPLC/AGC H 2 MeH Diklorometan Hexan m man isolerar en känd substans så använder man ett lösningsmedel som substansen löser sig väl i. H 2

Extraktion m alla substanser är av intresse (t ex vid bioassay guidad isolering) använder man en serie av lösningsmedel med olika polaritet.

6 Soxhlet extraktion Typer av extraktion Kylare i) Maceration - utdrag på t ex skakbord i rumstemperatur ii) Dekokt - t ex koka te iii) Ångdestillation - för lättflyktiga föreringar t ex eteroljor iv) Soxhlet - extraktion med återloppskokning Prov Lösningmedel ii) Filtrering i) Ej mättnad ii) Automastiserad Nackdel i) Kräver värme ii) Bara ett lösningsmedel Borttagande av partiklar efter extraktion i) Dekantering Fördelar: Fraktionering Uppdelning av blandning i två fraktioner (vätske-vätske extraktion) Uppdelning av blandning i flera små fraktioner (kolonn över tid) iii) Centrifugering med påföljande dekantering i) Vid råextrakt ii) Snabbare iii) Stora volymer i) Vid renare extrakt ii) Tidskrävande iii) Chans att isolera enskilda substaner

av partiklar efter extraktion i) Dekantering Fördelar: Fraktionering Uppdelning av blandning i två fraktioner (vätske-vätske extraktion) Uppdelning av blandning i flera små fraktioner

7 Kromatografi Kromatografiska tekniker Det finns idag många olika kromatografiska tekniker Men några av de vanligaste som används idag är RP/NP-HPLC, TLC, jonbyteskromatografi, Size-exclusion (gelfitrering), affinitetskromatografi i) Adsorption - HPLC/TLC ii) Laddning - jonbyteskromatografi iii) Storlek - size exclusion iv) Biologisk aktivitet - affinitetskromatografi Detektion vid kromatografi i) UV-detektor - vanligtvis nm ii) Diod-array - hela UV-VIS spekrat iii) Refraktionindex - för substanser som saknar UV-absorbans iv) Masspektrometer - mkt informativt! Alla substanser ger dock inte joner! Gradienteluering vid HPLC Gradienteluering är en mycket kraftfull teknik för slutrening av en isolera substans eller separation av två struktuellt lika substaner, t ex två peptider med två permuterade aminosyror. Principen är att man ökar elueringsstyrkan över tiden genom att öka mängden organiskt lösningsmedel. På så sätt ges små och långsamma förändringar i elueringsstyrkan och även små struktuella skillnader kan utnyttjas.

kromatografi i) UV-detektor - vanligtvis 215-280 nm ii) Diod-array - hela UV-VIS spekrat iii) Refraktionindex - för substanser som saknar UV-absorbans iv) Masspektrometer - mkt informativt!

8 Gradienteluering vid HPLC Gradienteluering vid HPLC Vanlig strategi vid separation avtvå svårseparerade susbstanser: Vanlig strategi vid okänt extrakt: Elueringsmedel A: Elueringsmedel B: 10% acetonitril, 0.05% TFA 60% acetonitril, 0.05% TFA Börja med 0 % B och öka till 100% B över 30 min Elueringsmedel A: Elueringsmedel B: 10% acetonitril, 0.05% TFA 60% acetonitril, 0.05% TFA m substanerna eluerar runt 60% B, börja med 40 % B och gå upp till 75% B över 30 min. På så sätt erhålls en ännu långsammare ökning av elueringsstyrkan. (Jmfr 3.3%-enheter per min med 1.2%-enheter per min d v s 2.8 ggr så långsam gradient) lika HPLC-kolonner Att tänka på vid HPLC-separationer Preparativ kolonn i) m två substanser har samma retentionstid är det mkt troligt att de är samma substans ii) m två substanser ej har samma men liknande retentionstid är det sannolikt att de är struktuellt besläktade iii) En topp som ser ren ut kan ha föroreningar gömda under toppen som ej märks vid UV-detektor. Dessa kan identifieras m h a diod-array eller MS. Semi-preparativ kolonn Analystisk/finpreparativ kolonn Analytisk kolonn Mikroanalytisk kolonn

På så sätt erhålls en ännu långsammare ökning av elueringsstyrkan. (Jmfr 3.3%-enheter per min med 1.2%-enheter per min d v s 2.

9 Extraktion av olika substansklasser i) Alkaloider ii)glykosider iii)eteroljor iv)proteiner Extraktion av alkaloider i) Alkaloider kan lätt renas fram tack vare sitt kväve ii) I sur lösning=laddade, i basisk lösning=oladdade iii) Vätske-vätske extraktioner med basisk och sura vattenlösningar iv) Ger i slutet en blandning av olika alkaloider Kan renas fram individuellt m h a HPLC Se sid 473 i lärobok! N H Extraktion av glykosider i) Neutrala och polära föreningar ii) Består av en socker-del och en aglykon-del iii) Svårare att isolera än alkaloider iv) Använder ofta polära lösningsmedel i vattenlösingar Ångdestillation av eteroljor i) Växtmaterial blandat med vatten ii) Lösningen värms och ångan tar med sig eteroljorna iii) Ångan kyls med kylare och droppar ned in insamlingskärlet iv) Den tyngre oljan lägger sig i botten, vattnet rinner tillbaka till kolven Kylarvatten in Kylarvatten ut Me Me H H Se sid 378 i lärobok Eteroljor Växtmaterial + vatten Värme Vatten

Relevanta dokument

Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd: 090526

Laboration: Isolering av kinin Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd: 090526 Handledare: Patrik Holm 1 Innehållsförteckning Innehållsförteckning... 2 Sammanfattning... 3 Inledning... 3 Utförande...