Kromatografi. Den kromatografiska processen. Fördelar med HPLC - (utförs under högt tryck ca 400 Bar) Vätskekromatografi. Olika former av LC

Transkript

1 Kromatografi Den kromatografiska processen Separationsmetod, där komponenterna som ska separeras, fördelas mellan två faser, en stationär fas och en mobil fas. Injektion 0 min Vätskekromatografi vätska vätska, fast material Fördelar med HPLC (utförs under högt tryck ca 400 Bar) Snabb analys (30 s 1 timme) Hög upplösning ( teor. bottn.) Känslig analysmetod (UV eller fluorescens) Kvantitativa bestämningar Användbar för många typer av prov Även lämplig för preparativt arbete och produktionsskala Inga begränsningar pga molekylers flyktighet, som vid GC Användningsområden för HPLC vitaminer aminer polymerer socker antioxidanter läkemedel pesticider fettsyror m.m... proteiner vaxer steroider nukleotider aminosyror smaktillsatser kolväten livsmedelstillsatser Olika former av LC LLC inert porös massa (diatomejord eller silikagel) impregnerad med den stationära vätskan (får ej lösa sig i mobilfasen) LSC adsorptionskromatografi tex silikagel, aluminiumoxid, aktivt kol 1

2 Olika former av LC (forts.) Jonbyteskromatografi syntetiska jonbytare (styrendivinylbensen copolymerer) m sulfonsyra eller kvartenära ammoniumgrupper Size Exclusion Chromatography porösa geler (sephadex, porasil mm) Storlek Mw Ökande polaritet Ej vattenlösligt Vattenlösligt Fördelning Reversed Normal Adsorption Phase Phase Gelpermeation Exclusion Gelfiltrering Jonbyte 10 6 LLC Jonbyteskromatografi Stationär laddn. Motjon Analyt LSC Size Excl. Chrom. Effektivitet i HPLC Effektiviteten påverkas (förutom tidigare nämnda faktorer) av: Partikelstorlek storlek Bandbreddning utanför kolonnen I injektionssystemet I detektorn I rör och kopplingar HPLCapparatur Avgasning Filtrering 2

3 HPLCapparatur Gradienteluering Motsvarar temperaturprogrammering i GC ens elueringsstyrka ändras under körningen Används för att uppnå bra separation och rimliga retentionstider för prov med stor spridning map elueringsegenskaper Gradienteluering HPLCapparatur Elueringsblandning A 1,2,3,4, Elueringsblandning B Gradienteluering B till A (Samma effekt som vid temp.prog. i GC) 8 HPLCpump Tryck upp t psi (ca 400 atm) Pulsfritt flöde Flöden 0,1 10 ml/min Reproducerbart flöde Tåla många typer av mobilfaser (syra, bas, lösningsmedel mm) Typer av pumpar Kolvpump Höga tryck möjliga Passar gradienteluering Sprutpump Pulsfri Små totalvolymer Pneumatisk pump Pulsfri Begränsat tryck 3

4 HPLCapparatur Loop hög reproducerbarhet, olika volymer möjliga Spruta Slask Loop Loop Loop flöde flöde flöde HPLCapparatur LCkolonnen Gravitation Δp = η L v Θ 2 d p cm 2 10 cm 2 25 cm 2 6 cm HPLC Δp = tryckfall över kolonnen η = viskositet L = kolonnlängd v = linj. hastighet för eluenten (mob. fas) Θ = konstant d p = partikeldiameter d p = μm d p = 3 5 μm HPLCapparatur Kolonner Ofta rostfritt stål Ca 3 30 cm långa Ca 1 10 mm inre diameter Partikelstorlek ca 3 10 μm diameter Silica Alumina Porösa polymerer Jonbytesfaser 4

5 Önskemål för HPLCdetektor Känslig Linjär Robust och pålitlig Kort responstid Lika känslig för alla ämnen Liten detektorvolym Ickedestruktiv Jämförelse mellan LCdetektorer Absorbans (Ultraviolett, UV) Fluorescens Elektrokemisk Refraktionsindex (RI) Selektivitet Selektiv Selektiv Selektiv Universell Detektionsgräns pg fg fg ng Gradientkompatibel Begränsningar Ungefärlig del av HPLCanalyserna Ja Ja Ja Nej Ej UVabsorb. lösn.medel Begränsat dynamiskt område Adsorption, ej elektroaktiva lösn.medel 70 % 15 % 5 % 5 % Låg känsl., temp.kontroll nödvändig LCMS HPLCapparatur kopplad till masspektrometer Strukturbestämning Identifiering Fördelningskromatografi LLC (vätskevätskekromatografi) Bundna faser Stabilare Lägre provkapacitet Normal phase system: Normal phase Reversed phase opolär (tex hexan), stationärfas polär (tex silica med trietylenglykol.) Polära ämnen retarderas mer och elueras m lösningsmedel av tilltagande polaritet Opolär mobilfas Polär mobilfas Reversed phase system: Polär Opolär polär (tex Me/H 2 O), stationärfas opolär (tex bundna C18 grupper) Opolära ämnen retarderas mer och elueras m lösningsmedel av sjunkande polaritet Med. polär Opolär Med. polär Polär 5

6 Metodutveckling Utnyttja samverkan mellan analyter, mobilfas och stationärfas genom val av (polaritet tillräckligt lika analyternas för att uppnå retention) (motsatt polaritet i förhållande till stat.fas) Optimering N längd H flödeshastighet, packning, kolonndiameter, (filmtjocklek), viskositet k (temperatur), mobilfassammansättning, typ av kolonn α (temperatur), mobilfassammansättning, typ av kolonn, specifika kemiska interaktioner Adsorptionskromatografi Jonbyteskromatografi silica eller alumina beroende på analyternas polaritet (oftast opolära) Motjon Jonbyteskromatografi Små joner (tex Ca 2, Na, SO 4 2, Cl ) Jonkromatografi Stora joner (tex peptider, proteiner) Jonbyteskromatografi, exempel Si CH 2 CH 2 SO 3 Katjonbytare Motjon NH 3 CHCO Na HCOO, alanin Sur buffert, ph4 O, fenol Si CH 2 CH 2 CH N 2 Anjonbytare CH 2 NH 4 COO Basisk buffert, ph8 Motjon 6

7 SECsize exclusion chromatogr. Gelpermeation Opolärt system, organiska opolära lösningsmedel Gelfiltrering Polärt system, vattenbaserade mobilfaser SEC Size exclusion chromatography (SEC) Småmolekyler Tensider Polymeradditiver, plastisizers, polyglykoler, epoxider Mol.viktsfördelning av polymerer Enzymer Peptider, proteiner Molekylvikt Pordiameter(Å) Arbetsområde(Dalton) Plan kromatografi Papperskromatografi TLC tunnskiktskromatografi Jmf m papperskromatografi Snabb Högre upplösning Högre känslighet Många typer av stat.faser Tunnskiktskromatografi Vanna 1 2 TLCplatta Plan stationärfas (stationärfasbelagd glas, plast eller metallfolieplatta) flöde Kapillärkraft Tryck Gravitation Elektriskt fält nivå applicering TLCplatta Glas 7

8 TLC er och mobilfaser liknar LC Billigt snabbtest Parallella prover 2Dseparationer möjligt Detektera m.tex jod, UV eller fluorescens Sämre effektivitet jmf m LC Svårt styra mobilfashastigheten GC eller LC? Ofta kan båda väljas GC Flyktiga ämnen Neutrala ämnen Termostabila ämnen LC Svårflyktiga ämnen Termolabila ämnen Joniserade ämnen Val av det.,provupparb.,tidsåtgång, upplösn.krav Miniproblem 1 Du har (i din roll som kromatografispecialist) fått ett prov bla innehållande etylacetat och xylen löst i pentan. Uppdragsgivaren vill i ett första skede se ett snyggt kromatogram med etylacetat och xylentopparna utpekade. Hur går du tillväga (metod, utrustning mm)? Miniproblem 2 Uppdragsgivaren i miniproblem 1 börjar nu bli mer krävande. Han/hon vill nu också att du visar upp en färdig metod för rutinmässig kvantifiering av de nämnda ämnena. Vad gör du? Miniproblem 3 Uppdragsgivaren i miniproblem 1 och 2 återkommer till dig. (Han/hon var väl nöjd med det du åstadkom förra gången.) Den här gången innehåller provet en rad aromatiska föreningar lösta i metanol. Hur gör du? Metod, utrustning mm? Andra kurser i analytisk kemi Nuvarande: Analytisk kemi KD2010 (6 hp) period 3 Organiska och biokemiska analytiska separationer KD2020 (7,5 hp) period 4 Analytiska separationer KD2030 (6 hp) period 4 Prel. inom nya Mastersystemet: Analytical separations (7.5 hp) Delar av Spectroscopic tools for chemistry (9 hp) 8