Uttryck av kloratreduktas och kloritdismutas i Ideonella dechloratans odlade i aerob miljö med tillsatt klorat

Transkript

1 Karlstads Universitet Fakulteten för teknik- och naturvetenskap Avdelningen för kemi Uttryck av kloratreduktas och kloritdismutas i Ideonella dechloratans odlade i aerob miljö med tillsatt klorat Laboranter Natasja Broman Anja Tidman-Fuchs Handledare Miriam Hellberg Laborationsdatum maj 2011

2 Sammanfattning Bakterien Ideonella dechloratans kan använda både syre och klorat som elektroacceptor i andningskedjan. Detta utnyttjas vid bland annat rening av avloppsvatten då klorater är giftiga. I laborationen undersöks uttrycket av två enzymer, kloratreduktas och kloritdismutas, som ingår i andningskedjan för klorater. Bakterierna odlades i aerob miljö med tillsatt klorat och ett periplasmapreparat framställdes. Proteinkoncentrationen bestämdes och en 2Dgelelektrofores utfördes för att separera och undersöka proteinerna i periplasman. Resultatet visar att band kan ses från de heterologa subenheterna med storlekarna 35,5 och 27 kda från kloratreduktas samt från de homologa subenheterna med storlek 25 kda från kloritdismutas. Vid jämförelse med gel från bakterier odlade anaerobt med tillsatt klorat kan slutsatsen dras att nyttjandet av klorat i andningskedjan är en reservmekanism som används då bakterien ej har tillgång till syre. Vid jämförelse med gel från bakterier odlade aerobt utan tillsatt klorat kunde ingen större skillnad ses

3 Innehållsförteckning Sammanfattning... 2 Inledning... 4 Ideonella dechloratans D-elektrofores... 4 Syfte... 5 Metod... 6 Odling av celler och preparation av periplasma... 6 Proteinkoncentrationsbestämning D gelelektrofores... 7 Resultat... 9 Diskussion Referenser

4 Inledning Ideonella dechloratans Ideonella dechloratans är en gram-negativ kemoorganotrofisk bakterie som primärt lever aerobt men kan leva anaerobt med hjälp av klorat som elektronacceptor i andningskedjan [1]. I anaerob miljö andas bakterien genom att först reducera klorat, ClO3 -, till klorit, ClO2 -, med hjälp av kloratreduktas. Klorit omvandlas sedan av kloritdismutas till en kloridjon och syrgas [2], se figur 1. Kloratreduktas är en heterotrimer och dess 3 subenheter har molekylvikterna 94, 35,5 samt 27 kda. Dess teoretiska pi är ca 8,6 (ej experimentellt fastställt). Kloritdismutas är en homotetramer vars subenheter har en molekylvikt på 25 kda. Det har ett teoretiskt pi på ca 9,6 (ej experimentellt fastställt) [3]. Figur 1. Kloratreduktas och kloritdismutas reaktion med perklorater. Perklorat, klorat och klorit förekommer inte naturligt i miljön utan är föreningar som människan har introducerat och de finns i bland annat desinfektionsmedel och blekningsmedel. En stor del kommer från pappers- och massaindustrin där de bildas som en biprodukt vid tillverkningen. Avloppsvattnet renas i syrefria dammar med kloratreducerande mikroorganismer [2]. Avloppsvattnet måste renas då perklorater är giftiga däggdjur genom att de stör sköldkörtelns upptag av jod. Jod är essentiellt för produktionen av sköldkörtelhormoner, brist på dessa kan ge allvariga fysiska och psykiska effekter [4]. 2D-elektrofores 2D-elektrofores används för att separera proteiner med avseende på två olika parametrar; pi (isoelektrisk punkt) och molekylvikt. Proteiner är amfotera molekyler med både sura och basiska grupper. Dessa grupper har olika laddning beroende på om proteinet befinner sig i sur eller basisk miljö. Summan av alla de laddade grupperna bildar proteinets nettoladdning och vid det ph där nettoladdningen är noll har proteinet sin isoelektriska punkt. Det här utnyttjas vid första separationen. En spänning sätts över en gelstrip med en ph-gradient som kan vara rörlig eller immobiliserad. Proteinerna kommer då vandra genom strippen till den ände med motsatt laddning mot proteinets nettoladdning. På grund av ph granienten kommer proteinet stanna vid sitt pi då nettoladdningen blir noll och proteinet inte längre påverkas av den elektriska spänningen. Den andra dimensionen är SDS-PAGE där proteinerna separeras i en polyakrylamidgel med avseende på storlek. SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) denaturerar proteinet och dess långa kolkedja lägger sig längs med polypeptidkedjan vilket ger ett förhållande på ca 1,4 g SDS/g protein. Natrium dissocierar från SDS i bufferten, vilket ger molekylen en negativ laddning, den totala negativa laddningen blir proportionell mot proteinets storlek, se figur 2. Detta gäller enbart proteiner med - 4 -

5 stor skillnad i molekylvikt. Vid liten skillnad i molekylvikt anses laddningsskillnaden vara försumbar. Figur 2. SDS i dissocierat tillstånd. När sedan en spänning läggs över gelen kommer proteinerna vandra mot anoden, hur snabbt de kan ta sig genom polyakrylamidnätet beror på deras storlek. Större proteiner har svårare att ta sig genom nätet och kommer därmed att vandra kortast. Beroende på storlek på gel och ph-gradient kan teoretiskt mer än 5000 proteiner separeras samtidigt, men rutinmässigt separeras ca 2000 proteiner samtidigt. 2D gelelektrofores kan detektera och kvantifiera mindre än 1 ng protein per prick [5]. Syfte I denna laboration ska Ideonella dechloratans odlas i aerobt medium med tillsatt klorat för att bestämma uttryckning av kloratreduktas och kloritdismutas i periplasma, samt jämföra detta resultat med proteinuttrycket från odling av Ideonella dechloratans i aerobt medium utan tillsatt klorat, samt i anaerobt meduim med tillsatt klorat

6 Metod Odling av celler och preparation av periplasma Ideonella dechoratans ympades från fryst stamkultur och prekultiverades i 10 st 15 ml Falcon -rör med ca 5 ml PC-medium (5 g/l Trypton, 2,5 g/l jästextrakt, ph 7,00) i varje rör över natt. Dessa fördes över till en odlingsflaska med ca 0,5 l PC-medium med 10mM klorat tillsatt. OD600 (optisk densitet vid 600 nm) vid t=0 mättes upp till 0,059 i en spektrofotometer (Shimadzu UV-160 1PC). Odlingsflaskan placerades i en skakinkubator (New Brunswick Model G25) på 37 C. OD 600 mättes regelbundet och vid OD 600 0,498 avbröts inkubationen. Cellerna centrifugerades vid 6800 g i 15 min och supernatanten kastades. Pelleten vägdes upp till 1,1 g och slutvolymen beräknades till 4,5 ml/g pellet = 5,0 ml. Pelleten resuspenderades i 5,0 ml chockbuffert (20 % sackaros, 1 mm EDTA, 0,3 M Tris-HCl ph 8,1) och inkuberades i rumstemperatur i 25 min. Därefter centrifugerades cellerna vid 7200 g i 15 min och supernatanten kastades. Pelleten resuspenderades i 5,0 ml iskall magnesiumklorid (0,5 mm) och inkuberades på is i 10 min. Cellenra centrifugerades vid 7200 g i 20 minuter och supernatanten dekanterades av och sparades på is över natt. Proteinkoncentrationsbestämning Proteinkoncentrationen bestämdes med Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) enligt Microplate procedure (sida 3 i kitets tillhörande instruktion). Absorbansen i plattans brunnar avlästes vid 550 nm på en plattläsare (Molecular Devices Emax Precision Microplate Reader). Utifrån standardlösningarnas uppmätta absorbans, se tabell 1, konstruerades en standrardkurva, se figur 3. Med hjälp av standardkurvans ekvation, se tabell 2, beräknades proteinkoncentrationen i periplasmapreparatet, se tabell 3. Tabell 1. Beräkning av standardkurva. Standard c (µg/ml) Absorbans 1 Absorbans 2 Korrigering 1 Korrigering 2 Medelvärde A 2,000 2,214 2,181 2,117 2,066 2,0915 B 1,500 1,941 1,927 1,844 1,812 1,828 C 1,000 1,515 1,451 1,418 1,336 1,377 D 0,750 1,185 1,129 1,088 1,014 1,051 E 0,500 0,737 0,895 0,640 0,780 0,710 F 0,250 0,520 0,539 0,423 0,424 0,4235 G 0,125 0,309 0,320 0,212 0,205 0,2085 H 0,025 0,135 0,155 0,038 0,04 0,039 I 0 0,097 0,

7 2,5 Standardkurva Absorbans 2 1,5 1 0,5 0 R² = 0,9749 y = 1,091x + 0, ,5 1 1,5 2 2,5 Koncentration µg/ml Figur 3. Standardkurva för proteinkoncentration. Tabell 2. Räta linjens ekvation för standardkurvan. k = 1, m = 0, y = kx + m x = (y- m) / k Tabell 3. Beräkning av proteinkoncentration i periplasmapreparat. Spädning Absorbans 1 Absorbans 2 Korrigering 1 Korrigering 2 Medel Beräknad c µg/ml Korrigering för spädning 1:0 2,055 2,06 1,958 1,945 1,9515 1, , :4 0,736 0,741 0,639 0,626 0,6325 0, , :8 0,534 0,544 0,437 0,429 0,433 0, , D gelelektrofores Isoelektrisk fokusering utfördes med kitet ZOOM IPGRunner System (Invotrogen ) enligt kitets medföljande manual. 154 µl IEF-blandning tillreddes enligt tabell 4, varav 140 µl laddades på en strip med ph-gradient 3-10 (LOT nr , Invitrogen). Stipparna kördes enligt program ZOOM Strips ph9-12 Protocol A (sida 27 i manual). Efter utförd IEF frystes stripparna in i -80 C över natt

8 Tabell 4. Recept till IEF Ingrediens Mängd Solubiliser 140,8 µl Amfolyter 0,9 µl Periplasma 9,2 µl dh 2O 3,1 µl BTB 1-3 korn En 0,5 % agarosgel tillverkades för fastgjutning av strippen i gradientgel NuPAGE 4-12 % BT 1,0 (LOT nr , Invitrogen). Under tiden inkuberades IEF-stripparna i 15 minuter på skak i NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen). De proteiner som analyserades är basiska och då hela strippen inte fick plats i gradientgelen klipptes ca 1 cm av strippen bort på den sura sidan innan strippen placerades i gelen. En molekylviktsmarkör (See Blue Plus 2 Prestained Standard, 1x, LOT nr , Invitrogen) tillsattes och PAGEN kördes i MES-buffert (20x : 50 mm MES, 50 mm Tris base, 0,1 % SDS, 0,1 mm EDTA, ph 7,3) spädd till 1x i 200 V i 40 minuter. Gelen färgades med Coomassie Staining (Invitrogen) enligt protokollet SimplyBlue SafeStain Microwave Protocol. Gelen tvättades 3 gånger med 100 ml dh 2O i mikrovågsugn (Husqvarna Micronett, QN4884F) på 1300 W i 45 sekunder. Mellan varje körning i mikrovågsugnen inkuberades gelen på skak i vattnet i ca 1 min. Därefter tillsattes 20 ml SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) och gelen värmdes i mikrovågsugn på 1300 W i 45 sekunder. Gelen inkuberades i färgningsvätskan i 5 minuter på skak. Därefter tvättades gelen i 100 ml dh 2O i 20 minuter på skak. Vattnet byttes till 100 ml nytt dh2o och gelen inkuberades i 5 minuter innan 20 ml 20 % NaCl tillsattes och gelen fick stå på skak täckt med folie över natt. Gelen fotograferades med kamera (ImageQuant 400)

9 Resultat Proteinkoncentrationen i periplasmapreparatet bestämdes till 1,68 µg/ml. Gelen från 2D-elektroforesen, se figur 4, uppvisar två tydliga band för kloratreduktas kring ca kda. För kloritdismutas kan ett band skådas vid ca 25 kda. Figur 4. Bild på gelen. Bandet från kloritdismutas är inringat i lila. Banden från kloratreduktas är inringade i rött. Eventuellt syns ytterligare ett band från kloratreduktas, inringat med blått. Molekylviktsmarkörens storlekar är utmärkta i kda i figuren

10 Diskussion De troliga banden för kloratreduktas och kloritdismutas stämmer inte överens med deras hypotetiska pi. Kloratreduktas har ett hypotetiskt pi på ca 8,6 och kloritdismutas har ett hypotetiskt pi på ca 9,6. Dessa är dock ej experimentellt fastställda utan endast matematiskt beräknade. Vår gel visar att banden från kloratreduktas är mer basiska än bandet från kloritdismutas, se figur 4. Vi har gjort bedömningen att banden ligger som visat trots konflikt med hypotetiskt pi på grund av att storleken på enzymernas subenheter stämmer överens. Kloratreduktas har 3 heterologa subenheter på 94, 35,5 samt 27 kda och kloritdismutas har 4 homologa subenheter på 25 kda. För kloratreduktas syns två band kring ca kda som motsvarar subenheterna 25,5 samt 27 kda, se figur 4 röd markering, och för kloritdismutas syns ett svagt band kring ca 25 kda som motsvarar de 4 homologa subenheterna, se figur 4 lila markering. Ett svagt band kan urskiljas kring ca kda, se figur 4 blå markering, detta kan motsvara kloratreduktasets subenhet på 94 kda. Ett argument för att detta inte stämmer är att detta band är förskjutet mer åt basiskt ph än övriga subenheter från kloratreduktas. Molekylviktsmarkören har även ett band på 3 kda som tyvärr körts ut ur gelen, se figur 4, detta påverkar dock inte våra resultat då samtliga intressanta subenheter har betydligt högre molekylvikt. Markörens stege är sned, vilket kan tyda på spänningen över gelen var för hög vid gelelektroforesen. Detta påverkar möjligheten att mer noggrant kunna avgöra intressanta prickars molekylvikt, men detta anses dock vara försumbart i vårt fall då vi inte ska gå vidare med dessa resultat. Parallellt med vår laboration utfördes även odlingar av Ideonella dechloratans i anaerob miljö i Anox- medium med tillsatt klorat samt aerob odling i PC-medium utan tillsatt klorat, se figur 5. Figur 5. Geler från bakterier odlade i anaerob miljö med tillsatt klorat (A) samt bakterier odlade i aerob miljö utan tillsatt klorat (B). Band från kloratreduktas är utmärkta i rött och band från kloritdismutas är utmärkt i lila. Eventuellt syns ytterligare ett band från kloratreduktas, blå markering. Molekylviktsmarkörens storlekar är utmärkta i kda i figuren

11 Även i dessa geler stämmer banden från kloratreduktas och kloritdismutas inte överens med deras hypotetiska pi, men subenheternas molekylviktsstorlekar stämmer överens, därför antas dessa band vara intressanta. Banden markerat med rött och lila från aerob odling utan tillsatt klorat, se figur 5 B, stämmer mycket bra överens med våra band markerade med rött och lila, se figur 4. Detta syntes tydligt då gelerna lades ovanpå varandra och jämfördes. Även banden markerade med rött och lila på gel från anaerob odling med tillsatt klorat, se figur 5 A, stämmer bra överens, vilket också kunde ses då gelerna lades ovanpå varandra. I både gel A och B i figur 5 kan eventuellt ett svagt band kring kda urskiljas, blå markering, som stämmer bra överens med vårt eventuella band kring samma molekylvikt, figur 4 blå markering. På samtliga geler är dessa band förskjutna och har ett högre pi än övriga band från kloratreduktas. Ideonella dechloratans kan använda både klorat och syre som elektronacceptor i andningskedjan. Banden från kloratreduktas på gel A i figur 5 är betydligt starkare än våra band från kloratreduktas. Detta tyder på att mer kloratreduktas uttrycks i anaerob miljö än aerob miljö, vilket i sin tur tyder på att användandet av klorat som elektronacceptor i andningskedjan är en reservmekanism för bakterien som den utnyttjar då syre ej finns tillgängligt. Detta styrks av att ingen större skillnad i proteinuttryck kan ses vid jämförelse mellan vår gel, se figur 4, och gel från bakterier odlade aerobt utan tillsats av klorat, se figur 5 B. Under laborationens gång kunde inga betydande felkällor observeras som kunde påverkat resultatet, utöver de redan nämnda

12 Referenser 1. Ideonella dechloratans gen. nov., sp. nov., a New Bacterium Capable of Growing Anaerobically with Chlorate as an Electron Acceptor Åsa Malmqvist et. al. System. Appl. Microbiol., 17, (1994) 2. C-cytokromer hos den (per)klorat-reducerande bakterien GR-1 Eva-Lotta Palm. Examensarbete vid Karlstads Universitet, Fakulteten för teknik- och naturvetenskap, Muntlig källa, Miriam Hallberg. Doktorand vid Karlstads Universitet, Fakulteten för teknik- och naturvetenskap, Microbial Perchlorate Reduction: Rocket-fuelled Metabolism John D. Coates, Laurie A. Achenbach. Nature Reviews Microbiology, 2, (2004) 5. Two-dimensional Electrophoresis in Proteome Expression Analysis J.L. López. Journal of Chromatography B, 849, (2007) Loggan för Karlstads Universitet på framsidan är använd med tillåtelse och hämtades från den 20 maj Figur 1, 2 samt 3 är skapade av författarna. Figur 4 och 5 är fotograferade med ImageQuant 400 och redigerade av författarna