Downstream Processing

Transkript

1 Downstream Processing 4 huvudsteg i ett reningsförfarande 1. Förfraktionering Avlägsna fasta partiklar, ex celldebris. Sker via centrifugering, filtrering, sedimentering, flockulering Ställa in ph, jonstyrka. Sker via gelfiltrering eller dialys 2. Produktisolering För att ex reducera vätskevolymen. Utförs med Ultrafiltrering, adsorbering, sedimentering 3. Reningssteg Används för att separera produkten från kontaminanter vilkas egenskaper till stor del liknar produktens 4. Polishing För att få produkten i stabilt, lätt-transporterat, bekvämt format. Använd gärna kristallisering, frystorkning Vissa reningsförfaranden kombinerar flera av dessa steg! Jonbyteskromatografi Den mest frekvent använda proteinreningsmetoden Bygger på laddad interaktion mellan målproteinet i lösning och en fast matris. Beroende av: Lösningens ph Målproteinet och kontaminanternas pka Laddningskoncentrationen hos målproteinet och kontaminanterna 1

2 Jonbyteskromatografi Hög upplösning Hög kapacitet Mångsidig Enkel både i teori och i praktik Kostnadseffektiv Katjonbytare: binder POSITIVT laddade molekyler Matrisen NEGATIVT laddad Anjonbytare: binder NEGATIVT laddade molekyler Matrisen POSITIVT laddad Mekanism Jonbyte 1) Diffusion av jonen (proteinet) till matrisens laddade yta snabbt! 2) Diffusion av jonen (proteinet) in i matrisen 3) Jonbyte på ytan av matrisen, jämviktsprocess 4) Diffusion av den utbytta jonen ut ur matrisen 5) Selektiv desorption av den bundna molekylen mha ph eller laddningsförändring (saltkoncentrationsförändring) av bufferten 2

3 Anjonbyteskromatografi Att tänka på - Jonbyte Högre laddning hos proteinet ger starkare bindning Mer hydrofob omgivning ger starkare interaktion mellan laddade grupper pi hos målproteinet avgör (oftast) vilket ph som fungerar Jonbytarmatrisens laddning ska vara stabil vid det ph man använder ph vid matrisens yta skiljer sig från buffertens med ca en ph-enhet Högre jonstyrka i bufferten ger lägre inbindning - tävlande joner 3

4 His Laddade aminosyror Aminosyra Struktur pka i pka Förekommer proteiner fri % Arg guanidin Asp carboxylat Cys tiol Glu carboxylat His imidazol Lys ε-amino Tyr fenol α-amino amino α-carboxyl carboxylat Laddade grupper sitter oftast på proteinets yta Ibland är de internt koordinerade av metalljoner Observera att posttranslationella modifieringar (PTMs) kan påverka pka pi hos proteiner De flesta proteinerna har ett pi under 7 Basiska proteiner har ett överskott av basiska aminosyror pi sällan över 9.7 Sura proteiner med pi under 5 är också ovanliga Titreringskurvor kan göras för proteiner, ger info om pi och laddningsförändring i olika ph-intervall Vid pka bidrar en aminosyra med laddningen +/-0.5, en ph-enhet från pka är 91% titrerade 4

5 Jonbyteskromatografi - Matrisen Starka jonbytare: Joniserade i ett brett ph-intervall -SO 3 - -N + R 3 Svaga jonbytare: Joniserade i ett smalare ph-intervall - COO- -HN + (CH 2 CH 3 ) 2 Kapacitet Total kapacitet bestäms genom titrering med jonbytande grupper som är tillgängliga (µmol/ml gel) Kapacitet kan också anges i mg protein/ml gel Kapaciteten är mycket proteinberoende 5

6 Eluering Jonbyte Isokratisk eluering används ibland - Provvolymen bör då ej överstiga 1-5% av kolonnvolymen (jmf gelfiltrering). - Bra separation Stegvis eluering - ger mer koncentrerat protein Gradienteluering används oftast - ph Svårt att få stabila ph-gradienter Kommer nära pi för proteinet - Salt Oftast NaCl Bra upplösning Mer utspätt än vid stegvis eluering Affinitetskromatografi Koncentrering och rening i samma steg Bra som första steg i en reningsprocess 6

7 Affinitetskromatografi + Hög specificitet Färre reningsteg Produktproteiner med låg koncentration kan renas - Dyra matriser Få ligander tillgängliga Proteinligander har - oftast - relativt låg stabilitet Tuffa elueringsförhållanden! Affinitetskromatografi två möjligheter: Genfusioner Tag Target Target Tag Nativt målprotein Target + Generell metod för många målproteiner + Fusionssystem finns att köpa (plasmid) - Reningstaggen kan störa + Rening av det nativa proteinet - Affinitetsligand kan vara svårt att få tag i 7

8 Human Protein Atlas Storskalig produktion av antigen (ca ) IMAC generell, effektiv metod Transformering av plasmid Proteinproduktion i E.Coli Rening med IMAC Antigen-del ABP His 6 Antibiotika resistent gen Affinitetskromatografi exempel på ligander Ligand Antikroppar Enzyminhibitorer Lectin Nukleinsyror Hormoner, vitaminer Socker Antigen, ProteinA Rekombinant protein Målprotein Antigen, Cell, Virus Enzymer Polysackarider, Glykoproteiner Proteiner som binder nukleinsyror Receptorer, Bindarproteiner Lectin, Sockerbindande proteiner Antikroppar Utvalt målprotein 8

9 Affibody - rekombinant protein Selekterat mot utvalt målprotein Anti-xxx prod.nr anv.omr mgd pris Affinitetskromatografi Önskvärda egenskaper hos liganden Kunna bilda ett reversibelt komplex med målproteinet Specificiteten bör vara hög Affiniteten måste vara tillräckligt hög för att kunna retardera målproteinet (K a ) Komplexet ska kunna brytas utan att förstöra målproteinet Liganden bör kunna bindas upp på en fast matris 9

10 Affinitetskromatografi Önskvärda egenskaper hos matrisen - Måste innehålla aktiva grupper som liganden kan bli kopplad till - Måste vara stabil under hela kromatograficykeln - Bör ej interagera med de molekyler som finns i startmaterialet - Bör tåla höga flöden - Makroporös för att tillåta att stora molekyler vandrar in i porerna Kopplingskemi NHS-aktiverad matris -NH 2 CNBr-aktiverad matris -NH 2 Aktiverad CH matris -NH 2 Epoxiaktiverad matris -OH -SH (tioeter) -NH 2 Tiolpropylmatris -SH (disulfid) EAH-aktiverad matris -COOH Liten ligand kräver extra eftertanke när det gäller spacerarm för att komma ut från ytan 10

11 Gruppspecifika affinitetsligander Lectiner Används för rening av gykosylerade proteiner Det finns olika lectiner med specificitet för olika sockerarter (glukos, mannos, galaktos ) Protein A & Protein G Används för rening av antikroppar Olika affinitet för olika species och klasser Heparin Används för rening av koagulationsproteiner och även DNA-bindande enzymer Affinitetsrening. Hur? 1. Förfraktionering (se tidigare slide) 2. Inbindning - Tvätt - Eluering - Normalt används bred och kort kolonn, ger snabb separation. Om affiniteten är låg blir proteinet bara retarderat -> kolonnen behöver vara längre - Ibland batchvis inbindning (eluering) - Om inbindningskinetiken är långsam krävs ett långsamt flöde av provet - Låga flöden ger snyggare toppar, mer koncentrerat protein - Gradienteluering om flera bindare finns - Sänkning av ph (2-4) vanligt vid eluering. Sällan, men ibland, höjer man ph - Ibland eluerar man med höjd salthalt - Kompetitiv eluering: låga flöden, annars breda toppar. Detta är en typ av eluering som är skonsam mot målproteinet 11

12 Regenerering Vanligast på labb är att pulsa kolonnen med omväxlande elueringsbuffert och tvättbuffert avsluta genom att jämvikta med startbuffert igen (om rening ska ske inom kort) alternativt storage buffer (för förvaring, innehållande NaAz eller EtOH) Industriellt används 0.1-1M NaOH för att avlägsna bundet material från matrisen. Cleaning in Place CIP cippa kolonnen Detta är ofta ett problem vid affinitetsrening där man har proteinligander på kolonnen de tål normalt ej så höga phn! Kovalent kromatografi 1 S -S - N P -SH Kan användas då målproteinet har en fri cystein Aktivering av matrisen med 2,2 - dipyridyldisulfid 2 S -S - P N H S Reducera målproteinet Bind till gelen, batchvis Tvätta med M NaCl 3 S -S - P R -SH excess Eluera med reduktionsmedel, oftast 10-25mM DTT Tiopyridyl lossnar lättare än proteinet, gradient eller steg 4 S -SH P -SH R- S -S -R Gelfiltrering 12

13 Några väl använda affinitetsvansar ProteinA 31kDa binder IgG elueras med lågt ph Z 7kDa binder IgG elueras med lågt ph ABP 5-25kDa binder HSA elueras med lågt ph GST 25kDa binder glutation elueras med glutation His6 6 aa binder metalljoner elueras med imidazol eller lågt ph Biotin 13kDa binder avidin elueras med biotin FLAG-peptid 8 aa binder till mono- elueras med lågt ph klonal antikropp elleredta svans = tag = reningshandtag Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC - Metallbindande aminosyror (His, Cys, Trp) måste vara exponerade på ytan - Aminosyrornas läge i förhållande till varandra är viktigt - Jon-jon-interaktioner kan inhiberas med rätt buffertval - ph-beroende - Fler elueringssätt finns beskrivna (ph, kompetitiv eluering, organiska lösningsmedel, kelaterande ämnen) 13

14 IMAC När aminosyrainnehållet är känt Närvaro av His/Trp på ytan Me-joner som ger adsorption 1 His Cu 2+ > 1 His Cu 2+, Ni 2+ Kluster med His Cu 2+, Ni 2+, Zn 2+, Co 2+ Flera Trp Cu 2+ IMAC Reningshandtag, His 6 - Genetisk fusion mellan målproteinet och en His 6 -svans - Mycket vanligt vid produktion av rekombinanta proteiner - Enkel, relativt specifik rening som är oberoende av målproteinet - Går att rena vid denaturerande förhållanden, bra då proteinet bildar inklusionkroppar och är allmänt olösligt - Eluering sker med lågt ph eller imidazole (His-analog) 14

15 Expanded bed adsorption (EBA) Odling Första reningssteget EBA - Minimera antalet steg i separationsprocessen - Pumpa materialet på en kolonn direkt från odlingen Målprotein Centrifugering/filtering kan undvikas Eluering kan även ske från en expanderad bädd Handhavande EBA Bädden expanderas mha buffert som pumpas underifrån Den övre adaptorn flyttas upp en bit ovanför bädden Cellsuspension med målprotein appliceras Bädden expanderar vanligvis mer Tvätt med buffert tills den buffert som passerar kolonnen går ner i absorbans Buffertflödet vänds och toppadaptorn flyttas ner Eluering sker från packad bädd (oftast) CIP, Cleaning In Place, ofta NaOH och NaCl över natt 15

16 Expansion EBA Flödet i kolonnen måste vara jämnt, adaptorerna rena och luftfria, viktigast i botten Kolonnen måste stå rakt Celldebris bör passera genom kolonnen, men matrisen skastannakvar Matrisens partiklar av olika storlek ( µm) och densitet ( g/cm 3 ) för en jämn distribution i kolonnen Matris EBA Hög densitet nödvändig för att hålla kvar matrisen i kolonnen Agarose med kvarts i för att höja densiteten är den vanligaste matrisen De första försöken på Sepharose, mycket låga flöden Dextran-silika finns också 16

17 Kolonntvätt Sanitation CIP i allmänhet Speciellt viktigt då man laddar hela celler eller celldelar på kolonnen, vid ex EBA 0.5M NaOH i minst en timme Jonbytesmatriser, EBA och HIC-matriser tål detta, men problem med affinitetsmatriser med proteinligander Råmaterialet Var medveten om eventuella problem med DNA - Innehållet ger hög viskositet -> bädden blir instabil - Anjonbyte -> negtiva laddningar på ytan samt negativt laddat DNA kan ge kanaler i kolonnen 17