Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering

Transkript

1 Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering Teori Vid preparation av ett protein används en rad olika metoder för att specifikt rena fram det önskade proteinet. I vårt fall ska hemoglobin från nötblod isoleras med hjälp av centrifugering, utsaltning och gelfiltrering. Efter reningen registreras proteinets absorption för att mängden preparerat hemoglobin ska kunna beräknas. I blod finns hemoglobin, Hb, i de röda blodkropparna, erytrocyterna, vilka omges av ett semipermeabelt membran. Hemoglobin kan därför lätt separeras från proteinerna i blodplasman genom nedcentrifugering av blodkropparna. För att förbättra reningen tvättas blodkropparna med 0.9 % (isoton) NaCl-lösning. Det är mycket viktigt att denna lösning har rätt salthalt. Om koncentrationen av NaCl är för låg sker hemolys, dvs. vattnet tränger in genom membranet för att utjämna skillnaden i koncentration, varvid blodkroppen sprängs. Detta utnyttjas senare under preparationen för att frigöra hemoglobin ur de tvättade erytrocyterna. Om NaCl-koncentrationen är för hög, skrumpnar cellerna då vatten går ut genom membranet. Proteiner i vattenlösning är hydratiserade. Genom tillsats av stora mängder salt kan detta konkurrera med proteinet om vattnet, varvid proteinerna bildar större aggregat, som inte längre kan vara i lösning. Salter med envärda an- och katjoner, t.ex. KCl, är ganska ineffektiva vid utfällning av proteiner, medan de med högre valens, t.ex. (NH 4 ) 2 SO 4, ger mycket högre jonstyrkor och vanligen är mycket effektiva som fällningsmedel. Ammoniumsulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) är ett salt som ofta används vid proteinutfällning bl.a. på grund av sin stora löslighet. En mättad lösning av (NH 4 ) 2 SO 4 har koncentrationen 4 M. Vid tillsats av 385 mg (NH 4 ) 2 SO 4 per ml hemolysat kommer hemoglobinet att falla ut. Vissa mer lösliga proteiner blir dock kvar i saltlösningen. Genom centrifugering kan hemoglobin separeras från dessa. Fällningen löses i vatten inför det sista reningssteget då hemoglobinet ska separeras från kvarvarande proteinföroreningar och från saltet med s.k. gelfiltrering. Gelfiltrering är en metod, med vilken man kan separera föreningar med avseende på storlek och form. Gelen består av en tvärbunden glukospolymer, som är formad till små kulor. Graden av tvärbundenhet, dvs. porstorleken, och kulornas storlek kan varieras. Molekyler, som är större än de största porerna i gelen, kan inte penetrera gelpartiklarna. De passerar därför genom gelbädden med den rörliga fasen utanför partiklarna och elueras med den s.k. voidvolymen, mellanrumslösningen. Mindre molekyler tränger däremot in i gelpartiklarna och retarderas (bromsas) i olika grad beroende på storlek och form. Molekyler elueras därför i ordning efter minskande molekylstorlek och kan samlas upp i fraktioner, helt eller delvis separerade från varandra. I vårt fall kommer de stora hemoglobinmolekylerna (M= g/mol) inte att 1

2 retarderas.utan att följa med voidvolymen, medan de små jonerna bromsas kraftigt vid passage genom gelen. Material Blod Slangklämmor Graderade centrifugrör av plast 0.1 M KCl Bordscentrifug Gelmassa (Sephadex G-50 medium) Pasteurpipetter, nappar Kolonner+tillbehör 0.9 % NaCl Mättad Ba(NO 3 ) 2 (NH 4 ) 2 SO 4 (s) Stativ, muffar, klämmare Spatlar Tejp Vågskepp Eppendorfrör Mätglas Bägare Moment som utförs i förväg av handledare: Sephadex G-50 Medium får svälla på kokande vattenbad i 0.1 M KCl under 15 minuter eller i rumstemperatur under 3 timmar. Bäddvolymen i färdigsvälld Sephadex G-50 är ca 10 ml/g torr gel. Gelen får sedimentera och dekanteras några gånger för att avlägsna små partiklar, som annars kommer att täppa till gelen, varvid flödeshastigheten minskar. Gelen förvaras i 0.1 % azidlösning i kyl. Vid användning ska den vara rumstempererad och därefter avluftad ca 10 minuter i sugkolv. Kolonner försedda med glasfilter bör syradiskas och ultraljudbehandlas efter användning. Lösningar som görs i förväg av handledare: 0.1 M KCl 0.9 % NaCl mättad Ba(NO 3 ) 2 2

3 Utförande Packning av kolonn Den svällda gelen ska packas i en glaskolonn med 1 cm diameter. Montera kolonnen vertikalt och stäng utloppet. Häll i av den uppslammande gelsuspensionen (görs av handledare). Öppna kolonnen och tillför ekvilibreringslösning (0.1 M KCl) med hjälp av en hävert (flödeshastighet ca 1 ml/min). När gelen har sedimenterat färdigt, ska den vara fri från luftbubblor. Låt ekvilibreringslösning droppa igenom kolonnen under ca en halvtimme, så att gelen blir ekvilibrerad och klar för användning. OBS! Gelen får aldrig torrläggas, då tappar den sin separationsförmåga. När laborationen är slut töms kolonnen med hjälp av tryckluft. Be din handledare om hjälp med detta. Preparation av hemoglobin ut helblod Under tiden gelen ekvilibreras påbörjas preparationen av hemoglobin enligt reningsschemat nedan. 1.5 ml helblod i ett graderat centrifugrör finns förberett. Centrifugera (vikta rören!) och avlägsna supernatanten med en pasteurpipett. Undvik att blåsa bubblor i lösningen. Rör försiktigt upp blodkropparna i isoton NaCl-lösning genom att försiktigt vända röret. Centrifugera och avlägsna supernatanten. Uppskatta volymen blodkroppar och tillsätt dubbel volym avjonat vatten för att hemolysera blodkropparna. Vänd röret för att blanda. Väg upp 385 mg (NH 4 ) 2 SO 4 (s) per ml hemolysat och tillsätt detta till provröret med hemoglobin. Blanda ordentligt så att allt salt verkligen löser sig. Centrifugera och avlägsna supernatanten. Uppskatta volymen utfällt protein. Lös fällningen i tre delar vatten. Centrifugera ner denaturerade proteiner och andra olösliga rester. Denna ska genomgå gelfiltrering för att avsalta och rena hemoglobin. 3

4 Reningsschema 4

5 Gelfiltrering Låt ovanlösningen på kolonnen droppa ur så att vätskan kommer i samma nivå som gelytan. Stäng kolonnen. Applicera försiktigt 0.5 ml av den röda proteinlösningen på toppen av gelen med hjälp av en pasteurpipett. Öppna kolonnen och låt provet sjunka in till i nivå med gelen. Stäng kolonnen. Gör om proceduren, men med elueringsmedel (0.1 M KCl) i stället för proteinlösning, för att tvätta in provet. Fyll kolonnen med KCl-lösning utan att gelen rörs upp. Justera flödeshastigheten till ca 0.5 ml/min. Anteckna hur stor volym (voidvolymen) som samlats upp när det röda hemoglobinet närmar sig utloppet. Fortsätt sedan uppsamlandet i 1.5 ml Eppendorfrör i fraktioner om 1 ml. Fortsätt eluera till minst 2 färglösa fraktioner erhålls. Därefter mäts absorbansen på fraktionerna. Absorbansmätning och påvisande av NH 4 SO 4 Bestäm absorbansen vid 544 nm för de röda fraktionerna. Häll tillbaka proven i resp. Eppendorfrör. Om absorbansen är högre än 1.5 måste en del av provet spädas med avjonat vatten (exakt spädning med hjälp av mätpipett). Påvisa därefter sulfatjoner i alla fraktioner utom den med högst absorbans genom att tillsätta en droppe mättad Ba(NO 3 ) 2 - lösning i varje rör. Anteckna i vilka rör det blir fällning. OBS! Ba(NO 3 ) 2 är giftigt! Hanteras försiktigt och endast på anvisad plats. ε 544 nm = M -1 cm -1 M = g/mol Toppfraktionen märks upp enligt: namn (initialer eller dylikt) datum innehåll koncentration eller uppmätt absorbans Lämna toppfraktionen till handledaren för senare reningsanalys med SDS-PAGE. Ett kromatogram ska konstrueras utifrån absorbansvärdena. Avsätt hemoglobinets absorbans mot elueringsvolym i ml. Ta hänsyn till eventuell spädning av proverna genom att multiplicera det avlästa absorbansvärdet med spädningsfaktorn. Ange också på lämpligt vis i vilka fraktioner (NH 4 ) 2 SO 4 återfanns. Voidvolymen ska ingå i kromatogrammet. Bestämning av ett proteins molekylvikt och renhet med SDS-PAGE Denna laboration går ut på att bestämma molekylvikten för ett protein genom att analysera det med sodiumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores, SDS-PAGE. Detta är en mycket vanlig metod för bestämning av ett proteins renhet. SDS-PAGE används också för att bestämma ett proteins molekylvikt. Som referenser vid analysen används ett 5

6 antal proteiner med kända molekylvikter. Gelfiltrering kan också användas för detta ändamål. Elektrofores bygger på att laddade molekyler vandrar mot en av elektroderna då de placeras i ett elektriskt fält. Polyakrylamidgel är en polymerisationsprodukt av akrylamid och en förgrenare som kallas N,N -metylenbisakrylamid. Vid polymerisationen erhålls ett kontinuerligt, tredimensionellt nätverk genom att växande polyakrylamidkedjor binds samman av bisakrylamiden. För att akrylamid ska polymerisera måste katalysatorer användas så att fria radikaler bildas, vilka initierar reaktionen. Vanligen utnyttjas en blandning av ammoniumperoxodisulfat ((NH 4 ) 2 S 2 O 8 ) och tetrametyletylendiamin (TEMED) för detta ändamål. Polyakrylamidgelens tredimensionella och kontinuerliga nätverk har en bestämd porstorlek och kommer i viss mån att hindra stora och avlånga molekylers vandring. Vandringshastigheten är dessutom beroende av molekylernas nettoladdning. Proteinernas nettoladdning beror på buffertens ph. Om t.ex. ph > pi (isoelektriska punkten för proteinet) är nettoladdningen negativ. Polyakrylamidgelelektrofores, PAGE, separerar alltså molekyler efter laddning, storlek och form. När ett protein behandlas med SDS (sodiumdodecylsulfat) som är en detergent, förstörs sekundär-, tertiär- och eventuell kvartärstruktur, och en cigarrformad peptidkedja med negativ nettoladdning bildas. Nettoladdningen är direkt proportionell mot proteinets storlek och laddningstätheten blir densamma i alla protein-sds-komplex. Detta leder till att komplexen får en elektroforetisk mobilitet som är omvänt proportionell mot logaritmen för molekylvikten, d.v.s. de mindre proteinerna vandrar snabbare än de större. För att bryta disulfidbryggor och för att förhindra att nya bildas behandlas proteinerna dessutom med β-merkaptoetanol. För bestämning av ett proteins molekylvikt används ett antal referensproteiner med kända molekylvikter vid analysen, en så kallad molekylviktsstandard. Dessa appliceras i en separat brunn, men på samma gel som proteinet med okänd molekylvikt. Lämplig mängd att applicera i en brunn är 10 µg protein i 25 µl lösning. Tänk på att slutvolymen i ert beredda eppendorfrör med Hb blir ca 50 µl när provbuffert, β-merkaptoetanol och bromfenolblått tillsats! På denna laboration kommer färdiggjutna geler att användas. Det går bra att gjuta gelerna själv, men man måste då hantera de hälsovådliga kemikalierna, akrylamid och bisakrylamid, i dragskåp. Se riskanalyspärm. 6

7 Molekylviktsstandarden innehåller: Fosforylas b g/mol Serum albumin g/mol Ovalbumin g/mol BCAII g/mol Trypsinhämmare g/mol α-laktalbumin g/mol OBS! De okända proteinerna (anonyma provet) behöver inte vara samma som referensproteinerna. Lösningar Följande lösningar finns färdiga i dragskåpet. Elektrodbuffert: 30.3 g Tris, ph g Glycin 10.0 g SDS Avjonat vatten till 1000 ml utan att justera ph. Förvara vid + 4 o C. Späd 10 gånger före användning. Blanda noga. Provbuffert: 3.55 ml Avjonat vatten 1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, ph ml Glycerol 2.0 ml 10% (w/v) SDS Bromfenolblått: ca 0.05 g Bfb 100 ml avjonat vatten filtrera lösningen Infärgningslösning: Bio-Safe Coomassie G-250 stain (BIO-RAD ) 7

8 Bereds på labtillfället: Beredning av hemoglobinprov: 40 µl provbuffert X µl hemoglobinlösning (rådgör med labhandledare) 2 µl β-merkaptoetanol 10 µl bromfenolblått Blanda i ett Eppendorfrör och gör hål i locket med en blyertspenna eller kanyl. Värm på kokande vattenbad i 5 minuter. Beredning av anonymt prov: 40 µl avjonat vatten 40 µl provbuffert 10 µl proteinlösning (anteckna provets nr o färg) 2 µl β-merkaptoetanol 10 µl bromfenolblått Blanda i ett Eppendorfrör och gör hål i locket med en blyertspenna eller kanyl. Värm på kokande vattenbad i 5 minuter. Ta försiktigt bort den vita tapen och kammen från kassetten. Spara kammen, den ska användas senare. Skölj brunnarna med elektrodbuffert. Placera kassetten i kassetthållaren. Fyll de två buffertkamrarna med elektrodbuffert. (Görs av labhandledare) Applicera prover och referens med automatpipett. En brunn rymmer max 30 µl. Starta och kör elektroforesen vid 200 V. Avbryt körningen när banden med bromfenolblått har vandrat till slutet av gelen. Efter avslutad elektrofores, lossa kassetten från kassetthållaren. Öppna kassettens sidor genom att föra in och försiktigt vrida kammens spets i var och en av inskärningarna i sidorna. Håll plastskivan med gelen upp och ner över en skål med avjonat vatten. Lossa försiktigt gelen med en spatel så att den trillar ner i skålen. Skölj gelen genom att byta vatten några gånger. Låt sedan gelen ligga i vatten ca 5 minuter. (Görs av labhandledare) Färga därefter proteinbanden med Coomassielösning (Bio-Safe Coomassie G-250 stain). Avfärga själva polyakrylamidgelen med vatten som byts 2-3 gånger. Förvara gelen i vatten inför den analys och tolkning av gelen. Ställ skålen med gelen på en ljusramp och mät hur långt referensproteinerna, hemoglobinet från gelfiltreringen samt det anonyma proteinet har vandrat. Konstruera ett diagram där vandringslängderna för referensproteinerna avsätts mot log M. Avläs från 8

9 diagrammet molekylvikten för hemoglobin och för det anonyma proteinet. Av olika anledningar kan ett protein ibland uppvisa flera band. Molekylvikt för hemoglobin: g/mol 9

10 Redovisning Enligt anvisningar tidigare i kompendiet. Dessutom ska följande ingå: 1. Kromatogram, kommentera separationen. 2. Beräkning av koncentrationen Hb i supernatanten som applicerades på gelen i mg/ml. 3. Noggrant avritad eller fotograferad gel. Märk ut vilka brunnar som tillhör labgruppen. 4. Kommentera Hb:s renhet. 5. Log-diagram 6. Beräkning av molekylvikt för preparerat Hb och för anonyma proteinet (ange vilket nummer det hade). Jämför med litteraturvärden och kommentera. 7. Utförlig jämförelse mellan SDS-PAGE och gelfiltrering med avseende på molekylviktsbestämning. Utgå från teorin bakom teknikerna. 10