Analys av nukleinsyra. Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls

Transkript

1 Analys av nukleinsyra Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls

2 Studietips Detta kompendium är INTE en lärobok. Det är inte meningen att man skall kunna läsa kompendiet och förstå innehållet. Ni måste använda kompendiet aktivt, anteckna under föreläsningen, fundera på alla bilder, läsa i läroboken Framför allt krävs att ni repeterar DNAmolekylens egenskaper och labben Detektion av sickle cell anemi i T2. Texten på vissa bilder kan vara oläsbar i kompendiet, men tanken är att ni skall gå in på PingPong och titta på bilderna där

3 Kunskapsmål för detta avsnitt Från kursplan: Studenten skall kunna Förklara grundläggande principer för hur nukleinsyror kan renas och analyseras Tolka resultat av olika analyser

4 Efter avslutad kurs skall studenten kunna: Tillämpa sina teoretiska kunskaper genom att planera och utföra grundläggande molekylärbiologiska metoder utvärdera resultat jämföra för- och nackdelar med olika metoder identifiera vilka moment som kan påverka resultatet.

5 Detta behövs för att bli en bra biomedicinsk analytiker, därför testar vi sådana kunskaper på tentan. Men det är svårare än att memorera fakta, det måste tränas

6 Träna i en egen blogg Varje student skall skapa en egen blogg och göra inlägg på bloggen under labben. Syftet är att: reflektera över vad ni lärt er på labben träna att kritiskt granska resultat uttrycka sig klart och tydligt (bloggen får inte bli en pratigare arbetsbok!) Uppnå kursmålen och klara tentan!

7 Metoder/principer verktyg i molekylärbiologiskt arbete - principer för att rena DNA respektive RNA - huvudsakliga skillnaden mellan Southern och Northern blot exempel på andra analyser där probe används - vilka steg som ingår i en Southern blot - principen för hybridisering med probe - principen för stringenstvätt - principen för Random priming

8 Principer? När vi frågar om principer på tentan menar vi inte HUR man gör, utan VARFÖR man gör så VAD händer Kombinera teori och praktik

9 Repetition DNA molekyl Spiral med två strängar 5 ände och 3 ände. Antiparallella Negativa fosfatgrupper Fosfodiesterbindingar i ryggraden Bryts mha Vätebindningar mellan strängarna Bryts mha Syntes från 5 till 3 ände

10 NÄR VILL MAN ANALYSERA DNA?

11 Hur analyserar man DNA? I princip ingår fyra steg: 1) Rening av DNA (dagens föreläsning) 2) Klyvning till mindre fragment (T2) 3) Separation med gelelektrofores (T2) 4) Sedan gäller det att hitta den gen eller DNA-sekvens man vill påvisa (DFG, Din Favorit Gen) (dagens föreläsning)

12 REP: Restriktionsendonukleas verktyg i molekylärbiologiska metoder Endonukleas= enzym som klyver mellan nukleotider (bryter fosfodiesterbindingar) i en ds DNA Restriktion???????? Aha! Har vissa krav klyver inte var som helst Känner bara igen vissa sekvenser av nukleotiders.k. Igenkänningssekvenser (restriction sites) Ex Eco RI, känner igen sekvensen 5 GAATTC Kan ge sticky ends eller blunt ends på DNAfragmenten

13 Rep: Restriktionskarta för två virus med känd DNA-sekvens DNA är genomet i ett virus med känd DNA-sekvens (49 kb) Fig.4.15 Cooper LÄS! Olika restriktionsenzym, har olika restriktionssites, klyver på olika ställen Möjlighet att klyva DNA molekyler på ett kontrollerat sätt Kan inte välja var klyvning skall ske, men kan ta reda på VAR och varje klyvning ger samma resultat Hur många band ger klyvning Adenovirus genom med Bam H1?

14 Rep:Separation av DNA-fragment 1. Ex. Klyv Adenovirus med: Bam HI (GGATCC) Eco RI (GAATTC) Hind III (AAGCTT) 2. Sätt klyvningslösningen i varsin brunn i en gel 3. Separera med elektrofores 4. Resultat: band som består av massor med molekyler av samma storlek

15 EcoRI digestion and Gel Electrophoresis of DNA (48,5 x 10 3 bp) DNA är genomet i ett virus med känd DNA-sekvens Varför blev det 6 bitar? Vad finns i respektive band? Figure 4.14 Cooper

16 Klyvning och separation av humant DNA 3x10 9 bp Hur ska vi hitta DFG?

17 Hur skall man kunna hitta en specifik DNA-sekvens bland alla andra sekvenser? Kemiskt ingen skillnad. Vad är skillnaden egentligen?

18 Utnyttja att strängarna är Kromosom där vi vill veta om DFG finns komplementära! 3) 2) 1) Hybridiserad probe ger signal

19 Hybridisera med probe Markera målsekvens resp probe!!! Tillverka en probe, dvs en DNA-molekyl som är komplementär till fragmentet med mutation Märk proben så att den kan detekteras Låt proben hybridisera till fragmenten som separerats med gelelektrofores Hybridisering =..

20 Hur kan man identifiera en människa med hjälp av DNA? Läs i Brown kap. 16 eller på DNA interactive DNA profiler

21

22 (GGGCAGGANG) n Se även fig i Brown

23 Klyvning och elfores av genomiskt DNA färgning av all DNA med EtBr eller GelRed Hur kan vi göra för att se tydligare? Visa bara vissa av banden, hybridisera med probe Proben = repetitiv sekvens (GGGCAGGANG ) n

24 Skillnad mellan färgning av all DNA och detektion av vissa fragment med probe Från Alberts, The Cell

25 Genetiskt fingeravtryck Southern blot och Multilocus probing Sir Alec Jeffrey 1984 Läs kap och titta på fig Brown Titta på animering på DNA interactive.org DNA profiler

26 Hur analyserar man DNA? I princip ingår fyra steg: 1) Rening av DNA/RNA (dagens föreläsning) Kallas att göra en DNA-preparation, DNA-prep På lab skall vi rena fram en plasmid från bakterier, göra en plasmidprep. Det tas upp på labföreläsningen.

27 DNA/RNA preparation Rening av DNA/RNA fig. 3.1 i Gene Cloning Lysera celler (får cellextrakt) Cellvägg (när man vill ha bakterie-dna) Cellmembran Använd DNas (om du vill ha RNA) eller RNas Separera DNA/RNA från övrigt cellinnehåll Fig. 3.5 b Koncentrera DNA/RNA Fig. 3.8

28 Lysering fig Lysozym enzymatisk nedbrytning av bakteriecellvägg Ex. Zymolyase EDTA binder Mg2+, som stabiliserar cellväggen Cellväggen luckras upp SDS Sodium Dodecyl Sulphate förstör cellmembran

29 Separation av DNA/RNA från övrigt cellinnehåll Proteinas K bryter ned protein Fenolextraktion ger utfällning av protein Fig. 3.6 eller Kolonn av glas (silica) + guanidin tiocyanat DNA/RNA binds till glaskulor eller glasfibermembran i närvaro av ett chaotropiskt salt. Protein, kolhydrater, lipider, salter mm tvättas bort. DNA/RNA elueras ut med en buffert med låg jonstyrka (låg salthalt) Se labgenomgång och fig i Gene Cloning

30 Koncentrering av DNA/RNA Utfällning (precipitering) av NA mha Etanol NaAc till 0,3 M vol EtOH Isopropanol Centrifugering Tvätt med 70 % etanol supernatanten slängs, pelleten med DNA löses i önskad buffert till lämplig koncentration. Fig. 3.8 i Gene Cloning

31 Kritisk granskning av resultat Kan man vara säker på att man har fått DNA? Kan man vara säker på att alla föroreningar är borta?

32 Absorbans av nukleinsyror ju mer DNA, desto högre absorbans vid 260 nm Koncentration: A260 = 1 motsvarar 50 g/ml dsdna 40 g/ml RNA 33 g/ml ssdna Renhet från protein: A260/A280 = ca 1,8 för rent DNA ca 2 för rent RNA

33 Kontroll av nukleinsyrapreparation Spektrofotometer (sänder ljus genom lösningen) Abs vid 260 nm Abs vid 280 nm Kvoten Abs 260nm / Abs 280nm. Gelelektrofores Storlek (bp) Typ och kvalité av nukleinsyra

34 Svårare att rena RNA än DNA! RNA instabilt, bryts ned kemiskt (hydrolys) och enzymatiskt (RNas) RNas svårt att inaktivera Behöver ingen cofaktor RNas finns ofta i provet Förvaring och behandling av provmaterial mycket viktigt! Använd RNas-fria reagens, DEPC-vatten Guanidintiocyanat denaturerar RNas

35 Kvantifiering av RNA genexpressionsanalys Mycket vanligt att man vill jämföra genuttryck och kvantifiera mrna Viktigt att först kontrollera sin RNA-prep. att RNA inte är nedbrutet (elektrofores) att preparationen inte innehåller ämnen som kan inhibera enzymer i PCR-reaktionerna (absorbansmätning) Om ni skall kvantifiera mrna, läs mer!!!!!!! t.ex. trol.html

36 Kontroll av RNA preparation Separation av totalrna Denaturerande gelelektrofores Varför? Färgning med EtBr/GelRed Vad ser man?

37 Hur analyserar man DNA? I princip ingår fyra steg: 1) Rening av DNA (dagens föreläsning) 2) Klyvning till mindre fragment (T2) Repetera restriktionsenzym från T2 Läs kap i Brown och titta på fig

38 Hur analyserar man DNA? I princip ingår fyra steg: 1) Rening av DNA (dagens föreläsning) 2) Klyvning till mindre fragment (T2) 3) Separation med gelelektrofores (T2) Läs Brown kap och titta på fig

39

40 Hur analyserar man DNA? I princip ingår fyra steg: 1) Rening av DNA (dagens föreläsning) 2) Klyvning till mindre fragment (T2) 3) Separation med gelelektrofores (T2) 4) Sedan gäller det att hitta den gen eller DNA-sekvens man vill påvisa (DFG, Din Favorit Gen) man gör en Southern

41 Southern Blotting (Part 1) 1) 2) Fig Cooper

42 Figure 4.26 Southern Blotting (Part 2) 3) 4) Probe 5) 6) Se även fig Brown

43 Hybridisering (annealing) Balans mellan Proben skall baspara till komplementär sekvens. Underlätta bildning av vätebindingar Proben skall inte binda ospecifikt till ickekomplementära sekvenser. Får inte vara för lätt att bilda vätebindningar Välj betingelser som gör det lagom lätt att bilda vätebindningar. Rätt stringens

44 Träna! Rita in hur proben kan binda både specifikt och ospecifikt dsdna i provet: fyll i 3 sträng! 5 GAGACTAGGCAGAATT 3 Märkt probe; 3 TCTGAT ssdna i provet, 5 GAGACTAGGCAGAATT 3 CT Rita in hur proben kan binda till bägge strängarna!

45 Hur får man proben att binda specifikt? Rätt stringens = Betingelser så att proben binder endast där den är 100 % homolog För låg stringens: Proben binder ospecifikt, dvs där en del av nukleotiderna kan baspara med DNA/RNA i provet Lätt/svårt? att bilda vätebindningar För hög stringens: Proben binder inte ens till målsekvensen där den passar 100% Lätt/svårt? att bilda vätebindningar

46 Denaturering och renaturering av DNA På samma sätt med RNA och komplementär DNA

47 Effekt av värme Tillförande av värmeenergi bryter vätebindningarna i DNA = Värmedenaturering Vid en viss temperatur har 50% av vätebindningarna brutits = Tm värdet (ºC) Vid långsam nedkylning återbildas bindningarna och molekylen återfår sin ursprungliga form = renaturering

48 Tm för ds DNA Vad påverkar Tm-värdet? Tm = 16.6lg[Na + ]+0.41GC /n (n = probelängd) Finns olika formler, beror på probelängd

49 Faktorer som påverkar stringens Temperatur Jonstyrka i hybridiseringslösn. t.ex. 5 X SSC Standard Sodium Citrate en buffert med NaCl och Na-citrat owsection&rid=cell.figgrp.1402

50 Olika prober Om man har en klonad gen kan man göra en lång probe. Kan ha hög stringens Degenererad probe Guessmer Ibland måste man göra en kort probe. Svårare att välja stringens

51 Vad avgör val av stringens? 21bp 21bp 50 bp 100 bp Probens längd (bp) GC- innehåll Homologi (mismatch) BeräknaTm-värde Ofta väljs hybridiseringstemp. utifrån erfarenhet Ca: Tm ºC - 25 ºC 65 ºC är vanligt

52 Stringenstvätt Efter hybridisering sköljs membranet med buffert för att tvätta bort ospecifikt bunden probe 1) Börjar med en buffert med låg stringens t.ex. 2 x SSC och rumstemp 2) I nästa tvätt höjs stringensen t.ex. 0,5 x SSC och 65 ºC

53 Detektion Proben måste ha några nukleotider som är märkta, möjliga att detektera efter hybridisering och stringenstvätt Man måste därför tillverka en märkt probe

54 Inmärkning/syntes av probe Syntes av ny sträng En av nukleotiderna är märkt Den nya strängen kommer att innehålla märkta nukleotider Efter hybridisering kan proben detekteras

55 Inmärkningsmetoder Hur gör man ny sträng med märkta nukleotider? Långa templat t.ex. klonad gen Random priming (tas upp på labgenomgång) Nick translation Ändinmärkning oligonukleotider 3 märkning 5 märkning PCR

56 Ändinmärkning 5 06_04.jpg

57 Vad kan man märka nukleotider med? Radioaktiva isotoper Mycket känslig 32 P (dat 32 P) 35 S (används vid sekvensering) Icke radioaktiva metoder Digoxigenin Biotin

58 Icke radioaktiv 06_06.jpg detektion princip Probe inmärkt med reporter R Målsekvens på membranet Detta gås igenom på labgenomgången

59 Reporter: Digoxigenin, Biotin 06_07.jpg 06_07_2.jpg

60 Detektionsmetoder hur detekterar man reportern? Radioaktiv probe Autoradiografi Icke radioaktiv probe Enzymatisk färgreaktion Fluorescens Chemiluminiscens, ECL

61 Tillämpningar där hybridisering med probe används Genkloning Screening av genbibliotek Genexpressionsstudier In situ hybridisering Microarray RealtidsPCR Tidigare även RFLP och DNA fingerprint Ersatts med PCR

62 Southern blot Probens sekvens OBS! proben sitter inte i plasmiden Storleksmarkör Vart tog alla banden vägen???