DUGGA Molekylärbiologi T2 / VT p (G = 25 p)

Transkript

1 KORTSVARSFRÅGOR 1. Restriktionsenzymet BamHI klyver sekvensen 5 -G*GATCC-3 och lämnar 4 basers 5' överhäng. Rita upp det längsta DNA-fragmentet som bildas efter klyvning av nedanstående given sekvens med BamHI (3p). * = Klyvningssite 5 -GTTCTGGATCCTCGCTATCTGAATTCAGGATCCGATCAA-3 3 -CAAGACCTAGGAGCGATAGACTTAAGTCCTAGGCTAGTT GATCCTCGCTATCTGAATTCAG GAGCGATAGACTTAAGTCCTAG Vilket enzym använder RNA som templat vid syntes av DNA? (1p) Reverse transcriptase. 3. Vilken är den främsta skillnaden mellan DNA polymerase från E coli och Taq polymerase? (2p) Taq polymeraset är värmestabilt upp till c:a 100 C medan enzymet från E coli denatureras vid betydligt lägre temperatur (<65 C). 4. Hur många PCR-produkter har man efter 5 cykler om man startar med en templatmolekyl genomiskt DNA? (1p) 1*2 5 =32 1

2 5. Rita en tillväxtkurva för bakterier och namnge de olika tillväxtfasena. (3p) should have lag, log and stationary phases labelled. 6. Pyrosekvensning och Sangersekvensning är två metoder för att bestämma DNA sekvenser. Nämn en fördel med vardera metod. (2p) Pyrosekvensning är snabbare, Sanger ger längre sekvenser. 7. I pyrosekvensningstekniken används enzymet nucleotidase. Vilken är dess funktion? (1p) to degrade unincorporated nucleotide and ATP. 8. När används pulsed field gelelektrofores? (2p) När stora DNA-fragment ska separeras (>100 kb). 2

3 9. Vad får man för information från kromatin immunoprecipitation analys (ChIP assay)? (1p) Om proteinet som testas binder till en specifikt DNA region i en cell. 10. Beskriv hur en ChIP fungerar. (3p) Crosslink protein with DNA in cells with help of formaldehyde. Sonicate to break DNA into small pieces. Precipitate protein-dna complex with specific antibodies. Reverse crosslink Purify DNA Analyze DNA with PCR or real time PCR 11. Ange två metoder som kan användas för att studera protein:protein interaktioner och beskriv kortfattat en av dem. (4p) jäst två-hybridsystemet, mammalie två-hybridsystemet, GST-pulldown, coimmunoprecipitation, Chip med re.chip, FRET, 12. Beskriv kortfattat principen för microarray analys! (3p) Method to measure RNA levels. Immobilized array of probes on a glass slide. Amplification/Labeling of target material (RNA) Hybridization ie Probe/target formation. Scanning and analysis of signals ( intensity proportional to the amount of the initial RNA in the sample) 13. Vad är en transient transfection? (2p) Transfektion där DNA inte integreras i genomet. 14. Vad används in situ hybridisering till? (1p) In situ hybridisering används till att detektera specifika mrna i en vävnad. 3

4 15. Vad är en reportergen? (2p) En gen som används för att studera reglerande sekvenser hos en annan gen i celler. Aktiviteten hos en bra reportergener är lätt att mäta. 16. Du vill amplifiera sekvensen nedan med PCR. Ange sekvensen på de två primers som kan använda. (4p) 5 -TGACCTATGGAATTGCCACTTGCAGGCCATTTTGGGGTAAT AAATAAGCAAAATAATACCAACGCAGAGAGAGCTAGCTAC TTTATGTCGAGTCCACGCTGTGCCATGATCATAGCACATC-3 primer 1: 5 - TGACCTATGGAATTGCCACT primer GATGTGCTATGATCATGGCA 4

5 BERÄTTARFRÅGOR 17. Nämn minst tre enzymer som används för kloning av DNA-fragment till plasmider och ange även kort dess roll i den processen. (5p) Type of Enzyme Restriction Endonucleases Alkaline Phosphatase Activity Bacterial enzymes that bind to specific DNA sequences and cut them in a particular way Removes 5 phosphate groups of DNA molecules T4 DNA ligase Catalyzes the formation of a phosphodiester bond between juxtaposed 5' phosphate and 3' hydroxyl termini in duplex DNA or RNA. Klenow Fragment Filling in recessed 3' ends of DNA fragments : (meaning removal of overhangs to create blunt ends) 5

6 18. Du har klonat en promotor och vill nu identifiera vilka proteiner som kan binda till den. Hur kan du göra detta?(5p) DNaseI footprinting to identify binding sites. Comparison of the binding sites with a database for transcription factor binding sites. EMSA with the identified labelled binding sites and either cell extracts or purified suspected proteins. In case of cell extract, the suspected proteins have to be identified by supershift with specific antibodies. Specificity can be shown by competition with unlabelled nucleotides and the use of labelled scrambled sequences. And/or ChIP assay with antibodies against the suspected protein and primers to amplify the binding region. 19. Beskriv hur Cre-loxP systemet fungerar och ange två tillfällen då det brukar användas. Rita gärna figur. (5p) Cre-loxP systemet är utvecklat från bakteriofag P1 och används ofta för att göra konditionella knockouter. Det kan också användas för att ta bort selectionsmarkörer (neo) efter selektion av ES-celler eller i transgenteknologin för att reducera antalet kopior av transgenen. Cre är ett enzym, ett recombinase, som orsakar rekombintion mellan två loxp sites (en 34 bp lång sekvens). Detta resulterar i att sekvensen mellan två loxp sites avlägsnas och endast ett loxp site blir kvar. 6