TFKE32/TFKI09/9KEA21. Laboration i Genteknik

Transkript

1 TFKE32/TFKI09/9KEA21 Laboration i Genteknik

2 Denna laboration består av tre delar: A. Restriktionsklyvning av plasmiden pcantab samt konstruering av restriktionskarta. B. Preparation av plasmiden pcantab från E.Coli C. Transformering av lacz (β-galactosidas) och ampicillinresistens innehållande plasmiden puc18 till E. Coli

3

4 A. Restriktionskarta av pcantab Restriktionsklyvning samt separation av DNA-fragment Material: pcantab (minst 35 μl med konc. 100 ng/μl) Restriktionsenzymer: EcoRI BamHI HindIII Samtliga med konc. 2 U/μL. OBS! Förvara på is hela tiden! NEB buffert Laddningsbuffert Sterilt avjoniserat/destillerat vatten Molekylviktsstandard (10, 8, 6, 5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 kilobaspar) Sterila eppendorfrör och pipettspetsar 70 % etanol Skyddshandskar Värmeblock Bordscentrifug Agaros 10x TBE (1 L: 108 g Tris, 7.2 g EDTA, 55 g Borsyra, ph 8.4) SyberSafe

5 1. Provberedning för restriktionsklyvning Varje labbgrupp gör en av klyvningarna nedan! Det är viktigt alla klyvningar görs,så att en restriktionskarta kan konstrueras. Totalvolym: 20 μl Prov nr BamHI EcoRI HindIII BamHI+EcoRI BamHI+HindIII HindIII+EcoRI Vatten 12 μl 12 μl 12 μl 11 μl 11 μl 11 μl NEB buffert 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl pcantab 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl Enzym 1 μl 1 μl 1 μl μl μl μl - Tillsätt lösningarna uppifrån och ner i tabellen samt blanda vid varje tillsatts. Märk rören väl! - Blanda och centrifugera i ca 15 sek. - Inkubera i 37ºC, 1 h. (använd värmeblocket) 2. Gjutning av agarosgel (görs endast av en labbgrupp) - Väg upp 1 g agaros och lös i 100 ml 1xTBE - Värm försiktigt i mikrovågsugn tills lösningen är helt flytande (1-1½ min). - Tillsätt 10 µl av SyberSafe lösningen och blanda om. - Låt lösningen svalna till ca 60ºC och gjut sedan agarosgelen (ca 5 mm tjock). - Låt gelen svalna i minst 30 min. Nu är det dags att börja med plasmidpreparationen! 3. Provberedning för elektroforetisk separation på agarosgel - Blanda 4 μl laddningsbuffert med 10 μl klyvd plasmid. - Blanda 4 μl laddningsbuffert, 10 μl oklyvd plasmid. Ett prov behövs, förbereds av en labgrupp!

6 - Blanda 4 μl laddningsbuffert med 10 μl av den preparerade plasmiden. 4. Elektroforetisk separation av DNA-fragmenten - Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1xTBE så att det täcker gelen. - Applicera 5 µl av molekylviktsstandarden i en av brunnarna. - Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett. - Separera DNA-fragmenten genom att lägga på en spänning på 75 Volt. (Kom ihåg att DNA är negativt laddat). - Avbryt separationen när färgmarkörerna är separerade på gelen. - Fotografera gelen och mät vandringen av DNA-fragmenten med linjal. Redogörelse Rita en graf där log baspar är avsatt mot vandringslängden för molekylviktsstandard-fragmenten. Bestäm storleken (antal baspar) på fragmenten från alla (6 st) klyvningar av pcantab samt bestäm storleken på den oklyvda plasmiden. Sammanställ en restriktionskarta för pcantab där klyvningsställen i relativa positioner för alla tre restriktionsenzymerna finns med.

7 B. Preparation av plasmid Material: Falconrör med bakteriepellet Qiaprep spinnkolonnkit Autoklaverade eppendorfrör och pipettspetsar Sterilt vatten Utförande För preparationen av plasmid kommer ett färdigt kit att användas (Qiaprep spinnkit). Detta kit bygger på att plasmid DNAt renas på en minikolonn där DNAt binds upp på en silicagel. Dagen innan plasmidpreparationen har övernattskulturer av E. Coli med den önskade plasmiden i iordningställts.odlingsrören innehåller 5 ml LB-medium och ampicillin. Till detta har satts en bakteriekoloni, innehållande önskad plasmid från en LB-Amp-agarplatta från en tidigare transformation. Odlingarna har fått växa över natt i 37 ºC med skak. (Detta görs av labhandledaren) 1. Varje laborationsgrupp erhåller ett 50 ml rör med bakteriepellet. (odlat enligt ovan) 2. Resuspendera pelleten i totalt 250 μl Buffer P1. Lös upp cellerna helt och för över suspensionen till ett eppenforfrör. 3. Sätt till 250 μl Buffer P2. 4. Blanda genom att vända röret försiktigt ett par gånger, cellsuspensionen (blir blå och) ska klarna nästan omedelbart. 5. Tillsätt 350 μl Buffer N3 och blanda genast genom att vända röret försiktigt några gånger. Det ska bildas en vit fällning i röret och lösningen ska bli färglös. 6. Centrifugera rpm 10 min för att samla fällningen på rörväggen. 7. Föröver supernatanten ner i kolonnen. Inget vitt får följa med. Det går bra att använda en pipett med steril pipettspets. Se till att kolonnen sitter i ett plaströr. 8. Centrifugera rpm i 1 min.

8 9. Häll bort vätskan från röret. Tillsätt 750 μl PE Buffer och centrifugera rpm i 1 min. 10. Häll bort bufferten från röret och centrifugera en gång till. 11. Flytta över kolonnen till ett sterilt eppendorfrör. 12. Tillsätt 50 μl sterilt vatten och låt stå 1 min. 13. Centrifugera rpm 1 min. Se till att rören sitter bra i centrifugen, dvs viktat mot varandra med locket på eppendorfröret i korrekt position för att få en jämn viktbalans i centrifugen. Det är risk att locket går sönder och flyger av annars! Renhet och kvalitet på plasmiden analyseras på agarosgel tillsammans med klyvningsprodukterna. Återvänd till restriktionsklyvningen! Redogörelse Enkelt flödesschema som visar vad som händer i de olika stegen och var de olika komponenterna (celler, cellrester, kromosomalt DNA och plasmid) befinner sig och kort vad som händer vid tillsats av de olika buffertarna. Kommentera provets renhet och kvalitet utifrån resultatet av agarosgelen. Beskriv kort principen för agarosgelelektrofores.

9 C. Transformation av plasmid Material: LBA-agarplattor LBAX-agarplattor LBAI-agarplattor LBAXI-agarplattor (A - ampicillin, X Xgal, I - IPTG) LB-medium IPTG Plasmid puc18 (innehållande genen för β-galactosidas och ampicillinresistens) E. Coli XL1-Blue competent cells Utförande, värmechock Varje grupp sprider transformeringen på en typ av agarplatta! Se till att alla typer av agarplattor används inom labskiftet. 1. Tina de superkompetenta XL1-Blue cellerna (E.Coli). Cellerna ska tina på is! 2. Till en 50 μl portion av E.Coli tillsätts 1 μl plasmid (plasmiden puc18 fås av labhandledaren). 3. Blanda försiktigt med pipettspetsen och inkubera på is 30 min. 4. Värmechocka cellerna genom att placera rören i ett värmeblock 45 sek vid 42ºC, placera sedan rören på is i 2 min. 5. Tillsätt 200 μl av förvärmt (42ºC) LB odlingsmedium och inkubera transformationsreaktionen 1 timme i 37ºC. 6. Sprid ut 100 µl av transformationsreaktionen på en agarplatta. 7. Dagen efter transformationen (ca h) kontrolleras plattorna. Uppskatta andelen blå och vita kolonier på agarplattorna. Redogörelse Redovisa bakterietillväxten på de fyra olika agarplattorna. Beskriv varför ni ser kolonier och även hur de blå kolonierna uppkommer. Beskriv även kortfattat principen för värmechockning och varför man gör en inkubering efter.

10

11 Appendix Restriktionsenzymer typ II Igenkänningssekvens (palindromsekvens) samt klyvningsställe ( ) HindIII (Haemophilus influenzae Rd, III) 5' A A G C T T 3' 3' T T C G A A 5' BamHI 5' G G A T C C 3' 3' C C T A G G 5' EcoRI 5' G A A T T C 3' 3' C T T A A G 5' Samtliga enzymer ger klyvning med sticky ends (single stranded overhang). Om klyvningen sker på samma ställe bildas blunt ends (utan single stranded overhang). Laborationsredogörelsen ska, förutom de punkter som anges under respektive laborationsavsnitt, innehålla: Inledning Metodbeskrivning Resultat Diskussion Eventuella felkällor Maila rapporten till tfke32@ifm.liu.se i doc-format. Behåll kommentarer från labhandledaren vid retur. Rapporterna återfås via mail. Redogörelsen ska vara inlämnad senast 7 dagar efter utförd laboration. Även returer ska vara inlämnade inom 7 dagar från återlämningsdatum. Rapporten rättas max 3 gånger, dvs maximalt 3 st inlämningar!