Försök till att lösa degraderingsproblem vid preparation av fotosystem I-subenheten PSI-N genom att använda proteasinhibitorer och olika sorters lysis

Transkript

1 Halmstad Högskola Sektionen för Ekonomi och Teknik Försök till att lösa degraderingsproblem vid preparation av fotosystem I-subenheten PSI-N genom att använda proteasinhibitorer och olika sorters lysis Trying to solve degradation problem when preparing PSI-N from the photosystem I complex using protease inhibitors and different kinds of lysis Linda Jedenheim och Johanna Eriksson Examensarbete i kemi 15 hp Handledare: Lars-Gunnar Franzén Examinator: Marie Mattsson

2 Sammanfattning Fotosyntesen kallas den process som omvandlar ljusenergi till kemisk energi. Fotosyntesen sker i tylakoidmembranet och drivs av två stora proteinkomplex, fotosystem II (PSII) och fotosystem I (PSI) då de tillförs energi i form av fotoner. PSI-N är ett mindre protein på ca 10 kda som ingår i PSI. På något sätt, som ännu inte är klarlagt, samverkar PSI-N med PSI-F och plastocyanin när det dockar till PSI. Det är därför av viktigt att rena fram större mängder av PSI-N för att få djupare kunskaper om proteinet samt dess struktur och funktioner. Tidigare undersökningar har utförts i ämnet och ett fusionsprotein innehållande PSI-N har uttryckts i Escherichia coli (E.coli). Problem har dock uppstått efter lysis av cellerna då det har visat sig att fusionsproteinet har degraderats. Vårt examensarbete strävar efter att rena fram intakt fusionsprotein med hjälp av, framför allt, mekanisk lysis och proteasinhibitorer. Abstract The process where light is converted into chemical energy is called photosyntesis. The reaction takes place in the thylakoid membrane and is driven by two major protein complexes, photosystem II (PSII) and photosystem I (PSI) when energy in form of photons are received. PSI-N, a subunit in PSI, is a smaller protein with a mass of approximately 10 kda. In some way, which is not yet clarified, PSI-N collaborates with PSI-F and plastocyanin when plastocyanin is docking to PSI. It is therefore important to purify larger amounts of the protein to acquire deeper knowledge of its structure and function. In earlier research the PSI-N protein has been expressed in Escherichia coli (E.coli). The problem has been degradation of the fusion protein after lysis. Our goal with this project is to obtain the purified protein intact using mechanic lysis and protease inhibitors. 1

3 1. Introduktion Material och metoder Allmänna metoder Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, tidsstudier med kemisk och mekanisk lysis Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt tidsstudie Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater (Biospec Products) samt tidsstudie Rening av A1-A3 (från avsnitt 2.3) och B1-B3 (från avsnitt 2.4) med affinitets kromatografi Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) och LB innehållande ampicillin samt tidsstudie Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater (Biospec Products) och LB innehållande ampicillin samt tidsstudie Rening av A1-A3 (från avsnitt 2.6) och B1-B3 (från avsnitt 2.7) med affinitets kromatografi Resultat Resultat från 2.2: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, tidsstudier med kemisk och mekanisk lysis Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) innehållande proteasinhibitorer med EDTA Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) innehållande proteasinhibitorer utan EDTA Lysis med Bead Beater (Biospec Products) Resultat från 2.3: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt tidsstudie Resultat från 2.4: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater samt tidsstudie Resultat från 2.5: Rening av A1-A3 och B1-B3 med affinitets kromatografi Rening av A1-A3 som lyserats med Bug Buster Master Mix (Novagen) Rening av B1-B3 som lyserats med Bead Beater (Biospec Products) Resultat från 2.6: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt tidsstudie Resultat från 2.7: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater (Biospec Products) samt tidsstudie Resultat från 2.8: Rening av A1-A3 och B1-B3 med affinitets kromatografi Diskussion Diskussion Slutledning Namnförklaringar Referenser Appendix Recept på lösningar Kromatogram från rening av fusionsproteinet som lyserats med Big Buster Master Mix (Novagen) Kromatogram från rening av fusionsproteinet som lyserats med Bead Beater (Biospec Products)

4 1. Introduktion Fotosyntesen hos växter, alger och cyanobakterier producerar både syre och organiskt material från vatten och koldioxid. Fotosystem I och II (PSI, PSII) är två stora transmembranproteiner som driver elektrontransporten framåt då de tillförs energi i form av fotoner. PSII oxiderar vatten, elektrondonatorn, till O 2 och fyra protoner. Elektronerna fortsätter via plastoquinoner, cytokrom b6/f komplexet till plastocyanin och vidare till PSI, som driver elektrontransporten vidare med hjälp av solenergi. Elektronen kommer till slut till ferredoxin-nadp + -oxidoreduktas, på stromasidan av tylakoidmembranet, där NADP + reduceras till NADPH. Elektrontransportkedjan resulterar även i att en protongradient bildas över membranet. Protongradienten driver syntesen av ATP från ADP och oorganiskt fosfat av komplexet ATP-syntas. I mörkerreaktionen används ATP och NADPH för att bilda kolhydrater genom reduktion av koldioxid [1]. PSI i växter består av minst 19 proteinsubenheter, runt 175 klorofyllmolekyler, 2 fylloquinoner samt 3 Fe 4 S 4 -kluster. Man har än så länge lyckats identifiera 15 kärn subenheter, PSI-A till PSI-L och PSI-N till PSI-P och en antenn, LHCI, som kan bestå av upp till 6 Lhca-proteiner. I den vanligast förekommande indelningen av PSI består proteinkomplexet av de femton subenheterna och fyra Lhca proteiner. Strukturen och läget för 12 av de 15 subenheterna är kända via röntgenkristallografi [2]. PSI-N heter en av subenheterna som finns på lumensidan och har en massa på 9,7 kda. Den samverkar med PSI-F vid bindningen av plastocyanin till PSI [2]. Hur den samverkan går till är ännu inte helt klarlagt. Man har dock upptäckt att hastigheten för elektronöverföringen mellan plastocyanin och PSI minskar med ungefär 40% då genen för PSI-N, PsaN, är inaktiverad. Två scenarier har framlagts som möjliga; antingen samverkar PSI-N direkt med plastocyanin eller, kanske troligare, med PSI-F [1]. Fd FNR PSI-D F B PSI-C F A PSI-E STROMA F X 5 nm Lhca2 Lhca3 PSI-K PSI-H PSI-I PSI-L PSI-O PSI-A A 1 PSI-F PSI-J PSI-B PSI-G Lhca1 Lhca4 STROMA LAMELLA A 0 P700 Pc PSI-N THYLAKOID LUMEN Bild 1. Schematisk bild av PSI. Med tillstånd från Henrik Vibe Scheller (2007) 3

5 2007 tog Rökaeus fram 5 olika plasmidkonstruktioner som alla innehöll genen för PSI-N. Dessa transformerades in i E.coli för att proteinet skulle kunna uttryckas. Endast en av de fem konstruktionerna lyckades då det resulterade i ett vattenlösligt fusionsprotein som var baserat på vektorn pet32 Xa/LIC. Fusionsproteinet hade ett klyvningssite för proteas faktor Xa som borde göra det möjligt att separera PSI-N från resten av fusionsproteinet. Dock visade det sig att det fanns ett site för faktor Xa även inne i PSI-N, vilket medförde att man ej fick ut ett helt protein [4]. Ek & Halltorp satte då in ett site för TEV proteas i pet32-vektorn. Detta skulle medföra en mer specifik klyvning och lösa problemet med degraderat PSI-N protein. De konstruerade 4 olika expressionssystem som innehöll PSI-N. Två system kallade A och B konstruerades först. I konstruktion A har en TEV primer med en extra Glycin använts och i konstruktion B har en TEV primer utan extra Glycin använts. Konstruktion A gjordes för att TEV proteaset, enligt information, skulle klyva mer effektivt. Konstruktion A och B transformerades in i två olika typer av E.coli stam, BL21 (DE3) och BL21 (DE3) plyss, som är en kloramfenikolresistent stam. Deras försök att konstruera pet32-vektorn med site för TEV lyckades och klyvning av fusionsproteinet har utförts flera gånger med lyckade resultat med Ek & Halltorps konstruktion B i BL21 (DE3) av Bengtsson [5][6]. Bengtsson gick vidare med konstruktion B i BL21 (DE3) och försökte att klyva och rena fram PSI-N med TEV proteas och affinitets kromatografi. Framställningen av TEV proteas lyckades utan svårigheter, men framställning av PSI-N visade sig vara en större utmaning. Tidigare hade framställning av PSI-N proteinet gjorts i liten skala, men när Bengtsson skalade upp försöken upptäckte han att proteinet degraderades efter lysis. Ett antal band upptäcktes på gelerna som inte kunde tillskrivas vare sig PSI-N eller resten av fusionsproteinet [6]. Degraderingsproblemet måste lösas innan man på ett tillfredsställande sätt kan rena fram PSI- N. Konstruktion B i BL21 (DE3) som Bengtsson fortsatte sina försök på används även till att försöka lösa degraderingsproblemen. Genom att tillsätta proteasinhibitorer med och utan EDTA samt att lysera cellerna på mekanisk väg hoppas vi kunna få fram ett intakt PSI-N protein. 4

6 2. Material och metoder 2.1 Allmänna metoder SDS-gelelektrofores: Två olika geler användes % Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. Som standard användes Kaleidoscope Prestained standards. Till proverna användes Tricine-prov buffert. Som buffert användes anod- och katodbuffertar (Se recept i appendix 7.1). Proverna fick Tricine-prov buffert tillsatt till sig, 1:1, och fick stå i 80ºC i 5 min för att proteinerna skulle denaturera. Tag bort plast och kam från gelen. Brunnarna laddades med 10 µl prov med färg/brunn med den minsta pipetten, 10µl standard i en till två brunnar samt 10 µl SDS i de brunnar som eventuellt var tomma. Katodbufferten i mitten och anodbufferten utanför insatsen. Elektroforesen började med att gelen fick gå i 30 min med 30 V, sedan med 100 V i 120 min. Fixera i 40% (v/v) metanol och 10% (v/v) ättiksyra i 30 min på skakbord. Sedan färgades gelen i 50 ml Bio-Safe Coomassie G-250 Stain i 1 timme på skakbord. Till sist tvättades gelen i avjonat vatten i 2 timmar på skakbord % Tris-HCl, BIO-RAD, Ready Gel. Som standard användes SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range. Till proverna användes SDS laddnings buffert (se recept i appendix 7.1). Som buffert användes SDS-running buffert (Se recept i appendix 7.1). Proverna fick SDS laddnings buffert tillsatt till sig, 1:1, och fick stå i 80ºC i 5 min för att proteinerna skulle denaturera. Tag bort plast och kam från gelen. Brunnarna laddades med 10 µl prov med färg/brunn med den minsta pipetten, 10µl standard i en till två brunnar samt 10 µl SDS i de brunnar som eventuellt var tomma. SDS running buffert hälldes i och utanför insatsen. Elektroforesen gick i en timme vid 165 V. Sedan tvättades gelen i 3x5 min i avjonat vatten. Efter det färgades gelen i en timme i 50 ml Bio-Safe Coomassie G-250 Stain på skakbord. Slutligen tvättades gelen i avjonat vatten. Kromatografi (Kromatograf: ÄKTAprime plus, GE Healthcare. Kolonn: Histrap FF ): För de proteinreningar som beskrivs i den här rapporten följdes instruktionsboken för ÄKTAprime plus och reningsprogrammet Affinity Purification any HiTrap där en Histrap FF kolonn användes. Som buffertar användes bindnings buffert och eluerings buffert (Se recept i appendix 7.1). Mekanisk lysis med Bead Beater (Bead Beater, Biospec Products): Lilla kammaren användes (15 ml). Bufferten som användes var 20 mm Tris-HCl, ph 7,5 (Se recept i appendix 7.1). Kammaren fylldes med glaspärlorna, 0,1 mm i diameter, upp till drygt hälften av volymen. Provet tillsattes först ovanpå och sedan buffert tills hela kammaren var fylld. Locket skruvades på ordentligt. Den största kammaren fylldes med is och sattes på den lilla kammaren. De två sattes i den större öppna ytterbehållaren som också fylldes med is. Allt applicerades på motorn. Lysis skedde i intervall där aktiv körning skedde med 30 sekunder i taget och vila för nedkylning i en minut. Total aktiv körning var tre min. När lysis var klar pipetterades vätskan av ur kammaren till ett centrifugrör. Provet centrifugerades i 20 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanten sparades. 5

7 Kemisk lysis med Bug Buster (Bug Buster Master Mix, Novagen): 5 ml Bug Buster/ gram pellet. Proverna inkuberades i 20 min på skakbord och centrifugerades sedan i 20 min vid 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanten/-erna sparades. Dialys (D-Tube Dialyzer Mega, 3.5 kda(blue), Novagen): Dialys av de renade proverna skedde över natt i kylrum. Bufferten var 50mM Tris-HCl, ph 8 (se recept i appendix 7.1). Kaleidoscope Prestained standards: Har en vidd mellan ~7 kda till ~194 kda i en Tris-HCl gel. Ungefär samma separation sker även i en 10-20% Tris- Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. Fusionsproteinet, som ligger ungefär vid 30 kda kommer därför att hamna som ett band vid det orangea bandet i standarden. För att kunna jämföra de två olika gelerna har Kaleidoscope Prestained standards använts i alla geler. Blå Magenta Grön Violet Orange ~194 kda ~120 kda ~89 kda ~36 kda ~31 kda Röd ~16 kda Blå ~7 kda SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range: Har en vidd mellan ~14 kda till ~97 kda. Fusionsproteinet kommer därför som ett band strax under det tredje bandet nedifrån. Den här standarden användes på både10-20% Tris-HCl, BIO-RAD, Ready Gel och 10-20% Tris-Tricine/Peptide, BIO- RAD Ready Gel, men framför allt på Tris-HCl gelen. ~97 kda ~66 kda ~45 kda ~31 kda ~22 kda ~14 kda 6

8 2.2 Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, tidsstudier med kemisk och mekanisk lysis Frysta celler med plasmid som innehåller generna för det PSI-N innehållande fusionsproteinet ympades över till agarplattor som innehöll ampicillin (100µg/ml). Agarplattorna inkuberade över natten vid 37ºC. En klon överfördes sedan till 25 ml LB och inkuberade över natten vid 37ºC och 175 rpm. 20 ml av cellkulturen överfördes till 4x250 ml LB och det fick fortsätta växa tills OD 550 visade 0,6-0,8. Då tillsattes 1 mm IPTG och cellkulturerna inkuberade i 4 h vid 37ºC och 175 rpm. Cellkulturerna delades upp i två fraktioner: A och B à 2x250 ml vardera. Fraktion A centrifugerades i 10 min vid 20ºC och 6000xg (Beckman Coulter Avanti J-25, rotor JA-10). Supernatanterna kastades och pelletarna togs tillvara. Pelletarna resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet. Lösningen delades därefter upp i två fraktioner: A och a. Till fraktion A tillsattes proteasinhibitorer med EDTA (Complete Mini, Roche) och till fraktion a tillsattes proteasinhibitorer utan EDTA (Complete Mini, EDTA-free, Roche). Fraktionerna A och a inkuberade i 20 min på roterande plattform i rumstemperatur. Fraktionerna A och a centrifugerades sedan i 20 min vid 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanterna från fraktionerna A och a togs tillvara och delades upp i ytterliggare fraktioner: Ax, A1, A2, A3, A4 samt ax, a1, a2, a3, a4. Till Ax och ax tillfördes Tricin-prov buffert och proverna värmdes i 5 min vid 80ºC. Därefter förvarades de vid -20ºC. Till resten av fraktionerna tillsattes ej Tricin-prov buffert förrän de laddades i brunnarna för gelelektrofores. Fraktionerna A1 och a1 frystes in till -20ºC med en gång. A2 och a2 stod i rumstemperatur i 2 h innan de frystes in till -20ºC. A3 och a3 stod i rumstemperatur i 6 h innan de frystes in till -20ºC. A4 och a4 fick stå i rumstemperatur i 20 h. Därefter utfördes en gelelektrofores på fraktionerna Ax, A1-4 samt ax, a1-4 (se avsnitt 2.1, gel 1, för utförande av gelelektrofores). Fraktion B centrifugerades i 10 min vid 20ºC och 6000xg. Pelletarna togs tillvara, poolades och resuspenderades i ~7 ml kall 20 mm Tris-HCl ph 7,5. Cellerna i lösningen lyserades mekaniskt med Bead Beater, 2-3 min. Lösningen i Bead Beatern (Biospec Products) togs tillvara och centrifugerades i 20 min vid 4ºC och 5445xg. Supernatanten delades därefter upp i fem fraktioner: Bx, B1, B2, B3, B4. Till fraktionen Bx tillfördes Tricin-prov buffert och provet värmdes i 5 min vid 80ºC. Därefter förvarades det vid -20ºC. Till resten av fraktionerna tillsattes ej Tricin-prov buffert förrän innan de laddades i brunnarna för gelelektrofores. B1 frystes in till -20ºC med en gång. B2 fick stå i rumstemperatur i 2 h innan det frystes in till -20ºC. B3 stod i rumstemperatur i 6 h innan det frystes in till -20ºC. B4 fick stå i rumstemperatur i 20 h. 7

9 Därefter utfördes en gelelektrofores på fraktionerna Bx, B1-4 (se avsnitt 2.1, gel 1, för utförande av gelelektrofores). 2.3 Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt tidsstudie Frysta celler med plasmiden som innehåller generna för det PSI-N innehållande fusionsproteinet ympades över till agarplattor som innehöll ampicillin (100µg/ml). Agarplattorna inkuberade över natten vid 37ºC. En klon överfördes sedan till 25 ml LB och inkuberade över natten vid 37ºC och 175 rpm. 15 ml av cellkulturen överfördes till 3x250 ml LB och det fick fortsätta växa tills OD 550 visade 0,6-0,8. Då tillsattes 1 mm IPTG och cellkulturerna inkuberade i 4 h vid 37ºC och 175 rpm. De tre cellkulturerna centrifugerades sedan i 10 min, 20ºC och 6000xg (Beckman Coulter Avanti J-25, rotor JA-10). Supernatanterna kastades och de tre pelletarna, A1, A2 och A3 resuspenderades i tre olika lösningar. Pellet A1 resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet. Pellet A2 resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet samt proteasinhibitorer innehållande EDTA (Complete Mini, Roche). Pellet A3 resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet samt proteasinhibitorer utan EDTA (Complete Mini, EDTA-free, Roche). Lösningarna inkuberade i 20 min i rumstemperatur på en roterande plattform. Därefter centrifugerades de i 20 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanterna sparades. 60 µl togs från vardera prov, A1, A2 och A3, och det delades upp i tre fraktioner: 60 µl från A1 delades upp i A1-1, A1-2 och A1-3 (à 20µl i vardera fraktion). 60 µl från A2 delades upp i A2-1, A2-2 och A2-3 (à 20µl i vardera fraktion). 60 µl från A3 delades upp i A3-1, A3-2 och A3-3 (à 20µl i vardera fraktion). Därefter frystes resten av A1, A2 och A3 ner till -20ºC med en gång. A1-1, A2-1 och A3-1 frystes in med en gång till -20ºC. A1-2, A2-2 och A3-2 fördes in i frysen efter ca 3 h. A1-3, A2-3 och A3-3 stod i rumstemperatur över natten. Gelelektrofores utfördes då på alla proven (se avsnitt 2.1, gel 1, för utförande av gelelektrofores). 8

10 2.4 Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater (Biospec Products) samt tidsstudie Frysta celler med plasmiden som innehåller gener för det PSI-N innehållande fusionsproteinet ympades över till agarplattor som innehöll ampicillin (100µg/ml). Agarplattorna inkuberade över natten vid 37ºC. En klon överfördes sedan till 35 ml LB och inkuberade över natten vid 37ºC och 175 rpm. 30 ml av cellkulturen överfördes till 6x250 ml LB och det fick fortsätta växa tills OD 550 visade 0,6-0,8. Då tillsattes 1 mm IPTG och cellkulturerna inkuberade i 4 h vid 37ºC och 175 rpm. De sex cellkulturerna centrifugerades sedan i 10 min, 20ºC och 6000xg (Beckman Coulter Avanti J-25, rotor JA-10). Supernatanterna kastades och de sex pelletarna poolades ihop två och två till tre pelletar, B1, B2 och B3. B1, B2 och B3 resuspenderades i tre olika lösningar. Pellet B1 resuspenderades i ~7 ml kall 20 mm Tris-HCl ph 7,5. Pellet B2 resuspenderades i ~7 ml 20 mm Tris-HCl ph 7,5 samt proteasinhibitorer innehållande EDTA (Complete Mini, Roche). Pellet B3 resuspenderades i ~7 ml 20 mm Tris-HCl ph 7,5 samt proteasinhibitorer utan EDTA (Complete Mini, EDTAfree, Roche). En lösning i taget lyserades i Bead Beatern (Biospec Products), medan de andra lösningarna låg på is. Lyseringen skedde i intervall med 30 s aktiv körning och 1 min vila. Total aktiv körning var 3 min. Därefter togs lösningarna tillvara och centrifugerades i 20 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanterna sparades. 60 µl togs från vardera prov, B1, B2 och B3, och det delades upp i tre fraktioner. 60 µl från B1 delades upp i B1-1, B1-2 och B1-3 (à 20µl i vardera fraktion). 60 µl från B2 delades upp i B2-1, B2-2 och B2-3 (à 20µl i vardera fraktion). 60 µl från B3 delades upp i B3-1, B3-2 och B3-3 (à 20µl i vardera fraktion). Därefter frystes resten av B1, B2 och B3 ner till -20ºC med en gång. B1-1, B2-1 och B3-1 frystes in med en gång till -20ºC. B1-2, B2-2 och B3-2 fördes in i frysen efter ca 3 h. B1-3, B2-3 och B3-3 stod i rumstemperatur över natten. Gelelektrofores utfördes då på alla proven (se avsnitt 2.1, gel 1, för utförande av gelelektrofores). 2.5 Rening av A1-A3 (från avsnitt 2.3) och B1-B3 (från avsnitt 2.4) med affinitets kromatografi A1-A3 och B1-B3 togs ut ur frysen en och en och behandlades enskilt. De centrifugerades i 10 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180) för att få bort eventuella partikelrester. Var och en av supernatanterna späddes med bindnings buffert (se recept i appendix 7.1) till en volym av ~10 ml. De laddades sedan en och en på kromatografen (ÄKTAprime plus, GE Healthcare, Histrap FF). De fraktioner som fusionsproteinet eluerades i poolades och dialyserades under omrörning i kylskåp i 1L 50 mm Tris-HCl ph 8 under 4 timmar. 9

11 2.6 Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) och LB innehållande ampicillin samt tidsstudie Frysta celler med plasmiden som innehåller gener för det PSI-N innehållande fusionsproteinet ympades över till agarplattor som innehöll ampicillin (100µg/ml). Agarplattorna inkuberade över natten vid 37ºC. En klon överfördes sedan till 35 ml LB, som innehöll 50µg/ml ampicillin och inkuberade över natten vid 37ºC och 175 rpm. 30 ml av cellkulturen överfördes till 6x250 ml LB (ampicillin 50µg/ml) och det fick fortsätta växa tills OD 550 visade 0,6-0,8. Då tillsattes 1 mm IPTG och cellkulturerna inkuberade i 4 h vid 37ºC och 175 rpm. De sex cellkulturerna centrifugerades sedan i 10 min, 20ºC och 6000xg (Beckman Coulter Avanti J-25, rotor JA-10). Supernatanterna kastades och de sex pelletarna poolades ihop två och två till tre pelletar, A1, A2 och A3. A1, A2 och A3 resuspenderades i tre olika lösningar. Pellet A1 resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet. Pellet A2 resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet samt proteasinhibitorer innehållande EDTA (Complete Mini, Roche). Pellet A3 resuspenderades i 5 ml Bug Buster Master Mix (Novagen)/ gram pellet samt proteasinhibitorer utan EDTA (Complete Mini, EDTA-free, Roche). Lösningarna inkuberade i 20 min i rumstemperatur på en roterande plattform. Därefter centrifugerades de i 20 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanterna sparades. 40 µl togs från vardera prov, A1, A2 och A3, och det delades upp i två fraktioner. 40 µl från A1 delades upp i A1-1 och A1-2 (à 20 µl i vardera fraktion). 40 µl från A2 delades upp i A2-1 och A2-2 (à 20 µl i vardera fraktion). 40 µl från A3 delades upp i A3-1 och A3-2 (à 20 µl i vardera fraktion). Därefter frystes resten av A1, A2 och A3 ner till -20ºC med en gång. A1-1, A2-1 och A3-1 frystes in med en gång till -20ºC. A1-2, A2-2 och A3-2 stod i rumstemperatur över natten. Gelelektrofores utfördes då på alla proven (se avsnitt 2.1, gel 2, för utförande av gelelektrofores). 2.7 Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater (Biospec Products) och LB innehållande ampicillin samt tidsstudie Frysta celler med plasmiden som innehåller gener för det PSI-N innehållande fusionsproteinet ympades över till agarplattor som innehöll ampicillin (100µg/ml). Agarplattorna inkuberade över natten vid 37ºC. En klon överfördes sedan till 35 ml LB, som innehöll 50µg/ml ampicillin och inkuberade över natten vid 37ºC och 175 rpm. 30 ml av cellkulturen överfördes till 6x250 ml LB (ampicillin 50µg/ml) och det fick fortsätta växa tills OD 550 visade 0,6-0,8. Då tillsattes 1 mm IPTG och cellkulturerna inkuberade i 4 h vid 37ºC och 175 rpm. De sex cellkulturerna centrifugerades sedan i 10 min, 20ºC och 6000xg (Beckman Coulter Avanti J-25, rotor JA-10). Supernatanterna kastades och de sex pelletarna poolades ihop två 10

12 och två till tre pelletar, B1, B2 och B3. B1, B2 och B3 resuspenderades i tre olika lösningar. Pellet B1 resuspenderades i ~7 ml kall 20 mm Tris-HCl ph 7,5. Pellet B2 resuspenderades i ~7 ml 20 mm Tris-HCl ph 7,5 samt proteasinhibitorer innehållande EDTA. Pellet B3 resuspenderades i ~7 ml 20 mm Tris-HCl ph 7,5 samt proteasinhibitorer utan EDTA. En lösning i taget lyserades i Bead Beatern (Biospec Products) medan de andra lösningarna låg på is. Lyseringen skedde i intervall med 30 s aktiv körning och 1 min vila. Total aktiv körning var 3 min. Därefter togs lösningarna tillvara och centrifugerades i 20 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180). Supernatanterna sparades. 40 µl togs från vardera prov, B1, B2 och B3, och det delades upp i två fraktioner. 40 µl från B1 delades upp i B1-1 och B1-2 (à 20 µl i vardera fraktion). 40 µl från B2 delades upp i B2-1 och B2-2 (à 20 µl i vardera fraktion). 40 µl från B3 delades upp i B3-1 och B3-2 (à 20 µl i vardera fraktion). Därefter frystes resten av B1, B2 och B3 ner till -20ºC med en gång. B1-1, B2-1 och B3-1 frystes in med en gång till -20ºC. B1-2, B2-2 och B3-2 stod i rumstemperatur över natten. Gelelektrofores utfördes då på alla proven (se avsnitt 2.1, gel 2, för utförande av gelelektrofores). 2.8 Rening av A1-A3 (från avsnitt 2.6) och B1-B3 (från avsnitt 2.7) med affinitets kromatografi A1-A3 och B1-B3 togs ut ur frysen en och en och behandlades enskilt. De centrifugerades i 10 min, 4ºC och 5445xg (Beckman Allegra 21R, rotor S4180) för att få bort eventuella partikelrester. Var och en av supernatanterna späddes med bindnings buffert (se recept i appendix 7.1) till en volym av ~10 ml. De laddades sedan en och en på kromatografen (ÄKTAprime plus, GE Healthcare, Histrap FF). De fraktioner som fusionsproteinet eluerades i poolades och dialyserades under omrörning i kylskåp i 1L 50 mm Tris-HCl ph 8 över natten. Därefter utfördes gelelektrofores på proverna. 11

13 3. Resultat innehåller försök där cellodlingarna i den flytande kulturen kördes utan tillsatt ampicillin innehåller försök där cellodlingarna i den flytande kulturen kördes med ampicillin tillsatt. 3.1 Resultat från 2.2: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, tidsstudier med kemisk och mekanisk lysis Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) innehållande proteasinhibitorer med EDTA % Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. Här ser man ett starkt band i höjd med det oranga bandet i standarden, vilket motsvaras av 30,6 kda. Fusionsproteinet ska ha en vikt av ungefär 30 kda vilket visar att expressionen verkar ha lyckats bra. Fusionsproteinet har vandrat lika långt i alla brunnar vilket kan visa att tiden inte är avgörande för proteinets stabilitet. Ax A1 A2 A3 A4 Bild 2. Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt proteasinhibitorer med EDTA. Gelen visar, från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, Ax är prov och Tricin-prov buffert som denaturerats och frystes med en gång. A1 är prov som frystes med en gång. A2 är prov som stod i rumstemperatur i två timmar och sedan frystes till -20ºC. A3 är prov som stod i rumstemperatur i sex timmar och sedan frystes till -20ºC. A4 är prov som stod i rumstemperatur över natten, har aldrig blivit fryst. Sista brunnen är Kaleidoscope Prestained standards. 12

14 3.1.2 Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) innehållande proteasinhibitorer utan EDTA % Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. I brunnarna ax och a1 återfinns bandet vid ungefär 30 kda. I de övriga tre brunnarna, a2-a4, syns det tydligaste bandet längre ner. Detta tyder på att en tydlig degradering har skett efter två timmar i rumstemperatur. ax a1 a2 a3 a4 Bild 3. Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt proteasinhibitorer utan EDTA. Gelen visar, från vänster till höger: ax är prov och Tricin-prov buffert som denaturerats och frystes med en gång. a1 är prov som frystes med en gång. a2 är prov som stod i rumstemperatur i två timmar och sedan frystes till -20ºC. a3 är prov som stod i rumstemperatur i sex timmar och sedan frystes till -20ºC. a4 är prov som stod i rumstemperatur över natten, har aldrig blivit fryst. Sista brunnen är Kaleidoscope Prestained standards Lysis med Bead Beater (Biospec Products) % Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. Mekanisk lysis gav ett mycket tydligt band vid ungefär 30 kda i alla fem brunnar. Ingen synlig degradering har skett vilket kan tyda på att tiden i rumstemperatur troligtvis inte är avgörande för proteinets stabilitet. Bx B1 B2 B3 B4 Bild 3. Lysis med Bead Beater (Biospec Products). Gelen visar, från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, Bx är prov och Tricin-prov buffert som denaturerats och frystes med en gång. B1 är prov som frystes med en gång. B2 är prov som stod i rumstemperatur i två timmar och sedan frystes till -20ºC. B3 är prov som stod i rumstemperatur i sex timmar och sedan frystes till -20ºC. B4 är prov som stod i rumstemperatur över natten, har aldrig blivit fryst. 13

15 3.2 Resultat från 2.3: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt tidsstudie % Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. I den här gelen syns inte bandet vid 30 kda där fusionsproteinets förväntas vara. Endast ett mycket otydligt band vid 30 kda kan ses i brunn fyra. Det beror troligtvis på att inget ampicillin tillsattes till de flytande kulturerna och cellerna har därför tappat plasmiden Brunn 1, 2 och 3 visar lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer utan EDTA. Brunn 4, 5 och 6 visar lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer med EDTA. Brunn 7, 8 och 9 visar lysis utan tillsatts Bild 4. Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen). Gelen visar från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, 1: A3-1, 2: A3-2, 3: A3-3, 4: A2-1, 5: A2-2, 6: A2-3, 7: A1-1, 8: A1-2, 9: A1-3. av proteasinhibitorer. Proverna i brunn 1, 4 och 7 frystes in med en gång till -20ºC. Proverna i brunn 2, 5 och 8 fördes in i frysen efter ca 3 h. Proverna i brunn 3, 6 och 9 stod i rumstemperatur över natten. 3.3 Resultat från 2.4: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater samt tidsstudie 10-20% Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. Gelen visar ett band vid 30 kda som finns i alla brunnarna Brunn 1, 2 och 3 visar lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer med EDTA. Brunn 4, 5 och 6 visar lysis där proteasinhibitorer utan EDTA har tillsatts. Brunn 7, 8 och 9 visar lysis utan tillsatts av proteasinhibitorer. Fusionsproteinet vid ungefär 30 kda syns relativt tydligt i brunnarna 1-3 samt 7-9. I brunnarna 4-6 är banden otydliga. Proverna i brunn 1, 4 och 7 frystes in med en gång till -20ºC. Bild 5. Lysis med Bead Beater (Biospec Products). Gelen visar från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, 1: B2-1, 2: B2-2, 3: B2-3, 4: B3-1, 5: B3-2, 6: B3-3, 7: B1-1, 8: B1-2, 9: B1-3. Proverna i brunn 2, 5 och 8 fördes in i frysen efter ca 3 h. Proverna i brunn 3, 6 och 9 stod i rumstemperatur över natten. 14

16 3.4 Resultat från 2.5: Rening av A1-A3 och B1-B3 med affinitets kromatografi Rening av A1-A3 som lyserats med Bug Buster Master Mix (Novagen) % Tris-Tricine/Peptide, BIO-RAD Ready Gel. Trots att gelen från avsnitt 3.2 inte innehöll några tydliga band syns det efter rening att det fanns fusionsprotein som dock är degraderade. Det syns på de fyra banden som ligger nedanför varandra i varje brunn Brunn 1 och 2 visar lysis utan tillsatts av proteasinhibitorer. Brunn 3 och 4 visar lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer med EDTA. Brunn 5 och 6 visar lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer utan EDTA. Då det under dialys uppstod en vit fällning i dialysrören delade vi upp A1-A3 i två fraktioner vardera. A1-1, A2-1 och A3-1 centrifugerade vi så att fällningen försvann. A1- Bild 6. Rening efter lysis med Bug Buster. Gelen visar från vänster till höger, Kaleidoscope Prestained standards, 1: A1-1, 2: A1-2, 3: A2-1, 4: A2-2, 5: A3-1, 6: A3-2. Sista brunnen visar SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range. 2, A2-2 samt A3-2 centrifugerade vi ej. Brunn 1, 3 och 5 visar de centrifugerade proverna och brunn 2, 4 och 6 visar proverna som ej har centrifugerats. Ingen större skillnad kan ses mellan centrifugerade och icke-centrifugerade prover Rening av B1-B3 som lyserats med Bead Beater (Biospec Products) % Tris-HCl, BIO-RAD, Ready Gel. Gelen visar det renade fusionsproteinet. I brunn 1, 2 och 3 är det rening baserat på enkelpellet (~250 ml cellodling som centrifugerats). De banden är mycket svaga. I brunn 4, 5 och 6 är det rening baserat på dubbelpellet (2x~250 ml cellodling som centrifugerats och poolats). De banden är mycket tydligare Bild 7. Rening efter lysis med Bead Beater (Biospec Products). Gelen visar från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, 1: B1-1, 2: B2-1, 3: B3-1, 4: B1-2, 5: B2-2, 6: B3-2. Två brunnar är tomma. Längst ut på högerkanten finns SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range. B1-1 till B3-1 är baserat på enkelpellet. B1-2 till B3-2 är baserat på dubbelpellet. Brunn 1 och 4 består av fusionsprotein där enbart buffert blivit tillsatt vid lysis. Brunn 2 och 5 består av fusionsprotein där buffert samt proteasinhibitorer med EDTA har tillsatts vid lysis. Brunn 3 och 6 består av fusionsprotein där buffert samt proteasinhibitorer utan EDTA har tillsatts vid lysis. 15

17 3.5 Resultat från 2.6: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, kemisk lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) samt tidsstudie % Tris-HCl, BIO-RAD, Ready Gel. Brunn 1 och 4 visar lysis utan tillsatts av proteasinhibitorer.brunn 2 och 5 lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer med EDTA. Brunn 3 och 6 visar lysis där proteasinhibitorer utan EDTA har tillsatts. Brunn 1, 2 och 3 visar fusionsprotein som frystes ned med en gång efter lysis. De banden är de starkaste. Brunn 4, 5 och 6 visar fusionsprotein som varit i rumstemperatur över natten. De banden är svaga vilket kan betyda att tiden har betydelse för proteinets stabilitet Bild 8. Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen). Gelen visar från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, 1: A1-1, 2: A2-1, 3: A3-1, 4: A1-2, 5: A2-2, 6: A3-2. En tom brunn och längst till höger är SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range. 3.6 Resultat från 2.7: Expression av det PSI-N innehållande fusionsproteinet, mekanisk lysis med Bead Beater (Biospec Products) samt tidsstudie % Tris-HCl, BIO-RAD, Ready Gel. Proverna i brunn 1, 2 och 3 frystes in med en gång till -20ºC. Proverna i brunn 4, 5 och 6 stod i rumstemperatur över natten Brunn 1 och 4 visar lysis utan tillsatts av proteasinhibitorer. Brunn 2 och 5 visar lysis där det finns tillsatt proteasinhibitorer med EDTA. Brunn 3 och 6 visar lysis där proteasinhibitorer utan EDTA har tillsatts. Fusionsproteinerna kan ses som starka band vid 30 kda. Ingen skillnad kan ses i färgintensitet eller vikt mellan banden. Direkt under banden syns inga andra band vilket kan betyda en lägre eller ingen degradering av fusionsproteinet. Bild 9.Lysis med Bead Beater (Biospec Products). Gelen visar från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, 1: B1-1, 2: B2-1, 3: B3-1, 4: B1-2, 5: B2-2, 6: B

18 3.7 Resultat från 2.8: Rening av A1-A3 och B1-B3 med affinitets kromatografi % Tris-HCl, BIO-RAD, Ready Gel Gelen visar tydliga band vid 30 kda. Brunn 1 visar fusionsprotein som har lyserats med Bug Buster Master Mix (Novagen) där det finns tillsatt proteasinhibitorer med EDTA. Brunn 2 visar fusionsprotein som har lyserats med Bug Buster Master Mix (Novagen) där det finns tillsatt proteasinhibitorer utan EDTA. Brunn 3 visar fusionsprotein som har lyserats med Bead Beater (Biospec Products) där det finns proteasinhibitorer med EDTA tillsatt. Brunn 4 visar fusionsprotein som har lyserats med Bead Beater (Biospec Products) där det finns proteasinhibitorer utan EDTA tillsatt. I brunn 1 och 2 kan man tydligt se att det finns två band i varje brunn. Det tyder på att fusionsproteinet är delvis degraderat. I brunn 3 och 4 finns inga dubbelband utan endast ett band i varje brunn. Det tyder på att fusionsproteinet är intakt eller näst intill intakt; det kan finnas degraderingsprodukter som inte syns tillräckligt tydligt på gelen. Endast A2, A3, B2 samt B3 renades och dialyserades Bild 10. Rening efter lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) och Bead Beater (Biospec Products). Gelen visar från vänster till höger: Kaleidoscope Prestained standards, 1: A2, 2: A3, 3: B2, 4: B3. Längst till höger finns SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range. 17

19 4. Diskussion 4.1 Diskussion Målet med vårt arbete var att komma på ett sätt att rena fram PSI-N, i nativt tillstånd, utan någon form av degradering. Tidigare försök [6] har visat på svårigheter att framställa fusionsproteinet med kemisk lysis som inte varit degraderat. Bengtsson upptäckte att degraderingen skedde direkt efter lysis. Vår fundering blev då att det kan vara möjligt att det vid lysis frigörs proteaser som bryter ner fusionsproteinet samt att den kemiska lysis som tidigare användes möjligtvis bidrar till degraderingen. Vår förhoppning låg då till mekanisk lysis samt tillsats av proteasinhibitorer. Vi utförde lysis, både på kemisk och mekanisk väg, med tillsatts av proteasinhibitorer, med och utan EDTA, för att se om det skulle lösa problemen med degraderingen. I vår första studie med kemisk och mekanisk lysis utförde vi en tidsstudie för att undersöka hur snabbt fusionsproteinet degraderades samt om det skulle göra någon skillnad om man tillsatte proteasinhibitorer. I gelen, där proverna har lyserats kemiskt, i avsnitt syns ett tydligt band vid 30 kda i alla brunnar vilket tyder på att inkubationstiden i rumstemperatur inte påverkar eventuell degradering. Gelen i avsnitt visar på ett annat resultat, även där har lysis skett på kemisk väg. Där är bandet för fusionsproteinet vid 30 kda i de två första brunnarna, men i de tre sista brunnarna har bandet vandrat längre vilket betyder att det är lättare. Där har det skett en tydlig degradering som har uppstått någon gång inom två timmar när proverna har inkuberat i rumstemperatur. Då gelen från avsnitt hade laddats med prover som innehöll proteasinhibitorer med EDTA och gelen från avsnitt hade laddats med prover som innehöll proteasinhibitorer utan EDTA kan man dra slutsatsen att tillsatsen av EDTA skyddar mot degradering. Gelen i avsnitt har utförts utan proteasinhibitorer men med mekanisk lysis och där syns ingen tydlig degradering då banden i de fem brunnarna finns vid 30 kda. Inte heller där betyder de olika inkubationstiderna i rumstemperaturen något för proteinets stabilitet. I gelen från avsnitt 3.2 finns inga tydliga band vid 30 kda. Det beror på att cellkulturerna inkuberade över natt i LB som inte hade något ampicillin tillsatt. Proverna i gelerna från avsnitt har alla kommit från cellkulturer där inget ampicillin har tillsatts vid inkubering. Om ampicillin inte tillförs de flytande kulturerna när de ska inkubera under en längre tid kan cellerna tappa plasmiden, som innehåller fusionsproteinet samt en resistent gen för ampicillin. Det sker för att det går åt mer energi för de cellerna med plasmid att dela sig än för de celler som inte har plasmid. Cellerna i proverna i den fjärde gelen (avsnitt 3.2) har tappat sina plasmider, men det har ej skett i de tre första gelerna (avsnitt 3.1.1, och 3.1.3). Det visar på att det är mycket viktigt att tillföra ampicillin för att få ett tillförlitligt resultat. I gelen från avsnitt 3.3 finns fusionsproteinet ånyo som ett band i alla brunnarna vid 30 kda. Där har cellerna ej tappat plasmiden och ingen tydlig degradering kan ses. Banden i de tre första brunnarna är något tydligare än de andra vilket kan tyda på att även här skyddar EDTA mot degradering. Inkubationstiden i rumstemperatur verkar inte göra någon skillnad för proteinets stabilitet. Dock kan man inte riktigt lita på resultaten då det finns en möjlighet att en del av cellerna kan ha tappat plasmiden och att det är därför som banden är olika starka. Gelerna från avsnitt och visar när proverna har renats i kromatografen och endast fusionsproteinet finns kvar. Där syns en tydlig degradering av fusionsproteinerna som lyserats 18

20 på kemisk väg, men väldigt liten degradering av fusionsproteinerna som lyserats på mekanisk väg. Då cellerna kan ha tappat plasmiden under inkubationen kan ingen tillförlitlig jämförelse göras av färgstyrkan i de olika banden. De olika graderna av degradering mellan de olika gelerna tyder dock på att lysis på mekanisk väg är bättre än lysis på kemisk väg. Det verkar som att något i Bug Buster Master Mix (Novagen) bidrar till degradering av fusionsproteinet. Proverna i gelerna från avsnitt har alla kommit från cellkulturer där ampicillin har tillsatts vid inkubering. De resultaten är därför mer tillförlitliga när man ska jämföra färgintensiteten hos banden mellan brunnarna. I gelen från avsnitt 3.5 fick vi något otydliga resultat. Banden i brunn 2 och 3 är starkare än bandet i brunn 1. Bandet i brunn 3 har ett otydligt men synbart smalare band direkt under sig vilket kan tyda på att en del av fusionsproteinerna har degraderats. Under bandet i brunn 2 syns inget mindre band. Det kan tyda på att tillsatsen av proteasinhibitorer skyddar proteinet och att även tillsatsen av EDTA har betydelse för att minska degraderingen av proteinet. I brunn 4, 5 och 6 syns det tydligt att bandet i brunn 5 är starkast i färg. Även där har proteasinhibitorerna med EDTA skyddat proteinet från degradering. Tidsstudien pekar mot samma resultat som tidigare; inkubering i rumstemperatur för prover som lyserats på kemisk väg påverkar proteinets stabilitet negativt. I gelen från avsnitt 3.6, där lysis har skett på mekanisk väg, är alla banden lika tjocka och färgrika. Strax under banden syns inga andra band vilket kan tyda på minimal degradering. Liksom tidigare resultat verkar inte inkubationstiden i rumstemperatur ha några negativa effekter på proteinets stabilitet. Det är dock svårt att se om tillsatsen av proteasinhibitorer med EDTA har skyddat proteinet. Den sista gelen i avsnitt 3.7 visar när proverna A2, A3, B2 och B3 från avsnitt 2.6 och 2.7 har renats med affinitetskromatografi. I brunn 1 och 2 syns mycket tydliga dubbelband i båda brunnarna vilket visar på att fusionsproteinet har degraderats. Det övre bandet i brunn 1 är tydligare än det övre bandet i brunn två vilket tyder på att tillsats av proteasinhibitorer med EDTA delvis skyddar proteinet från degradering. I brunn 3 och 4 syns inget annat band än det som ligger vid 30 kda. Där kan inte heller någon skillnad i färgintensitet ses mellan de två banden. 4.2 Slutledning Det vi har kommit fram till efter våra undersökningar är att tiden, som proverna befann sig i rumstemperatur, samt tillsatts av proteasinhibitorer med och utan EDTA inverkar på proteinets stabilitet när lysis skett på kemisk väg. Lysis med Bug Buster Master Mix (Novagen) är inte den optimala metoden för att få fram intakt protein. Proteinet får ej vara i rumstemperatur någon längre tid och trots att man kan se en mindre degradering av proteinet när proteasinhibitorer med EDTA har tillförts så är ändå degraderingen så stor att resultatet inte blir tillfredsställande. Det verkar, som tidigare påpekats, som om något i Bug Buster Master Mix (Novagen) bidrar till degraderingen av fusionsproteinet. EDTA fungerar som en komplexbindare som binder till metalljoner. Det är alltså möjligt att det finns metallberoende proteaser i cellerna som EDTA lyckats inaktivera och därmed har en 19

21 större mängd protein förblivit intakta, när EDTA har använts, framför allt då lysis skett på kemisk väg. Metoden där lysis har skett på mekanisk väg har gett bättre resultat. Från avsnitt kan man se att bandet där det till provet har tillförts proteasinhibitorer utan EDTA är det starkaste och från avsnitt 3.7 kan man se att banden i brunn 3 (proteasinhibitorer med EDTA) och 4 (proteasinhibitorer utan EDTA) är lika starka. Resultatet från avsnitt är inte tillförlitligt då en del av cellerna kan ha tappat plasmiden. Vid mekanisk lysis kan vi inte se någon fördel när proteasinhibitorer med eller utan EDTA användes. Det vore dock bra om det kunde verifieras genom ytterliggare undersökningar. Det vi inte har undersökt är om man kan skydda proteinet under kromatografin. EDTA ska inte tillsättas till proverna innan kromatografin då det bidrar till att kolonnen, som innehåller metalljoner, förlorar i effektivitet. Det finns dock metoder för att fylla på metalljoner i kolonnen. Om man gör det efter varje rening kan det bidra till att få fram bättre resultat. När klyvning med TEV utförs kan tillsatsen av EDTA också skydda proteinet från att degraderas. TEV innehåller inga metalljoner så det kommer troligtvis ej att påverkas av närvaron av EDTA. Vi har inte utfört någon klyvning med TEV så vi har inte kunnat undersöka om PSI-N som utvunnits efter lysis på mekanisk väg förblir så intakta som våra resultat visar för fusionsproteinet. De undersökningar som nästkommande grupper kan utföra är att försöka optimera tiden för lysis med Bead Beater (Biospec Products). Då metoden i avsnitt 2.7 ledde till, till synes, lyckat resultat är det viktigt att utföra samma undersökning på nytt för att se om liknande resultat kan uppnås igen. 20

22 5. Namnförklaringar Fusionsprotein: Protein som bildas av två eller flera gener som ursprungligen kodar för separata protein. SDS: Sodium doodecylsulfate Tris: Trishydroxymethylaminomethane EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid OD: Optical density PSI-N: Subenhet N i fotosystem I kda: Kilo Dalton. Enhet för molekylvikt PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis IPTG: Isopropyl β-d-thiogalactopyranoside Nativ form: Proteiners funktionella struktur 21

23 6. Referenser [1] P. Fromme, A. Melkozernov, P. Jordan, N. Krauss, Structure and function of photosystem I: interaction with its soluble electron carriers and external antenna systems, P. Fromme et al./febs Letters 555 (2003) 40^44. [2] P. E. Jensen, R. Bassi, E. J. Boekema, J. P. Dekker, S. Jansson, D. Leister, C. Robinson, H. V. Scheller, Structure, function and regulation of plant photosystem I, Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) [3] H. V. Scheller, P. E. Jensen, A. Haldrup, C. Lunde, J. Knoetzel, Role of subunits in eukaryotic Photosystem I, Biochimica et Biophysica Acta 1507 (2001) 41^60. [4] S. Rökaeus. (2007), Cloning and expression of subunit N of Photosystem I from Arabidopsis thaliana. Master of Science project report in biochemistry, Göteborgs universitet. [5]. L. Ek, M. Halltorp (2008), Expression av PSI-N från Arabidopsis thaliana i E.coli. Examensarbete i biokemi 15 hp, Halmstad Högskola. [6] M. Bengtsson (2008), Purification and cleavage of fusion protein containing the photosystem I subunit PSI-N using affinity chromatography and TEV protease. Bachelor s degree project in Chemistry, Halmstad Högskola 22

24 7. Appendix 7.1 Recept på lösningar LB media: SDS laddnings buffert: 1L avjoniserat vatten 100 mm Tris-HCl, ph g Pepton 4% (w/v) SDS 5 g Jäst 20% (v/v) glycerol 10 g NaCl 0,2% bromfenolblå 200 mm DTT Fyll upp till ~800 ml, tillsätt pepton, jäst och NaCl och blanda väl. Fyll upp till 1000 ml med avjoniserat vatten. Bindnings buffert, ph 7,4: 20 mm natriumfosfat 0,5 M NaCl 40 mm imidazol Ställ ph med NaOH. Eluerings buffert, ph 7,4: 20 mm natriumfosfat 0,5 M NaCl 0,5 M imidazol Ställ ph med HCl. Katodbuffert, ph 8,25: 0,1 M Trisbas 0,1 M Tricin 0,1% SDS Anodbuffert, ph 8,9: 0,2 M Tris-HCl BeadBeater buffert, ph 7,5: 20 mm Tris-HCl Dialysbuffert, ph 8: 50 mm Tris-HCl SDS-running buffert: 20 mm Tris 250 mm glycin 0,1 (w/v) SDS Fixeringsvätska: 40% (v/v) metanol 10% (v/v) ättiksyra 23

25 7.2 Kromatogram från rening av fusionsproteinet som lyserats med Big Buster Master Mix (Novagen). A 280 Koncentration för elueringsbufferten Fraktioner mau AT2009dec21no013:10_UV AT2009dec21no013:10_Conc AT2009dec21no013:10_Fractions AT2009dec21no013:10_Logbook Break point 3 Break point 4 Break point 5 Break point 6 Break point Waste Waste min 24

26 7.3 Kromatogram från rening av fusionsproteinet som lyserats med Bead Beater (Biospec Products). A 280 Koncentration för elueringsbufferten Fraktioner mau AT2009dec21no007:10_UV AT 2009dec21no007:10_Conc AT 2009dec21no007:10_Fractions AT2009dec21no007:10_Logbook Break point 3 Break point 4 Break point 5 Break point 6 Break point Waste Waste min 25