Coatest SP Factor VIII Swedish revision 12/2004

Transkript

1 AVSETT ÄNDAMÅL Kitet är avsett för fotometrisk bestämning av faktor VIII-aktivitet i plasma, antikoagulerad med citrat vid diagnostisering av FVIII-brist eller för monotorering av patienter i substitutionsterapi samt vid potensbestämning av FVIII koncentrat. METODPRINCIP Faktor IXa, Ca 2+, fosfolipid 1. Faktor X Faktor Xa Faktor VIII Faktor Xa 2. S-2765 Peptid + pna I närvaro av kaliciumjoner och fosfoliper, aktiveras faktor X till faktor Xa av faktor IXa. Denna aktivering stimuleras kraftigt av faktor VIII, som agerar cofaktor i denna reaktion. Genom att använda optimala mängder av Ca 2+, fosfolipider och ett överskott av faktor IXa och faktor X, blir aktiveringshastigheten av faktor X, endast beroende av faktor VIII-halten. Faktor Xa hydrolyserar det kromogena substratet S-2765 och frisätter den kromofora gruppen pna. Den bildade färgen avläses vid 405 nm. Genererad faktor Xa och därmed också färgintensiteten är proportionell mot faktor VIII-aktiviteten i provet. Hydrolys av S-2765 med trombin, förhindras genom tillsatts av en syntetisk trombinhämmare I-2581 till substratet. REAGENS 1. S mg + I flaska Kromogent substrat (N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), 15.4 mg och syntetisk trombinhämmare, 0.4 mg med mannitol tillsatt som bulkmedel. 2. Factor IXa + factor X 9.2 IU 1 flaskor Frystorkad bovin faktor IXa och X, med bovint albumin tillsatt som stabilisator. 3. CaCl 2 6 ml 1 flaska Kalciumkloridlösning, 0,025 mol/l. 4. Buffer, stock solution 20 ml 1 flaska 20 ml koncentrerad Trisbuffert, innehållande NaCl och BSA. Karaktäristik på buffert spädd tio gånger; Tris 0,05 mol/l, ph 7,3, 10 mg/l Ciprofloxacin och 1,0% BSA. 5. Phospholipid 2 ml 1 flaska Blandning av högt upprenade fosfolipider och 10 mg/l Ciprofloxacin VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Undvik ögon- och hudkontakt (S24/25). Häll inte ut reagensen i avloppet (S29). Använd lämpliga skyddskläder (S36). Denna produkt är avsedd för in vitro diagnostik. REAGENSFÖRBEREDELSE Reagens rekonstitueras enligt respektive instrumentapplikation. För analys på mikroplattor och i provrör se nedan: 1. S I-2581: Rekonstituera med 12,0 ml sterilt vatten eller NCCLS typ II vatten 11, för att erhålla en koncentration av 2,7 mmol/l. 2. Factor IXa + Factor X: Rekonstituera med 10,0 ml sterilt vatten eller NCCLS typ II vatten CaCl 2 : Färdig att använda 4. Buffer, stock solution: Späd 1:10 (1+9) med sterilt vatten eller NCCLS typ II vatten. 11. Blanda ny varje dag. 5. Phospholipid: Färdig att använda REAGENSFÖRVARING OCH STABILITET Vid förvaring i 2-8 C är oöppnade reagens hållbara tills utgången av det datum som står tryckt på etiketten. Undvik mikrobiell kontamination av öppnade reagens. 1. S I-2581: Stabilitet efter rekonstituering: 3 månader vid 2-8 C. 2. Factor IXa + Factor X: Stabilitet efter rekonstituering: 12 timmar vid 2-8 C. Lösningen kan förvaras frysen i alikvoter vid -20 C (eller lägre temperatur) i 3 månader. Viss aktivitet (<10%) kan gå förlorad vid infrysning och tining. Infrysningstiden skall vara så kort som möjligt. 3. CaCl 2 (0.025 mol/l : Öppnad flaska är stabil vid 2-8 C i 3 månader. 4. Buffer, stock solution: (Tris 0,05 mol/l, ph 7,3, 10 mg/l Ciprofloxacin och 1,0% BSA ). Efter att flaskan öppnats är bufferten stabil 3 månader vid 2-8 C. Förbered ny varje dag. 5. Phospholipid: Öppnad flaska är stabil i 3 månader vid 2-8 C. Skaka försiktigt före användning. Nödvändiga reagens och material som inte medföljer 1. Avjoniserat vatten, filtrerat genom 0,22 µm eller NCCLS typ II vatten Ättiksyra 20% eller citronsyra 2%. 3. Kontrollplasma abnormal och normal kalibrerad mot en internationell referensplasma för FVIIII 4. Kalibrationsplasma kalibrerad mot en internationell standard 5. Spektrofotometer, 405 nm (och 490 nm för avläsning av mikroplattor) 6. Värmeinkubator 37 C ±0,2 C 7. Semi-mikrokuvetter 8. Centrifug, 2000xg 9. Provrör i plast

2 10. Stoppur 11. Vortex mixer 12. Kalibrerade pipetter PROVTAGNING Nio delar färskt venöst blod samlas i en del trinatriumcitrat. Centrifugering: 2000 x g i minuter vid C. Hänvisning till NCCLS dokumentet H21-A4 för ytterliga instruktioner avseende provtagning, provhantering och provförvaring 12. KVALITETSKONTROLL Normala och abnormala kontroller för plasma och koncentrat rekommenderas för pålitlig kvalitetskontroll 13. De angivna kontrollvärdena bör vara spårbara till en internationell standard. En kontroll skall analyseras periodiskt vid varje analystillfälle. Kontrollen skall hanteras på samma sätt som ett patientprov. Ett intervall för tillåten variation av kontroller skall etableras vid varje laboratorium. Om ett kontrollresultat ligger utanför det etablerade intervallet, skall en komplett kontroll av kalibrator, reagens och instrumentprestanda genomföras. RESULTAT FVIII-resultat rapporteras som % av aktiviteten i normal plasma (100% faktor VIII-aktivitet motsvarar 1,0 IU/ml). FÖRVÄNTADE VÄRDEN Intervall: % (2SD, n = 121) i en normal frisk population evaluerad med Coatest SP Factor VIII (teströrs metod) Då många variabler kan påverka resultaten, bör varje laboratorium skall fastställa sitt eget normalområde genom att följa en standardiserad metod och utan ovarsam förlust av faktor VIII-aktivitet. ANALYS NOT: Alla förutsättningar i denna bipacksedel hänförs till manuella metoden. Detaljerade instruktioner för instrumentsprogrammering och reagenspreparering för ACL 8000/9000/10000 finns tillgängliga och erhålls från Chromogenix efter förfrågan. Två analysområden för faktor VIII-aktivitet är definierade (20-150% och 1-20%). Analysområde % Förbered en lösning bestående av fosfolipid + faktor IXa + faktor X genom att blanda: 1 volym fosfolipid 5 volymer faktor IXa + faktor X-reagens Förvara på is eller vid 2-8 C. Skaka försiktigt precis före användning. Blandningen är stabil i 4 timmar vid 2-8 C eller 12 timmar på is. Kalibrering En standardkurva krävs för varje nytt kit av Coatest SP VIII. Normal human plasma, kalibrerad mot internationell standard, används för spädning av standardpunkter. Spädningarna görs i plaströr med kyld arbetsbuffert enligt tabellen nedan. Slutspädning Standard% Plasma ospädd De angivna procentvärdena för standarpunkterna är de som uppnås från en normalplasma innehållande 1,0 IU faktor VIII/ml. Om FVIII-aktiviteten i den normalplasma som används avviker från det värdet, skall lämplig korrektionsfaktor användas. Förberedelse av plasmaprover Använd plaströr. Plasmaprov eller koncentrat 25 (2-8 C) 3000 Blanda noga. Förvara vid 2-8 C. Analysen måste genomföras inom 30 minuter efter spädning. Detta beror på att faktor VIII är labilt. ANALYSMETOD Analysen skall genomföras i plastmaterial. Syrastoppad Kinetisk metod metod Fosfolipid+FIXa+FX (2-8 C) Provplasma eller standard spädning (2-8 C) Blanda och inkubera vid 37 C 4-5 min CaCl 2 (37 C) Blanda och inkubera vid 37 C i exakt 5 min S-2765+I-2581 (37 C)

3 Blanda och inkubera vid 37 C i exakt 5 min Ättiksyra 20% eller citronsyra 2% (20-25 C) 100 Syrastoppad metod: Avläs, inom fyra timmar, absorbansen på provet mot en reagensblank (buffert istället för prov). Då spädningsfaktorn för plasman är stor, behöver man inte analysera provblanker. Kinetisk metod: Överför omedelbart till en 1 cm semi-mikrokuvett (förvärmd till 37 C) och mät absorbansförändringen vid 405 nm. Analysområde 1-20% Förbered en lösning bestående av fosfolipid + faktor IXa + faktor X genom att blanda: 1 volym fosfolipid 5 volymer faktor IXa + faktor X-reagens Förvara på is eller vid 2-8 C. Skaka försiktigt precis före användning. Blandningen är stabil i 4 timmar vid 2-8 C eller i 12 timmar på is. Kalibrering En standardkurva krävs för varje nytt kit av Coatest SP VIII. Normal human plasma används för spädning av standardpunkter. Spädningarna görs i plaströr med kyld arbetsbuffert enligt tabellen nedan. Slutspädning Standard% Plasma , , , , De angivna procentvärdena för standarpunkterna är de som uppnås från en normalplasma innehållande 1,0 IU faktor VIII/ml. Om FVIII-aktiviteten i den normalplasma som används avviker från det värdet, skall lämplig korrektionsfaktor användas. Förberedelse av plasmaprover Använd plaströr Plasmaprov 25 (2-8 C) 2000 Blanda noga. Förvara vid 2-8 C. Analysen måste genomföras inom 30 minuter efter spädning. Detta beror på att faktor VIII är labilt. Analysmetod På grund av den begränsade genereringen av FXa i prover med <5% faktor VIII, är den syrastoppade metoden att föredra i detta analysområde. NOT: Analysen skall utföras i plastmaterial. Fosfolipid+FIXa+FX (2-8 C) 200 Provplasma eller standard (2-8 C) 100 Blanda och inkubera vid 37 C i 4-5 min CaCl 2 (37 C) 100 Blanda och inkubera vid 37 C i exakt 10 min S-2765+I-2581 (37 C) 200 Blanda och inkubera vid 37 C i exakt 10 min Ättiksyra 20% eller citronsyra 2% (20-25 C) 100 Avläs, inom fyra timmar, absorbansen på provet mot en reagensblank (buffert istället för prov). Då spädningsfaktorn för plasman är stor, behöver man inte analysera provblanker. NOTERA: Den analysmetod som beskrivs ovan kan också genomföras på mikroplattor, genom att reducera alla volymtillsatser till en fjärdedel. Alla andra förhållanden såsom inkubationstider och hydrolystiden hålls identiska. I detta fall skall absorbansen avläsas vid både 405 nm och 490 nm. Subtrahera A 490 från A 405 för att korrigera för skillnader som finns i de olika brunnarna. BEGRÄNSNINGAR I ANALYSMETODEN Aktiveringsreaktionen skall utföras i plastmaterial då glasytor kan påverka generering av faktor Xa. Faktor VIII är en labil koagulationsfaktor och för att uppnå den noggrannhet som analysmetoden erbjuder, är det viktigt att arbeta på ett noga standardiserat sätt genom hela analysproceduren. BERÄKNINGAR Plotta absorbansförändringen per minut ( A/min) eller absorbansen (A) för respektive standard mot deras faktor VIII-koncentration på ett linjärt grafpapper. Avläs FVIII-aktiviteten i % motsvarande de okända provernas absorbanser.

4 Standardkurvor Kinetic Method Range 0-150% A405/min End point method Range 0-150% 1.5 A405 nm End point method Range 0-20% A405 nm PRESTANDAEGENSKAPER Specificitet och interfererande faktorer FVIII resultaten påverkas inte av triglyceridkoncentrationer 700 mg/dl, bilirubinkoncentrationer 20 mg/dl, hemoglobin koncentationer 100 mg/dl och heparinkoncentrationer 1 IU/mL.. NOT: Hemolyserade prov i lågområdet bör inte analyseras. Tack vara den höga spädningsfaktorn blir det ingen underestimering av faktor VIII aktiviteten i prov innehållande lupus antikoagulans.

5 Precision Precision inom analys och totalt bestämdes över multipla körningar. %CV (inom analys) n %CV (Total) N Analys i provrör Medel % FVIII 83 % 3,4 2 5, % 4,3 2 5,6 80 Korrelation: Lutning Intercept r Referensmetod n Analys i provrör 1, ,9873 Coatest Factor VIII 181 (naturlig porcin fosfolipid) Denna studie (n=181) utfördes med prover från friska individer, liksom med prover från patienter med varierande grad av FVIII-brist, von Willebrands sjukdom och andra sjukdomstillstånd. Linjäritet Analys i provrör: Detektionsgräns Analys i provrör: % faktor VIII Analysmetoden tillåter detektion av 1% faktor VIII-aktivitet. Sensitivitet: Analys i provrör A 405 per 1% FVIII-aktivitet: Lågområdet 0,034 Normalområdet 0,009 Antal bestämningar per kit Analys på mikroplatta: 240 Analys i provrör: 60 Bibliography / Literatur / Bibliografía / Bibliographie / Bibliografia /Bibliografia / Litteratur / Litteraturförteckning /