Projektarbete 100p Carl Jaede

Transkript

1 [Type text] [Type text] [Type text]

2 Abstract This report describes the procedure and result of a laboratory experiment where GFP has been cloned inside living bacteria. It also contains a large theoretical basis for the experiment plus a smaller literary study about the nature of GFP. The main purpose of this project work was to discover and map out techniques for genetic manipulation and to investigate how genetic changes can be expressed inside living cells. This was done through recombination of genes coding for egfp and of the expression vector pet-tev, using the obtained vector to transform bacteria from the strain E. coli.. The result was verified with SDS- PAGE of the extracted protein and by detecting its fluorescence. Questions regarding the discovery, properties and possible applications of GFP were answered in the literary study. GFP has shown to be totally non-toxic and when combined with other units all the former properties are kept functional. These qualities has made GFP, along with now developed derivatives fluorescing in other colours, an excellent tool for monitoring dynamic processes in living cells. Key words: GFP, genetic manipulation, gene expression, recombinant DNA 2

3 Innehållsförteckning 1. Inledning Bakgrund Syfte och frågeställningar Metod Litteraturstudie Laboration Litteraturstudie Resultat Upptäckten av grönt fluorescerande protein Egenskaper hos GFP och dess derivat Struktur Kromoforen Övriga inverkningar GFP-familjen Användningsområden Laboration Teori Arvsmassan i en bakterie Vektorer Kontrollerad odling av bakterier Proteinsyntesen från DNA till protein Genteknikens grund att ge en organism nya egenskaper Isolera och extrahera PCR polymeraskedjereaktion Rekombinering av DNA Transformering av bakterier Elektrofores Elektrofores av DNA Elektrofores av proteiner HPLC och his-taggar Utförande Isolering av GFP och expressionsvektor PCR av gener plus primer Restriktion Förberedande av agarplattor Reningsprocess av restrikterade produkter Ligering Transformering av bakterier Förberedande av Master Mix inför PCR Enskilda kolonier isoleras för odling och sätts på PCR Tillredning av gel till elektroforesen Elektrofores av PCR-produkter Odling av två utvalda kolonier Isolering av GFP Analys av GFP Resultat och analys Resultat från elektrofores av DNA Resultat från bakterieodling

4 3.3.3 Resultat från SDS-PAGE Analys av laborationen Sammanfattning Slutdiskussion Referenser Tryckta källor...35 Elektroniska källor...35 Muntliga källor...36 Bildkällor...36 Bilaga 1 Översikt över laborationen Bilaga 2 Prime View Report

5 1. Inledning Titeln till denna rapport kan vid en första anblick hos många läsare te sig främmande eller märklig. Kloning är normalt sett ett begrepp som i vida kretsar ses som en futuristisk metod att in i minsta detalj kopiera hela organismer, ett begrepp som i själva verket har betydligt vidare betydelse. Hur sedan ett enskilt simpelt protein kan väcka så stort intresse kan också till en början framstå som obegripligt. Intresset till detta projektarbete väcktes genom att se på det stora rabalder som uppstått i forskarvärlden sedan ett självlysande protein upptäckts utanför Nordamerikas västkust. Nya dörrar hade tydligen öppnats för biologisk forskning, något som naturligtvis väckte även mitt intresse. Efter att ha skaffat mig en överblick om detta nya protein förundrades jag över de sätt som det kunde användas på genom metoder som hittills varit helt okända för mig. Jag beslöt mig för att allt detta måste undersökas. Denna stora mängd revolutionerande information hade likt många banbrytande astrofysiska teorier såsom kvantmekaniken och relativitetsteorin ännu inte nått ut till den breda allmänheten. Kunde det även i detta fall vara så att upptäcktens avancerade natur omöjliggjorde ett insiktstagande även hos icke-akademiker? Denna fråga har varit min utgångspunkt och drivkraft under detta år, under vilket jag på olika sätt har närmat mig ett område så stort och ombytligt att det är väldigt svårt att överblicka. 1.1 Bakgrund Året 1859 gavs den nu världsberömda boken Om arternas uppkomst ut, vilken beskrev en idé om hur nya arter uppstod genom gradvis utveckling. Teorin som beskrevs av författaren Charles Darwin gavs också uttryck i hans kommande böcker, men några belägg för bakomliggande biologiska mekanismer för denna utveckling fanns ännu inte. Den österrikiske vetenskapsmannen Gregor Mendel forskade under denna tid om nedärvning av anlag hos ärtsorter och fick därmed de första grundläggande insikterna om hur genetiska anlag fungerar. Att det i själva verket är gener och dess mutationer som styr de evolutionära mekanismerna upptäcktes inte förrän på 1940-talet. Den moderna evolutionära syntesen, vilken var en sammansmältning av Darwins och Mendels idéer, fick utgöra grunden för evolutionsbiologin som i sin tur fick ett enormt genomslag inte bara inom naturvetenskapen, utan också i hela samhället. Idag utgår all biologi från ett evolutionärt perspektiv, och enorma mängder resurser läggs på forskning kring arters arvsmassa. Genom de senaste decennierna har en rad olika forskare bidragit till att utveckla metoder att inte bara kartlägga utan också att kopiera och förändra arvsmassan hos olika organismer. I populärvetenskaplig prosa används begreppet genmanipulering för att beskriva av människan förändrad arvsmassa för att uppnå ett visst syfte. De tekniker som utvecklas når dock sällan ut ens inom 5

6 populärvetenskapliga kretsar, och de problem och hinder som finns förknippade med dessa undertrycks likaså. År 2008 mottog tre forskare från olika länder Nobelpriset i kemi för deras forskning kring ett mycket märkligt protein som lyste i grönt. Detta relativt enkla protein visade sig kunna användas för en rad olika syften vilket öppnade upp stora möjligheter att på nya sätt se in i den biologiska världen. Denna närmast fantastiska upptäckt har dock inte hunnit till skolornas klassrum än, och trots den stora uppståndelse som proteinet orsakat i forskarvärlden finns ännu få lättillgängliga informationskällor för den bredare massan. 1.2 Syfte och frågeställningar Syftet med detta projektarbete är: Att genom litteraturstudier sammanställa väsentlig information om grönt fluorescerande protein (GFP) på ett enkelt och överskådligt sätt som kan besvara frågor om proteinets upptäckt och betydelse. Att genom praktisk laboration upptäcka och kartlägga metoder för genmanipulering, samt undersöka och klargöra hur ändring i arvsmassan kan komma till uttryck. Syftesförklaringen stöds med följande frågeställningar: Hur upptäcktes grönt fluorescerande protein (GFP)? Vad är egentligen GFP och vad kan det användas till? Hur kan arvsmassa hos en organism ändras genom gentekniska ingrepp? 1.3 Metod Grunden i detta projektarbete utgörs av en praktisk laboration med målet att producera större mängder grönt fluorescerande protein genom att manipulera arvsmassan i en bakteriekultur. Proteinets fluorescerande egenskap används för att detektera resultatet, som sedan verifieras med olika analysmetoder. Med hjälp av laborationens resultat besvaras i viss utsträckning flera av ovanstående frågeställningar Litteraturstudie Innan laborationen genomfördes en litteraturstudie som syftar till att besvara frågorna kring grönt fluorescerande protein i sig, däribland dess upptäckt, dess egenskaper och inte minst dess användningsområden, redan vedertagna såväl som potentiella. Eftersom forskningen kring GFP belönades med Nobelpriset i kemi 2008 så finns det ganska mycket information att tillgå bara från Kungliga Vetenskapliga Akademins och Nobelprisets hemsidor. Dessa har använts i stor utsträckning för att förklara fenomen på olika nivåer. Det finns även litteratur i ämnet som har varit till användning för att besvara frågorna kring GFP, samt att det på nobelpristagarnas egna hemsidor har funnits mycket information att hämta. Litteratur om GFP har hittats genom sökning i 6

7 Umeå Universitetsbiblioteks databaser. Detaljer kring källor, både vad gäller laborationen och litteraturstudien, återfinns i referenslistan Laboration Laborationen genomfördes på Institutionen för molekylärbiologi på Kemisktbiologiskt Centrum (KBC) på Umeå Universitet den januari Handledare till denna laboration var Lars Backman, universitetslektor och forskare inom biokemi. Tillvägagångssättet under laborationen beskrivs i detalj i utförandedelen. För att kunna förklara de teorier som krävs för laborationen används ett brett urval källor, inte minst i form av intervjuer med Lars Backman, men också genom litteratur och elektroniska källor på ett liknande sätt som i litteraturstudien. 7

8 2. Litteraturstudie Resultat 2.1 Upptäckten av grönt fluorescerande protein Året var En japansk forskare vid namn Osamu Shimomura hade nyligen fått sin doktorsgrad efter att ha extraherat ett okänt starkt lysande protein från blötdjuret Cypridina. Den amerikanske professorn Frank Johnson hade imponerats över resultatet av hans studier och erbjöd Shimomura en anställning hos honom på det högt ansedda universitetet Princeton i New Jersey (Kungliga Vetenskapliga Akademin, 2008). Shimomura flög därför till den amerikanska kontinenten för att ta tag i forskningen om ett annat naturligt självlysande material. Maneten Aequorea victoria yttersta kant hade visat sig lysa i grönt när den skakades om (Kungliga Vetenskapliga Akademin, 2008). Figur 1. Maneten Aequorea victoria lever i havet utanför den amerikanska västkusten. Manetens självlysande organ ligger längs den paraplyformade kroppen. Hela sommaren året därpå samlade Shimomura och Johnson maneter i Friday Harbor på den amerikanska västkusten. Shimomura upptäckte att om man lägger maneterna i en lösning av kalciumklorid kommer dess ringar ge ifrån sig grönt ljus. Om man lade samma maneter i destillerat vatten började deras ringar istället att fluorescera i blått. Om man slutligen bestrålade maneterna med ultraviolett strålning gav de ifrån sig en ljusgrön ring av ljus liknande den som orsakades av kalciumklorid (Shimomura, 1998). Johnson och Shimomura klippte av maneternas kanter och pressade dem genom ett filter till en flytande vätska. De samlade råmaterial hela sommaren och hade sedan med sig extrakt från ca maneter hem till Princeton (Kungliga Vetenskapliga Akademin, 2008). De båda vetenskapsmännen renade extraktet till en lösning av ett protein de kallade aequorin. I denna i övrigt blålysande vätska upptäckte de ett protein som fluorescerade i grönt. De första mätningarna av fluorescensen gjordes Aequorin visade ett brett fluorescensspektrum vid 460 nm medan det gröna proteinet gav ett skarpt spektrum vid 508 nm. Exktraktet innehöll uppenbarligen två proteiner, aequorin och detta gröna proteinet, där det första fluorescerar i kalciumkloridlösningar och det senare under UV-ljus (Shimomura, 1998). 8

9 Det gröna proteinet döptes senare om till grönt fluorescerande protein, förkortat GFP. 2.2 Egenskaper hos GFP och dess derivat Struktur På sjuttiotalet började Shimomura studera strukturen hos GFP, eftersom denna kunde ge mycket viktig information som kunde leda till ett vidgat användningsområde för proteinet. Detta var ett arbete som under den tiden ansågs extremt svårt, men som slutligen gav väldigt mycket (Shimomura, 1998). Det naturliga proteinet, det som upptäcktes i Aequorea victoria, består av 238 aminosyror formade likt en vanlig aliminiumburk. Denna så kallade β-barrel består av elva strängar, vars struktur också hålls ihop av α-trådar. Det mesta av proteinets primära struktur går åt till att forma dessa två (Ehrenberg, 2008). Figur 2. Proteinets tertiära struktur Kromoforen Nästan mitt i cylindern återfinns proteinets kromofor, den enhet som absorberar och avger ljus i olika våglängder. Denna utgörs av tre aminosyror på plats i primärstrukturen, Ser-Tyr-Gly. Det exciterande (absorberande) spektrumet hos GFP har en klar topp kring 400 nm och en klart mindre kring 470 nm. Det emmiterande spektrumet har en skarp topp kring 505 nm och en mindre utsträckning vid 540 nm (Ehrenberg, 2008). Se figur 3. Figur 3. Den fluorescerande kromoforen Övriga inverkningar GFP är normalt sett helt ogiftigt, till och med i de fall de förekommer i stora koncentrationer i organismer, och har även då minimal effekt på organismens fysiologi. Det är till och med så att när GFP sätts ihop med ett annat protein kommer båda proteinerna Figur 4. Kromoforens spektrum. till fullo behålla sina egenskaper. Dessa oväntade observationer är det som gjort GFP till ett oerhört kraftfullt verktyg inom forskningen GFP-familjen Nobelpristagaren Roger Tsien gjorde ett stort bidrag till vad som kan kallas GFPrevolutionen genom att under 90-talet och senare ta fram varianter av proteinet Klon ing av GFP 9

10 som lyste i andra färger. Han studerade GFP-kromoforens tre aminosyror och fick förståelse för dess mekanism genom att laborera med att byta ut aminosyror. Med hjälp av genteknik byttes aminosyrorna ut till kombinationer som kunde absorbera och avge ljus i andra våglängder. Tsien utvecklade varianter som lyste i cyanblått, blått, gult och även rött. Dessa varianter kunde också lysa både starkare och längre. Det finns idag proteiner som lyser i alla regnbågens färger (Kungliga Vetenskapliga Akademin, 2008). Figur 5. Spektrala egenskaper hos olika derivat av GFP. År 1996 tog den danske forskaren Ole Thastrup patent på ett nytt derivat kallat egfp, vilket stod för Enhanced Green Fluorescent Protein. Detta protein fluorescerade betydligt starkare i celler, vilket kraftigt ökade dess användbarhet. Proteinet var även användbart i högre temperaturer, mellan C, till skillnad från det naturliga GFP, vilket är mest effektivt vid de betydligt lägre temperaturer som råder i havet vid den amerikanska västkusten (där Auquorea victoria lever) (United States Patent and Trademark Office, 2001). Proteinet är med sina förbättrade egenskaper också bättre anpassat för eukaryota celler (Backman, 2010) Användningsområden Den mest intressanta delen med GFP-familjen är dess potential som forskningsverktyg. Dess mycket speciella egenskaper gör att ett protein kan fästas i vilka andra proteiner och organeller som helst Figur 6. En av San Diegos stränder illustrerad enbart med hjälp av levande bakterier på en agarplatta. Bakterierna har manipulerats till att tillverka olika derivat av GFP. utan att någon av delarna förlorar eller ändrar sin funktion. Proteinet behöver dessutom inget annat än inkommande ljus i rätt våglängd för att avge fluorescens. Ett fluorescerande protein kan därför användas för att markera olika delar i cellens dynamiska processer, där dess fluorescens gör det enkelt att övervaka dem. Uppfinnandet av protein som fluorescerar i olika färger har gjort det ännu enklare att med hjälp av olika färgmarkörer kunna observera samspel mellan olika delar i levande processer i alla former av organismer (Valdivia, R. et al., 1998). 10

11 Ett spektakulärt exempel på en sådan användning är det experiment som kom att kallas the Brainbow Experiment. År 2007 undersökte ett team forskare på Harvard möjligheten att undersöka det neurologiska nätverkets arkitektur (hur hjärnan ser ut) med hjälp av hela färgpaletten av fluorescerande proteiner. Resultatet var en mushjärna vars neuroner var färgade i sammanlagt 90 olika färger. Neuronernas kopplingar till varandra genom synapser gick att följa obehindrat över tid (Livet, o.a., 2007). Figur 7. The Brainbow Experiment. Bild tagen av Jean Livet på Dr. Jeff Lichtman Laboratory, Harvard University. Bilden vann första pris år 2007 i Olympus BioScapes International Digital Imaging Competition. GFP kan också användas inom helt andra områden som sensor för arsenik och tungmetaller. Forskare har kunnat genmodifiera arsenikresistenta bakterier så att de i närvaro av arsenik börjar lysa grönt. Några av världens största giftkatastrofer har orsakats av spridning av arsenik i vattenbrunnar i stora delar av Sydostasien. Naturligt förekommande arsenik är där ett gigantiskt problem, där grönt fluorescerande protein blir en oväntad del av lösningen. Forskare har också lyckats modifiera bakterier så att de på ett liknande sätt fluorescerar i närvaro av sprängämnet TNT eller tungmetallerna kadmium och zink (Kungliga Vetenskapliga Akademin, 2008). Vad GFP och dess derivat i framtiden kan komma att användas till sätter endast den mänskliga fantasin gränser för. Som verktyg har det en oerhörd potential. Sedan 1992 har det redan publicerats mer än vetenskapliga artiklar med koppling till GFP, och detta räknat år Upptäckten har lett till att mänskligheten nu kan se och upptäcka saker som inte har gjorts tidigare på ett sätt som får upptäckten av GFP att likna uppfinnandet av mikroskopet. 11

12 3. Laboration 3.1 Teori Arvsmassan i en bakterie Bakteriecellens relativt enkla uppbyggnad gör den mycket lämplig för enklare studier om förändringar i arvsmassa. Bakteriers evolutionära fördel är just deras stora anpassningsförmåga, vilken i grunden beror på snabba mutationer som kan slå igenom i stora kolonier mycket snabbt. De har även en förmåga att föröka sig mycket snabbt om de sätts i rätt miljöer (Becker et al., 2003). Dessa encelliga organismer är alla Figur 8. Översikt över en bakterie. utan någon form av cellkärna, och kallas därför för prokaryoter. En bakteries arvsmassa, DNA, ligger därför utspritt i cellen både i form av kromosomer och i form av s.k. plasmider (Becker et al., 2003). I övrigt innehåller bakterier inga som helst membranförsedda organeller såsom mitokondrier och kloroplaster, och saknar också både golgiapparat och endoplasmatiskt retikulum, allt detta i motsatt till eukaryota celler. Arvsmassan i bakterier består i huvudsak av den längre kromosomala DNAsträngen formad i en oregelbunden kropp kallad nukleoid. Plasmider är dubbelsträngat DNA som oftast är format i cirklar vars omkrets kan variera från 1 till 1000 kbp (tusen baspar). Likadana plasmider kan finnas i flera tusen kopior i en enda cell (Backman, 2010; Snyder & Champness, 1997) Vektorer Just plasmider är av stor nytta och stort intresse inom genetik och bioteknik där de kan fungera som verktyg, antingen för att göra ett stort antal kopior av en gen eller för att låta en gen komma till uttryck i form av proteiner, vilket oftast är slutsteget i genuttryck. Plasmider som används inom gentekniken kallas allmänt för vektorer. En vektor är ett gentekniskt verktyg som inte nödvändigtvis behöver bestå av plasmider, utan lika gärna kan vara till exempel virus (virala vektorer), så länge de fungerar för ett liknande syfte (Becker et al., 2003). Virala vektorer är mer komplicerade och har fler användningsområden. De särskiljer sig genom sin förmåga att kunna förändra arvsmassan permanent i en Klon ing av GFP 12

13 värdorganism, till skillnad från plasmider som endast lämpar sig för redan lättmuterande bakterier. Virala vektorer kan förutom forskning användas till både vaccinering och genterapi (Becker et al., 2003). Förutom indelningen i virala vektorer och plasmidvektorer så finns det ytterligare en indelning: i expressionsvektorer och transkriptionsvektorer. I laborationen som beskrivs på kommande sidor används en expressionsvektor tillsammans med en gen som kodar för egfp (Enhanced Green Fluorescent Protein) för att få bakterier att producera proteinet. Vektorn, som är en plasmid, tar sig likt alla expressionsvektorer till utryck i ett protein som resultat. Detta skiljer dem från transkriptionsvektorer, vars gener inte ger utslag längre än till transkription till RNA i proteinsyntesen (se 3.1.4) Kontrollerad odling av bakterier Odling av bakterier sker på ett odlingsmedium av agar på platta eller i odlingsvätska i odlingskolv, ibland med vissa tillsatser. I en näringslösning kan koncentrationen av bakterier mätas med hjälp av ultraviolett strålning. En bakterielösnings optiska absorption av UV-ljus (mätt vid 600 nm) kommer vara proportionell mot dess koncentration enligt: A = ε l c (Lambert-Beers lag ) Där A är lösningens absorption, ε är lösningens extinktionskoefficient, l är provets längd, och c är dess koncentration. I denna laboration så kan ε och l betraktas som konstanter, eftersom dessa storheter inte varieras vid olika mätningar (Lehninger et al., 1993). Således erhålls följande ekvation: A = k c Koncentrationen av bakterier i en lösning är alltså direkt proportionell mot dess optiska absorption (som mäts i en logaritmisk skala), och kan användas till att övervaka mängden bakterier i en lösning över tid. (Backman, 2010; Lehninger et al., 1993) Proteinsyntesen från DNA till protein En expressionsvektor ska i en cell kunna leda till produktion av det protein den kodar för. Därför har det viss betydelse att förstå hur syntes av protein fungerar i en cell. Figur 9 beskriver detta utförligt. I denna laboration används en så kallad inducerare för att sätta igång proteinsyntesen av egfp när väl den kodande genen finns på plats. En inducerare är en speciell molekyl som triggar igång transkriptionen (steg 1 i figur 9) av ett segment av DNA. Ett sådant segment av DNA som kan kodas till ett motsvarande protein kallas för en operator. Syntesen av vissa proteiner i en cell kontrolleras med hjälp av repressorer. En repressor är en molekyl som, när den är aktiv, binder till en operator och som därigenom hindrar RNA polymeras från att binda till samma segment. På så sätt hindras transkriptionen av operatorn (Becker et al., 13

14 2003). Figur 9. Proteinsyntesen i en cell. Steg 1 kallas normalt för transkription och sker genom att en blandning nukleotider (RNA polymeras) binder till de separerade DNA-strängarna och därigenom skapar mrna. En inducerare fungerar så att den binder till en aktiv repressor och tvingar den att ändra form, vilket omöjliggör en bindning till operatorn. Detta leder till att RNA polymeras kan binda till samma segment, och transkription kan därför sättas igång (Becker et al., 2003). I denna laboration används en helt syntetisk inducerare kallad IPTG (isopropylthiogalactoside) för att sätta igång syntesen av egfp i bakteriecellerna. 14

15 3.1.5 Genteknikens grund att ge en organism nya egenskaper Efter att ha presenterat grundläggande fakta om arvsmassan i bakterier, hur arvsmassa kommer till uttryck i proteiner och det fundamentala gentekniska verktyget vektorn kan fokus nu riktas mot genteknikens grundläggande processer. Grunden för genteknik är idén att ge en organism nya önskade egenskaper. I detta fall koncentreras fakta endast på bakterier och processen genomförs i flera steg enligt nedan: Isolera sökt gen Tillverka större mängder av genen i fråga Sätt ihop en plasmid av genen tillsammans med lämplig expressionsvektor o Restriktion av både genen och vektorn o Ligering av de restrikterade generna och vektorerna Transformera mottagliga (kompetenta) bakterier med plasmid Odla de transformerade bakterierna i större skala i ett selektivt medium Figur 10. Översikt över genmanipuleringens principer. 15

16 I detta fall söks det att transformera bakterier med gener för egfp (Enhanced Green Fluorescent Protein). Följande rubriker går igenom varje steg i processen Isolera och extrahera Det börjar med att hitta en gen som när den kommer till uttryck ger önskade egenskaper. I det här fallet är det en gen som i en cell ger upphov till produktion av egfp. Under laborationen tillhandahölls genen lagrad i en bakteriekultur. För att extrahera DNA, andra makromolekyler eller olika cellorganeller är centrifugering en central metod. Metoden baseras på faktumet att när en partikel utsätts för en centripetalkraft så kommer dess rörelse genom en specifik lösning bero på partikelns storlek och densitet liksom lösningens densitet och viskositet (Becker et al., 2003). Större storlek och högre densitet hos en partikel gör att den rör sig fortare genom lösningen: Dess sedimenteringsgrad är högre. Eftersom det finns väldigt stora skillnader i sedimenteringsgrad hos olika makromolekyler och organeller kan de därför skiljas åt genom centrifugering (se figur 11). I laborationen extraheras både DNA och proteiner genom centrifugering. Figur 11. Sedimenteringskoefficienter och densitet hos olika makromolekyler och organeller. Sedimenteringskoefficienten mäts i Svedbergsenheter (S). Den visar hur fort en enhet rör sig i ett medium när den utsätts för en centripetalkraft. 1 S motsvarar sekunder. En enhets densitet avgör hur långt den kommer röra sig i ett medium vid centrifugering. Vid laborationen användes ett färdigt kit för extrahering av plasmid-dna ur prokaryota celler kallat QIAprep Spin Miniprep Kit. Med hjälp av medföljande buffertar löses provets cellmembran upp, varefter allt centrifugeras i en särskild tvådelad kolumn (se figur 18), vars inre del innehåller en gel av silika som absorberar plasmid-dnat. Provet kan därefter renas med medföljande buffertar och DNAt extraheras i en lösningsbuffert (QIAGEN, 2010). 16

17 Exakt tillvägagångssätt återfinns i utförandedelen PCR polymeraskedjereaktion Med PCR (polymerase chain reaction eller på svenska polymeraskedjereaktion) är det möjligt att tillverka väldigt stora mängder av en gen med en väldigt liten volym som utgångspunkt. Det är en metod som är både snabb och billig, och som därför har blivit den överlägset mest använda tekniken för kopiering av DNA (Veilleux, 2010). För att kunna genomföra en PCR krävs först att DNA har extraherats och finns färdigt. Därefter blandas en lösning innehållandes alla komponenter som krävs för att tillsammans med DNA-provet kunna sätta samman nya DNA-strängar. En sådan blandning kallas Master Mix (Veilleux, 2010). En Master Mix ska innehålla följande: Buffert, vars syfte är att hålla lösningen vid rätt ph för att PCR-reaktionen ska kunna äga rum Deoxynukleotider, vilka tillhandahåller både energin och byggstenarna för DNA-syntesen. Lösningen ska innehålla lika delar av alla nukleotider. AmpliTaq polymeras, ett värmetåligt enzym som kan sätta ihop deoxynukleotiderna med DNA-provet DNA-provet självt Primers (se nedan) Ibland vatten, avjoniserat och filtrerat En s.k. primer är ett kort segment av nukleotider som fungerar som en startpunkt för uppbyggnad av DNA. Primers är nödvändiga i denna process eftersom att enzymerna som katalyserar reaktionen (som inom PCR kallas AmpliTaq) bara kan sätta ihop nukleotider till ett redan existerande dubbelsträngat DNA-segment (Backman, 2010; Snyder & Champness, 1997). Efter att en Master Mix är tillredd så är nästa steg uppvärmning i cykler. 1. Lösningen hettas först upp för att denaturera DNA:t så att strängarna separeras. 2. Därefter sänks temperaturen så att primers kan kopplas ihop till strängarna med vätebindningar. 3. Temperaturen höjs sedan igen så att AmpliTaq kan koppla ihop nukleotiderna med primerändarna. Därefter startas en ny cykel (Tamarin, 1996). Se figur 12 för illustration över cyklernas gång och utförandedelen för ett praktiskt exempel. Temperaturförändringarna kontrolleras och automatiseras lättast med hjälp av ett programmerbart elektriskt element (Silvestri, 2008). Efter ungefär tjugo cykler kommer det finnas miljoner kopior av DNAt, och efter trettio cykler flera miljarder. Antalet ökar alltså exponentiellt (Tamarin, 1996). 17

18 Figur 12: Illustration över de olika stegen i en polymeraskedjereaktion Rekombinering av DNA Utvecklingen inom genteknik har gjort det möjligt att kombinera vilka segment som helst av DNA och därigenom skapa så kallat rekombinerat DNA (rdna). Detta har i denna laboration gjorts genom att kombinera en gen för egfp med en expressionsvektor till en plasmid. Det rekombinerade DNAt kan sedan införas i bakterier (Becker et al., 2003). 18

19 Expressionsvektorn som används i laborationen kallas pet-tev. Denna innehåller en gen för antibiotikaresistens. Detta möjliggör selektion av icke transformerade bakterier (se stycke i ). Rekombineringen sker i två steg, båda med hjälp av enzymer, vilket illustreras av bilden nedan. Det första steget är restriktion, där DNAt från de två olika proven (genen för egfp och expressionsvektorn) klyvs vid vissa baspar för att de senare ska passa ihop. Klyvningen styrs av restriktionsenzymer vilka bryter av basparens bindningar vid rätt ställen för att i nästa steg kunna anslutas med varandra (Becker et al., 2003). I laborationen används två stycken restriktionsenzymer kallade Xhol och BamH1. Att använda två olika enzymer ger olika restriktionsändar vilket minimerar risken för att generna ligeras felvänt (se nedan) (Backman, 2010). Eftersom enzymerna gör en bruten (ojämn) klyvning med överhängande baspar så ger det att ändarna är klistriga och som enkelt kan kombineras med DNAsegment som har kompletterats med motsvarande ände (Becker et al., 2003). I laborationen görs kompletteringen endast hos egfp-genen medan expressionsvektorn direkt kan brytas upp. I båda fall renas de restrikterade generna med olika buffertar. Figur 13. Översikt över restriktionens principer Det andra steget är ligering (limning). De restrikterade DNA-segmenten kommer automatiskt att fastna i varandra med hjälp av sina klistriga ändar. De binds ihop till kovalenta bindningar med hjälp av ett särskilt enzym kallat DNA ligas. Denna reaktion kräver en viss inkuberingstid. 19

20 Ligeringen bör ske i så liten volym som möjligt (eller så hög koncentration som möjligt) för att öka chansen att molekylerna stöter på varandra. Ligeringen bör också ske i relativt låg temperatur. Detta ger långsammare rörelser hos molekylerna vilket ökar sannolikheten för att ligaset ska hinna bilda bindningarna mellan ändarna. En lägre temperatur sänker också reaktionshastigheten och gör att inkuberingstiden måste förlängas (Silvestri, 2008). Trots att man använder olika restriktionsenzymer kan det också hända att två vektorsegment binder till varandra till en dimer, en form av jätteplasmid. En sådan plasmid innehåller då dubbla uppsättningar antibiotikaresistens och överlever därmed selektivt medium. För att motverka detta tillsätts genfragment (för egfp) i överskott (Silvestri, 2008) Transformering av bakterier Den rekombinerade vektor som fåtts efter restriktion och ligering kan sedan kopieras genom att sättas in i bakterier. Avkommor till de bakterier som tagit upp plasmiden kommer också innehålla samma plasmid. Praxis är att plasmiden införs i tarmbakterien E. coli, något som görs också i denna laboration (Becker et al., 2003). För att föra in plasmiden i bakterierna måste man använda bakterier som artificiellt har gjorts mottagliga, så kallade kompetenta bakterier. Detta kan göras på olika sätt, vilka alla ger bakterier med små porer för att kunna ta upp plasmider. I denna laboration finns kompetenta bakterier redan tillgängligt; någon kompetensodling behöver därför inte göras. Värmechocker och isbad används för att vidga porerna så att plasmiderna kan tas upp (Silvestri, 2008). Alla de bakterier som erhålls vid transformering bär sannolikt inte på rätt rekombinerade vektor, vilket kan bero både på fel under ligeringen och under transformeringen. De bakterier som innehåller den önskade plasmiden kan skiljas ut under odlingen genom så kallad selektiv odling (Becker et al., 2003). Detta innebär att antibiotika tillsätts i odlingsmediet. Eftersom expressionsvektorn pet-tev ger antibiotikaresistens kommer de bakterier som tagit upp plasmiden att överleva denna odling, medan de andra kommer dö (Backman, 2010). Selektiv odling skiljer ut de flesta oönskade bakterierna, men fortfarande finns det en viss sannolikhet att bakterier med dimerer av expressionsvektorn överlevt. För att kontrollera att bakterierna verkligen har rätt gener kan man använda elektrofores (se nedan) för att undersöka om arvsmassan är rätt. I fallet med egfp-genen kan man dessutom se med blotta ögat om rätt rekombinerat DNA tagits upp genom att bakteriekolonierna bör fluorescera grönt vid belysning med ultraviolett strålning Elektrofores Celler innehåller som bekant ett stort antal olika makromolekyler som alla måste separeras från varandra för att kunna undersökas. Ett av de absolut vanligaste sätten att göra detta med är genom elektrofores. Elektrofores går ut på att genom ett elektriskt fält separera molekyler som utifrån olika laddningar och storlek kommer att vandra genom ett medium i det elektriska fältets riktning. 20

21 Mediet kan bestå av papper, acetat (en konstfiber), stärkelse, polyakrylamid eller agaros (Becker et al., 2003) Elektrofores av DNA Elektrofores av DNA genomförs i medium bestående av agaros (en polysackarid), polyakrylamid, eller en blandning av båda. Oftast separeras DNA-fragment i neutrala ph-miljöer, då DNA på grund av dess fosfatgrupper är negativt laddat. Fragmentet appliceras då i en kolumn i gelen vid en katod (minusladdad) och kommer röra sig genom gelen mot anoden (plusladdad). Kolumnerna läggs i ett bad med en strömförande buffert. Hur långt fragmentet kommer röra sig beror på dess längd. Det elektriska fältet kopplas bort då fragmenten anses vara tillräckligt utspridda (Rickwood & D., 1990). Figur 14. Översikt över elektrofores av DNA. Som det kan ses i figur 14 tillsätts också i en kolumn en blandning av DNAfragment av olika storlekar, ett så kallat referensmedium. När analysen är klar kan alltså DNA-provets resultat jämföras med referensmediet, varifrån man får provfragmentets längd (Becker et al., 2003). I den laboration som finns beskriven senare i denna rapport används en gel av agaros för elektrofores av DNA. Sådana geler kan användas för att analysera dubbelsträngade DNA-fragment från en längd av 70 bp (baspar), då en 3%-ig gel av agaros, och upp till bp, då med en 0,1%-ig agarosgel. (Rickwood & D., 1990) När elektroforesen är klar och strömkällan kopplats bort kan DNA-fragmenten visualiseras genom färgning. Vanligtvis (och även i denna laboration) används färgämnet etidiumbromid, som binder till DNA och fluorescerar i blålila när det exponeras i ultraviolett strålning. (Becker et al., 2003) Elektrofores av proteiner Elektrofores av proteiner sker i en process som normalt kallas SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). (Becker et al., 2003) Även i denna laboration används SDS-PAGE för att separera proteiner. 21

22 Principen för SDS-PAGE liknar i mångt och mycket principen för vanlig elektrofores (se bilden nedan). Den största skillnaden är att korrelationen mellan proteinets längd och laddning är betydligt lägre jämfört med hos DNA. Hur snabbt proteinerna rör sig genom det valda mediet beror på dess form, storlek och laddning. Dess form och laddning kan modifieras till att bli direkt proportionella mot dess storlek. (Rickwood & Hames, 1990) Figur 15. Översikt över elektrofores av proteiner med SDS. Tillsatts av SDS gör att proteinerna denaturerar och formas till styva lipidstavar. Deras form blir på så sätt direkt proportionell mot storleken. SDS har även ännu en funktion. Då proteinerna veckar upp sig täcks de också av negativt laddade dodecylsulfatjoner som dränker aminosyrornas egna laddningar och på så sätt ger hela proteinet en negativ nettoladdning direkt proportionell mot dess längd (Backman, 2010). När gelen för elektroforesen förbereds tillsätts ofta, och så även i denna laboration, en s.k. stacking-gel som kommer att hjälpa till att ge ett skarpare resultat vid analysen. Detta görs genom att gelen innehåller kloridjoner som rör sig snabbare än proteinerna genom mediet. Elektroforesbufferten som sedan tillsätts innehåller glycinjoner som rörs sig långsammare än proteinet genom gelen. Detta gör att proteinet kommer vara fångat mellan klorid- och glycinjonerna och därför ge ett skarpt band som resultat (Promega Biotech, 2010). 22

23 Efter att analysen är klar måste proteinbanden visualiseras med ett färgningsämne. Här används Commassie brilliant blue, ett ämne som också används för infärgning av jeans och som enbart binder till proteiner (bomull består av fiberproteiner) HPLC och his-taggar Vissa proteiner kan tillverkas med en så kallad his-tag (efter engelskans polyhistidine tag), vilket är en form av utskott, en krok, bestående av en aminosyra på proteinet som har vissa speciella egenskaper. Den expressionsvektor som används här, pet-tev, kodar bland allt annat för en histag som binder till nickel (Backman, 2010). Den egenskap som his-taggen ger upphov till kan användas för att separera proteinet från övriga substanser. I laborationen får en lösning med egfp och andra makromolekyler passera en kolumn täckt med nickel i en så kallad HPLCapparat (High Performance Liquide Cromatography, eller högupplösande vätskekromatografi). Detta efter att cellerna förstörts med ultraljud, och att resterna genom centrifugering slungats till botten. Proteinet återfinns då löst i vätskan. Figur 16. En his-tag som utgör en del i en plasmid Proteinet kan sedan extraheras i ett eget rör genom att spola kolumnen med Imidasol. Imidasol är en aminosyralösning med samma egenskap som proteinets his-tag, med det tillägget att den binder starkare till nickel. Därför kommer Imidasol gradvis tränga ut egfp, som kan samlas upp i eget rör. Figur 17. Översikt över en HPLC-process. När vätskan passerar detektorn mäts dess absorbans av UV-ljus, vilken sedan kan ses på datorn. 23

24 3.2 Utförande Utförandet till denna laboration spänner sig över fem dagar. För att få en översikt över de olika laborationsmomenten, se Bilaga 1 Översikt över laborationen Isolering av GFP och expressionsvektor Denna laborations första steg bestod av att ta fram bakterieceller med gener för egfp och celler med gener för expressionsvektorn pet-tev. 3,0 ml av egfp-lösningen fördelades i två kyvetter 3,0 ml av pet-tev-lösningen fördelades i två kyvetter. De fyra kyvetterna centrifugerades för att få fram cellerna. Efter 1 min centrifugering återfanns cellerna som en klump i botten. Resten av lösningen sögs ut och ytterligare 1,5 ml av vardera lösningen tillsattes återigen på samma sätt som ovan. Centrifugering och utsugning upprepades ytterligare en gång, detta för att få fram en större mängd celler. Nästkommande steg följer en given mall ämnad för isolering av gener. Ett medföljande kit, som kallas QIAprep Spin Miniprep Kit, inbegriper ett antal buffertar endast namngivna med enkla teckenkombinationer. 250 µl av Buffer P1 tillsattes i vardera kyvett, som nu innehöll klumpar av celler i botten. Denna buffert innehöll även RNaseA och reagenten LyseBlue. Cellerna löstes upp i bufferten genom att kyvetten drogs mot baksidan av ett provrörsställ. Detta skapade kraftiga vibrationer i kyvetten som gav en homogen men något grumlig lösning. I följande två steg var försiktighet tvungen att iakttagas när kyvetten vändes för att blanda lösningen. Lösningen innehöll nämligen både kromosomalt DNA och plasmid-dna. Det kromosomala DNAt, som är betydligt större, kan i värsta fall brytas sönder och blandas med plasmid-dnat. Dessa måste i dessa steg kunna skiljas åt genom sin skillnad i storlek, eftersom allt kromosomalt DNA är oönskat. 250 µl av Buffer P2 tillsattes. Kyvetten vändes 4-6 ggr för att blanda lösningen. Här verkade reagenten LyseBlue från Buffer P1och lösningen blev blå. Homogen blandning uppnåddes när den blå färgen är jämnt fördelad i lösningen. 350 µl av Buffer N3 tillsattes genast och blandades omedelbart genom vändning. Den blå färgen försvann och lösningen blev grumlig. Lösningen centrifugerades i 12 min. I botten av kyvetterna syntes därefter en vit komprimerad klump som var rester (proteiner, organeller, membran, kromosomalt DNA m.m.) De fyra lösningarna flyttades sedan över till särskilda kolumner för QIAprep som är i 2 delar. 24

25 Lösningarna centrifugerades 1 min. Detta gav en relativt stor mängd lösning i den nedre delen av kolumnen som sugs bort. I övre delen fanns plasmid-dna kvar. Tvättning av den övre delen utfördes genom att tillsätta en Buffer PB och centrifugera ytterligare 1 min. Lösningen i den nedre delen av kolumnen sögs bort. Detta upprepades med en annan buffert (Buffer PE). Lösningen centrifugerades sedan ytterligare 1 min för att få bort det sista av tvättningsbuffertarna. Dessa återfanns sedan i nedre kolumnen som sögs bort. 50 µl av en Buffer EB (10 mm Tris Cl, ph 8,5), en elueringsbuffert, tillsattes. Lösningarna fick stå i ca 1 min för att sedan centrifugeras 1 min. Figur 18. Tvådelad kolumn för QIAprep. DNA återfanns därefter i nedre kolumnen, och övre kolumnen kastades. Nedre delen med lösning kyldes med is PCR av gener plus primer En PCR-lösning blandades enligt: 25 µl av PCR Master Mix tillsattes till vardera kyvett (2 st) 5 µl av vardera primer (10 pmol/µl) tillsattes 2 µl av egfp-lösningen tillsattes 13 µl vatten, avjoniserat och filtrerat, tillsattes Denna lösning centrifugerades kort för att blandas ordentligt. För att köra PCR användes ett elektriskt element med ett program. Programmet såg ut som följer: 1. Upphettning 90 5 min min min min Steg 2-4 upprepades 29 ggr, vilket gav 30 cykler. Total tid för denna procedur var ca 2 h och 40 min. PCR-produkterna sattes sedan i kyl för natten Restriktion Restriktion gjordes genom att tillreda en buffert som tillsattes i vart och ett av de rör som innehöll gener, de som genomgick PCR. Tillredning av buffert gjordes enligt: 2 µl Xhol (enzym) 3 µl BamH1 (enzym) 25

26 12 µl 10x buffert Samma mängd tillsattes i varje rör. Rören centrifugerades kort och inkuberades därefter i 37 C i 2 h Förberedande av agarplattor Sex agarplattor förbereddes för odling av de bakterier som skulle transformeras. Endast två stycken beräknades komma till användning, men ytterligare fyra förbereddes som reserv. Agarn värmdes i mikrovågsugn för att smälta. Totalt 80 ml tillsattes på de sex plattorna (ca 13 ml på varje). Av dessa 80 ml var 40 ml vanlig agar och 40 ml LB-lösning, en form av odlingsmedium. Plattorna sattes på vattenbad 55 C för att svalna. Detta för att antibiotika skulle kunna tillsättas. Stamlösning av antibiotika (Carbenicillin, 50µg/ml) 80 µl (1000x) tillsattes, 13 ml lösning på varje agarplatta. Agarplattorna märktes LB/Cb o LB stod för odlingsmediet och Cb för antibiotika Reningsprocess av restrikterade produkter De restrikterade produkterna var tvungna genomgå en reningsprocess inför ligering, vilket gjordes enligt E.Z.N.A Cycle-Pure Kit Spin Protocol. Detta är en färdig metod som använder sig av ett kit med färdiga buffertar för att på ett enkelt sätt förädla restrikterade produkter. Stegen för denna genomfördes enligt följande: 1. Volymen hos PCR-produkterna bestämdes till 60 µl volymer skulle adderas av Buffer CP enligt instruktion. Därför adderades 250 µl 3. Lösningarna centrifugerades kort 4. En kolumn kallad HiBind DNA column placerades i en av kitet medföljande uppsamlingsrör (2 ml collection tube) 5. Provet applicerades i kolumnen och centrifugerades 1 min. Det som därefter rann igenom till den yttre kolumnen sögs bort. 6. Kolumnen tvättades med 700 µl DNA Wash Buffer utspädd med absolut etanol (40:60). Kolumnen centrifugerades 1 min, och överflödet sögs ut. 7. Steg 6 repeterades på samma sätt, fast med mängden buffert minskad till 500 µl. Kolumnen centrifugerades i 1 min och överflödet sögs ut. 8. Kolumnen centrifugerades utan tillsatta buffertar i 2 min för att få ut överflödiga buffertar 9. Inre kolumnen placerades i en ren 1,5 ml mikrocentrifugeringstub µl EB (10 mm Tris, ph 8,5, en elueringsbuffert) adderades till kolumnen Ligering Ligeringen genomfördes genom tillredning av buffertblandning med express ionsvektor och egfp-gener tillsatt. Buffert T4 DNA Ligase 2 µl 26

27 Polyetylenglykol 2 µl 2 µl T4 DNA Ligase 5 µl egfp (tillsätts i överskott) 2 µl pet-tev 8 µl destillerat filtrerat vatten Total mängd 20 µl Blandningen inkuberades sedan i 22 C i 1 h Transformering av bakterier Institutionen kunde tillhandahålla färdigt kompetensodlade bakterier inför transformeringen. Bakteriecellerna blandades med den ligerade plasmidlösningen enligt nedan och utsattes sedan för en värmechock. 5 µl plasmidlösning tillsattes i röret med kompetenta celler. Värmechock (42 C) i exakt 90 s. Röret lades i isbad 5 min 0,8 ml av ett tillväxtmedium tillsattes. Detta medium innehöll mer glukos och magnesium än andra vanliga tillväxtmedium, men innehöll denna gång ingen antibiotika Inkuberades i 37 C i en timme Därefter förbereddes en av odlingsplattorna med IPTG. Detta ströks ut jämnt och absorberades av agarn. Hälften av de transformerade bakterierna skulle odlas på denna platta, och den andra hälften på en annan platta, utan några övriga tillsatser. De två odlingsplattorna sattes på torkning i 37 C i 30 min 0,4 ml av de transformerade bakterierna ströks ut på var platta Satt på tillväxt i 37 C under natten Förberedande av Master Mix inför PCR Inför PC R förbereddes en MasterMix-lösning enligt nedan: 20 st kyvetter -> 200 µl lösning totalt o 100 µl Master Mix Denna var av koncentrationen 2x, vilket betyder att mängden lämpar sig för en blandning på totalt 200 µl i detta fall Lösningen innehöll deoxynukleotider, en buffert för att hålla ph på rätt nivå under PCR, samt AmpliTaq polymeras, ett i värme stabilt enzym som kan addera nukleotiderna till DNA-provet o 20 µl primer + o 20 µl primer o 60 µl vatten, avjoniserat och filtrerat Centrifugeras kort 10 µl tillsattes i varje PCR-rör 27

28 3.2.9 Enskilda kolonier isoleras för odling och sätts på PCR Då bakterieodlingarna stått varmt och växt under natten fluorescerade kolonierna i grönt. 20 kolonier isoleras för enskild uppodling (för kommande bruk) och samtidigt PCR. En agarplatta med ett rutsystem bakom åtskiljer kolonierna. Cellerna ströks ut med pipett och blandades i en egen PCR-kyvett med samma pipett. På detta sätt odlades bakterier från samma koloni i större skala enskilt samtidigt som den sätts på PCR. Hälften av de kolonier som valdes ut kommer från den odlingsplatta som innehöll IPTG, medan andra hälften kom från den andra odlingsplattan Tillredning av gel till elektrofores Gelen som förbereddes till elektroforesen tillreddes enligt följande: 0,25 g agaros tillsattes i ett rör 0,5 ml TAE Buffer TrisAcetatEDTA (50x) o Fylldes upp med vatten (avjoniserat och filtrerat) till 25 ml Dessa fick lösas tillsammans i burk under uppvärmning i mikro, därefter 5 min avsvalning i 50 C skåp Lösningen hälldes i gjutform med 12x2 stegpinnar för DNA Elektrofores av PCR-produkter Elektrofores av DNA-proven genomfördes enligt samma princip som beskriven i teoridelen, med detaljer nedan. En balja fylldes med buffert för strömföring DNA från de 10 bakteriekolonier med IPTG tillsattes i ena längan DNA från de 10 bakteriekolonier utan IPTG tillsattes i den andra längan Gelen innehöll 2x12 skåror, vilket lämnar två skåror i var länga som fick fyllas med referensmedium Ström kopplades på, och DNAt fick vandra mot pluspol, vilket tog ca 45 min Efter elektroforesen togs gelen ut och sköljdes i vattenbad Gelen lades därefter i bad med etidiumbromid För analys fotades gelen med kamera under UV-ljus Odling av två utvalda kolonier Två bakteriekolonier valdes ut för ytterligare odling, en från odlingsplattan med IPTG och den andra från odlingsplattan utan IPTG. Detta utifrån resultatet av elektroforesen (se Resultat, 3.3.1). Odling skedde enligt följande: 100 ml odlingsmedium (2x LB) tillsattes i två odlingskolvar Antibio tika tillsattes i båda kolvar Bakterier från kolonierna 6 och 16 tillsätts i varsin odlingskolv o Med respektive utan IPTG Dessa sattes på skak i 37 C. Optisk densitet mättes regelbundet vid 600 nm. Koncentrationen bakterier anses vara tillräckligt hög vid en optisk absorption 28

29 kring 0,6-0,7, och IPTG tillsattes då innan vidare odling. Kolonierna fick efter tillsättande av IPTG växa vidare under natten Isolering av GFP De två odlade kolonierna fördelades i centrifugeringsrör. De centrifugerades i en stor centrifug i 15 min i rpm ( xg) i en temperatur på 3 C. Cellerna klumpades på detta sätt ihop sig i botten. De slammades sedan upp till en lösning och hälldes till samma bägare. Bägaren ställdes i ett skåp där det satt en apparat fastmonterad som skickade ultraljud på cellerna, vilket gjorde att de gick sönder. Ultraljud genererar en hel del värme, varför bägaren fick ligga i isbad. Lösningarna centrifugerades därefter 15 min i samma apparat som finns nämnd ovan, detta för att alla rester skulle slungas till botten. Centrifugeringen skedde ungefär som tidigare i rpm, 4 C. Till lösningen tillsattes sedan ett lösningsmedel med glycerol, en ph-indikator och STS (sterylsulfatas). Separering av egfp till en mer koncentrerad lösning skedde genom HPLCapparat. egfp-lösningen fick passera en kolonn med nickel, där proteinet fastnade. Därefter pumpades Imidasol genom systemet, vilket gradvis trängde ut egfp. Lösningen passerade sedan en mätare för UV-absorbans. Apparaten var kopplad till en PC, och där kunde en kurva ses för absorptionen av UV-ljus. Denna sparades och återfinns som Bilaga 2 Prime View Report. Totalt från denna process samlades innehåll upp i sex rör, där de första fyra till största del innehöll gles vätska, det femte hög koncentration av egfp, och det sista rester Analys av GFP Rören analyserades med elektrofores. Till denna förbereddes en gel enligt följande: 4 ml 10%-gel bestående av o gellösning av akrylamid o 10 %-ig separationsgel o 10 %-ig SDS o katalysatorn TEMED o vatten o buffert med joner, vilket underlättar strömföring Stacking-gel. o Innehöll ammoniumperosulfat Detta hälldes i en form med 2x12 stegpinnar Rören med lösningar sattes på varmvattenbad, genom vilket proteinerna denaturerades. 20 µl av lösningarna tillsattes i varje kolumn, och spänning kopplades på i drygt en timme. Provet visualiserades genom tillsatts av den blåa infärgningsvätskan Coomassie brilliant blue. 29