Kloning av möjlig promotorsekvens uppströms kloritdismutas i Ideonella dechloratans.

Transkript

1 Kloning av möjlig promotorsekvens uppströms kloritdismutas i Ideonella dechloratans. Cloning of a possible promoter sequence upstream of chlorite dismutase in Ideonella dechloratans. Lisa Ljungberg Faculty of Technology and Science Biovetenkapligt program, Biokemi Kandidatuppsats i Kemi 15hp Maria Rova Jörgen Samuelsson 26 mars,

2 2 Sammanfattning Perklorat och klorater finns naturligt i atmosfären, varifrån det sedimenterar ner i grundvatten och jord. Utsläpp av klorat och perklorat ifrån jordbruket och pappersbruk leder också till ökade halter i vår miljö. Dessa föroreningarna kan renas med bakterier vilka kan reducera perklorat och klorat till syrgas och kloridjoner. Denna reduktion fungerar dock bäst i en anaerob, syrefri miljö. Med en utökad kunskap om generna, vilka är ansvariga för regleringen och uttrycket av reducerande enzymer kan man modifiera dessa att fungera lika bra i en aerob, syrerik miljö. Ett av dessa enzymer är kloritdismutas. Uppströms genen för kloritdismutas i bakterien Ideonella dechloratans finns en möjlig promotorsekvens. Syftet med detta arbete var att korta ner denna DNA-sekvens för att komma närmare inpå möjliga reglerande sekvenser och inbindningssäte för RNA-polymeras. Därefter kontrollera om sekvensen var en aktiv promotor. Den möjliga promotor region kortades ner och amplifierades med PCR. Sedan ligerades den in i plasmiden pru1103, som bär på en reporter gen. Konstruktionen klonades i Escherichia coli och visade sig kunna bilda produkten av reportergenen. Detta tyder på att sekvensen innehöll en fungerande promotor. 2

3 3 Abstract Perchlorate and chlorate are naturally occurring in the atmosphere, from here it sediments into groundwater and soil. The pollution is increased by discharges of perchlorate and chlorate from agriculture and paper mills. Bacteria capable of reducing perchlorate and chlorate to chloride and oxygen can be used to get rid of these contaminants. However an anaerobic environment needs to be sustained in order for this reaction to be used. For this reduction to work in an aerobic environment as well, a greater knowledge of the reducing enzymes, regulating factors and their corresponding genes is needed. One of these enzymes is called chlorite dismutase. The upstream region of this gene in Ideonella dechloratans bacteria is likely to contain a promoter sequence. The purpose of this work was to shorten this DNA sequence to get closer to the potential regulatory sequences and binding-site for RNA polymerase. Subsequently control if the sequence was active as an promoter. The potential promoter region was shortened and amplified by PCR. It was then ligated into the plasmid pru1103which is carrying a reporter gene. Cloning of the construction into Escherichia coli resulted in a production of the reporter gene product. This indicates that the sequence contained a working promoter. 3

4 4 Innehållsförteckning SAMMANFATTNING... 2 ABSTRACT... 3 FÖRKORTNINGAR INLEDNING MATERIAL OCH METODER PRIMERDESIGN PLASMIDPREPARATION RESTRIKTIONSKLYVNING RENING AV KLUVEN PLASMID PCR LIGERING ELEKTROKOMPETENTA CELLER TRANSFORMATION OCH ELEKTROPORERING RESULTAT OCH DISKUSSION PRIMERDESIGN PLASMIDPREPARATION RESTRIKTIONSKLYVNING RENING AV KLUVEN PLASMID PCR OCH TRANSFORMATION SAMMANFATTANDE SLUTSATS REFERENSER APPENDIX I APPENDIX II APPENDIX III

5 5 Förkortningar PCR - Polymerase chain reaction MCS - Multiple cloning site X-gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Ö. N Över natt PRB - Perklorat reducerande bakterier CRB - Klorat reducerande bakterier FNR - Fumarat och nitrat reduktas bp - baspar cfu - colony-forming unit 5

6 6 1. Inledning Perklorat och klorat är kemiskt stabila i vattenmiljöer och extremt lösliga. Perkloraters stora spridning på jorden kan tyda på en naturlig källa, detta har likaså hittats i grundvatten och ökenmark [1]. Möjligen genereras perklorat och klorat i atmosfären, sedan lagras det i jord och grundvatten. Det faktum att många bakterier har kapaciteten att metabolisera klorater och leva i en kloratrik miljö kan förklaras av att en naturlig källa finns [2]. Klorat och perklorat är starka oxidationsmedel och kan därför ha en mycket negativ inverkan på biologiska system. Perklorat och klorat är farligt för både djur och växter, exempelvis kan perklorat påverka upptaget av jod i sköldkörteln (tyreoidea), jod är essentiellt för att bilda sköldkörtelhormoner. Perklorat binder till natrium-jod symportern och inhiberar på så vis upptaget av jod till sköldkörteln. Detta kan leda till sköldkörtelhormonbrist, hypotyreos [3]. Då sköldkörtelhormoner styr metabolismen kan en felfunktion leda till defekter i tidig utveckling hos barn och foster [4]. Växter som utsatts för klorater fick en förändring i tillväxten, speciellt hos brunalger. Antalet alger minskade kraftigt och i några miljöer slutade algerna att växa [2,5,6]. Klorat verkar dock vara mer toxiskt för brunalgerna jämfört med många andra marina växter som saknar enzymet nitratreduktas. Detta kan bero på kloratets strukturella likhet med nitrat och att det nitratreducerande enzymet nitratreduktas reducerar klorat till dess toxiska form klorit i brunalgerna[2,7]. Trots att det finns belägg för en naturlig källa kan klorater i vatten och jord bäst förklaras genom mänsklig påverkan. Klorater har producerats industriellt under många år, då dessa har använts inom jordbruket som ett ogräs- eller avlövningsmedel. Klorat bildas också som en oönskad biprodukt vid vattendesinfektion och ifrån cellulosablekning av pappersmassa. Trots detta finns för närvarande inga regleringar av klorathalt i drickvatten [8]. Kloraters höga löslighet och mobilitet leder till att de traditionella teknikerna för behandling av avloppsvatten inte är effektiva nog. Biologisk rening har ansetts vara den bästa lösningen då det betraktas vara effektivt och ekonomiskt gynnsamt [1]. Denna biologiska rening tar hjälp av mikrobiell nedbrytning av perklorat eller klorat genom bakteriers respiration. Reduktion av klorat (ClO - 3 ) och perklorat (ClO ) till kloritjoner (ClO 2 ) är en tvåstegsreaktion där perklorat först reduceras till klorat vilket i sin tur reduceras till klorit. Klorit sönderdelas därefter till kloridjoner och syrgas (O 2 ). Syret kan sedan användas som respiratorisk elektronacceptor [9]. 6

7 7 Nedbrytningen av perklorat och klorat sker med tre olika enzymer, perkloratreduktas, kloratreduktas och kloritdismutas. Den ena gruppen bakterier är kapabla att reducera perklorat eller klorat i elektrontransportkedjan för cellandningen. Dessa benämns perkloratreducerande bakterier (PRB). Den andra gruppen kallas kloratreducerande bakterier (CRB) och dessa bakterier har enzymet kloratreduktas. Detta gör att de kan reducera klorat men inte perklorat [10]. Gemensamt för de båda är kloritdismutas, vilket gör detta till ett protein av intresse. För att en klorat- och perkloratreducerande reaktionsväg ska utnyttjas krävs idag en anaerob miljö. Med en ökad kunskap om hur perklorat- och kloratreduktionen regleras kan möjliga regulatorer manipuleras. På så vis kan bakterierna eventuellt utnyttja denna reaktionsväg även under aeroba förhållanden. Detta skulle leda till minskade kostnader och en ökad effektivitet [9]. Ideonella dechloratans är en gramnegativ och stavformad bakterie. Den kan inte bryta ner perklorat men den är däremot en CRB och har förmågan att använda klorat som elektronacceptor i andningskedjan vid frånvaro av syre. Bakterien är fakultativt anaerob. Om syre finns tillgängligt används detta som elektronacceptor men vid syrebrist kan en alternativ källa utnyttjas som klorat eller nitrat. Dock förlorar I. dechloratans förmågan att använda nitrat i elektrontransportkedjan efter ett par subkultiveringar anaerobt på klorat [11]. Det har isolerats omkring 50 arter som tillsammans med Ideonella dechloratans kan reducera perklorat eller klorat. Reduktionen sker i periplasman, utrymmet mellan yttermembran och cellmembran. Det är också här de två kloratnedbrytande enzymerna finns. Kloratreduktas består av tre subenheter vilka kodas av generna clr A, clr B, clr C. Till subenheterna finns även av ett specifikt chaperon som kodas av genen clr D. Kloritdismutas kodas enbart av genen cld. Uppströms om clr A genen i Ideonella dechloratans ligger en möjlig promotor sekvens (Figur 1). Promotor sekvenser är specifika sekvenser i DNA-molekylen till vilka RNA-polymeras binder in. På så sätt leds transkriptionen av DNA till intilliggande gensekvenser. I Escherichia coli binder RNA-polymeraset till en region ungefär 70 baspar innan transkriptionsstart till 30 baspar efter. De baspar i DNA molekylen som korresponderar till de första basparen i RNA molekylen får positiva nummer, medans de som kommer innan RNA start sätet får negativa nummer. Promotorn sträcker sig alltså mellan -70 och +30. Genom analys och jämförelse av promotor regioner i vanliga bakteriestammar har man sett 7

8 8 likheter i två korta sekvenser i positionerna -10 och -35. Konsensus sekvensen vid -10 är (5 ) TATAAT (3 ) och vid -35 (5 ) TTGACA (3 ). Transkriptionen av en gen regleras noggrant i cellen för att endast bilda proteiner i nödvändig mängd. Dessa regleringar sker främst vid RNA-polymeras inbindning och transkriptions initiering, för att spara energi. Proteiner kan binda till regioner både nära och långt ifrån promotorn och på så sätt påverka genuttrycket. Ett repressor protein hindrar RNApolymerasets rörelse igenom eller inbindning till promotorn genom blockering. Repressorn binder till specifika platser i DNA molekylen, så kallad operator. Operatorn sitter generellt nära promotorn. Andra transkriptionsfaktorer kan öka affiniteten eller specificiteten för RNApolymeraset. En aktivator är ett protein som ökar affiniteten till RNA-polymeraset och därför också ökar transkriptionen av en eller flera gener [12]. Det är visat att transkriptionen av cld ökar under anaeroba förhållanden [13], detta kan vara en effekt av transkriptions reglerande sekvenser. Escherichia coli har flera sensormekanismer som ger svar på syretillgångar och närvaro av olika elektronacceptor. Dessa regleringar samordnas av en grupp globala regulatorer vilka inkluderar FNR-proteinet (fumarat och nitrat reduktas) och två-komponent arcab systemet. ArcA, en transkiptionell regulator och arcb, ett sensorkinas. ArcA fosforyleras av arcb vid anaeroba förhållanden. Det aktiverade arca reglerar uttrycket av ett flertal operon, genkluster, involverade i respiratoriska och fermentativa metabolismer [14,15]. I sekvensen uppströms om cld finns en möjlig arca bindande sekvens (Figur 1) och även en FNRliknande sekvens (figur 1). FNR-proteinet hos E.coli är en syrekänslig regulator och aktivator som krävs för att kunna byta ifrån aerob till anaerob metabolism. FNR proteinet binder till den återkommande palindrom liknande sekvensen TTGA(T/C)NNNN(A/G)TCAA vilken ofta är centrerad vid -40 [15]. FNR kontrollerar alltså transkriptionen genom att binda till promotorer under anaeroba förhållanden. FNR homologer har identifierats i många andra bakterier, där dess roll också verkar vara reglering av genuttryck som svar på syre förhållanden [16,17]. 8

9 9 5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTCCCCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCC ACTGGAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCAAA CACATAAAAAAGGAGAAATGCGAAGATTCGTGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACC AAGCCGCCCA GC 3' Experimentell Transkriptionsstart Möjlig FNR-Box Möjliga -10 och -35 sekvenser Möjlig arca bindande sekvens Figur 1 Sekvens uppströms cld i Ideonella dechloratans. Understruket i figuren ses möjlig ArsR bindande sekvens I Ideonella dechloratans har även en ArsR-gen hittats i genklustret för kloratmetabolism. Möjligen kan denna gen vara involverad i den ökade transkriptionen av cld eller clra under anaeroba förhållanden [13]. Sekvensen i Ideonella dechloratans (understruket i figur 1) har likheter med DNA-inbindningssätet för ArsR-regulatorn Rv2034, i Mycobacterium tuberculosis. Rv2034 visades här reglera uttrycket av dosr genen, vilken ger hypoxi, istället för att agera som metallsensor, vilket ArsR främst är förknippat med [18,19]. Dessa sekvenser kan ha en koppling till kloratmetabolismen i anaeroba förhållanden hos Ideonella dechloratans. Ovanstående sekvens, Figur 1, har tidigare klonats i Escherichia coli. Under dessa försök klonades sekvensen i plasmiden pqlacz [20]. PQlacZ är en så kallad broad-host-range plasmid vilket betyder att den kan användas i många olika bakterier, den begränsas främst av sin stora storlek, 17.1 kbp. PQlacZ är en reporterplasmid och bär på reportergenen lacz, Med hjälp av denna reportergen har man visat att sekvensen uppströms cld innehåller en promotor. LacZ uttrycker β-galactosidase, transkriptionen av denna gen startar om en uppströms promotorsekvens sätts in. Genom att korta ner sekvensen med promotorn kan man få en tydligare bild av denna och dess innehåll. Plasmiden pru1103 (figur 2) är en betydligt mindre plasmid, 7990 bp lång, med 17 klyvningssäten för olika restriktionsenzym. Den ingår i en serie promotor probe vektorer, avsedda för att undersöka närvaron av promotor regioner i gramnegativa bakterier [22]. En gen för lacz finns även i pru1103, tillsammans med en gen för gentamicin resistens. Antibiotika resistensen kan utnyttjas vid detektion av transformanter. pru1103 har en komplett lacz gen som endast saknar dess promotor och reglerande sekvenser. Om en 9

10 10 promotor sekvens sätts in framför lacz genen kommer de bakterier som tagit upp plasmiden med insert att uttrycka β-galactosidase, precis som hos pqlacz. Tillför man sedan x-gal, en laktos analog, hydrolyseras denna av β-galaktosidas och bildar färglös galaktos och blåfärgad 4-chloro-3-brom-indigo [23]. Den blåa färgen ses som blåa kolonier på agar platta. Figur 2 Restriktionssäten, ORF's och gener hos PRU1103. Bilden kommer Ifrån Addgene, Syftet med detta examensarbete var att skala ner sekvensen uppströms om cld och samtidigt behålla de sekvenser identifierade som möjliga promotor och reglerande sekvenser. Därefter undersöka om den nedkortade sekvensen fortfarande fungerade som promotor i Escherichia coli [20]. 2. Material och metoder 2. 1 Primerdesign Design av primerpar gjordes med Primer-BLAST ifrån NCBI. De resulterande fem primer paren analyserades med avseende på dess benägenhet att bilda hairpin struktur, self-dimer och hetero-dimer. Analysen gjordes med OlgioAnalyser 3.1 ifrån Integrated DNA 10

11 11 Technologies. Till uppströms primern adderades ett restriktionssäte för restriktionsenzymet PstI och i nedströms primers adderades ett säte för HindIII Plasmidpreparation Renodling gjordes av E.coli XL1-Blue innehållande plasmiden pru1103. Kolonierna odlades på LB-agar platta (Appendix I) under 16h, 37 C och med en tillsats av 10µg/ml gentamicin. Mer än tolv stycken kolonier plockades till varsin Ö. N kultur och utav dessa gjordes plasmid preparationer med E.Z.N.A, Plasmid Mini Kit I, från Omega Bio-Tek enligt Plasmid mini Kit I spin Protocol med en elueringsvolym på µl. Plasmid koncentrationen och renheten mättes med Infinite 200 PRO NanoQuant vid 280nm samt 260nm. Kvoten av A 260 /A 280 visar förhållandet mellan DNA och proteiner och ger ett mått på provets renhet, vid ett värde över 1,8 anses provet vara rent Restriktionsklyvning För att kunna ligera in rätt sekvens behövde plasmiden, pru1103, först klyvas med rätt restriktionsenzymer, vilka matchar de säten som amplifierats i PCR'en. 5,3µg plasmid (pru1103) klyvs med restriktionsenzymer HindIII (8u/µg) ifrån Thermo Scientific och PstI (8u/µg) ifrån New England Biolabs. Klyvningen utfördes med Buffer R (1x), enligt rekommendationer ifrån Thermo Scientific DoubleDigest tool. Klyvningen, med en total volym på 100µl, inkuberades under 60 minuter i 37 C vattenbad. De båda restriktionsenzyms sätena sitter i multipelt kloninssite (MCS) vilket resulterade i att ett 85 bp långt fragment klyvdes bort, se figur 2. En inkubering i 80 C under 20 minuter gjordes avslutningsvis för att inaktivera HindIII och PstI innan gelrening. Vid kontroller av okluven och kluven plasmid användes DNA stegen lambda Eco1301 (styi) 16, ifrån Fermentas, se Appendix III Rening av kluven plasmid Resultatet ifrån restriktionsklyvningen fördes över till en 0,8% agaros gel med 1µl 6x loading dye per brunn i gelen. Alla gelelektroforeser utfördes med 1x TEA-Buffer (Appendix I). Provet kördes på gelen under 75V i 90 minuter. Till gelen sattes även kontrollklyvningar av enbart HindIII respektive PstI för att kontrollera att dessa var aktiva och gav en korrekt klyvning av plasmiden, pru1103. Bandet med DNA ifrån gelen renades därefter med QIAEX II Gel Extraction Kit, enligt medföljande protokoll för rening ur agarose gel. 11

12 PCR PCR (tabell 2, 3 och 4) av genomiskt DNA användes för att amplifiera sekvensen av intresse, figur 1. Alla PCR reaktioner utfördes med KAPA2G Fast HotStart ReadyMix, enligt medföljande anvisningar för maximal yield reaction. Ungefär 30 ng genomiskt Ideonella dechloratans DNA användes till varje reaktion. Alla kontroller av PCR produkter gjordes på 3-4% agarose gel med DNA stegen O'Gene ruler, low range DNA ladder, Ready-to-use (0,1µg/µl) ifrån Fermentas (Se AppendixIII). Tabell 1 Temperaturer och tider för de olika stegen och cyklerna i PCR 1 (touchdown). Steg Temperatur Tid Cykler Initial denaturation 95 C 3 min 1 Denaturation 95 C 15 sek Annealing 1* C 15 sek 35 Annealing 2 55 C 15 sek Final extension 72 C 1 min 1 * Annealingtemperaturen sänktes, -1 C/Cykel, under 10 cykler. En annealingtemperatur på 55 C användes till de sista 25 cyklerna. Tabell 2 Temperaturer och tider för de olika stegen och cyklerna i PCR 2. Steg Temperatur Tid Cykler Initial denaturation 95 C 3 min 1 Denaturation 95 C 15 sek Annealing 63 C 15 sek 35 Final extension 72 C 1 min 1 Tabell 3 Tempereturer och tider för de olika cyklerna i PCR 3. Steg Temperatur Tid Cykler Initial denaturation 95 C 3 min 1 Denaturation 95 C 15 sek Annealing 56 C 15 sek 35 Final extension 72 C 1 min 1 PCR produkten renades ifrån salter och Taq-polymeras med GeneJet PCR Purification Kit (Thermo Scientific). Den framrenade PCR produkten kontrollklyvdes med 12

13 13 restriktionsenzymerna HindIII (Thermo Scientific) och PstI (New england Biolabs) enligt återförsäljares rekommendationer och tidigare klyvning av pru Ligering Genom en ligering kunde den amplifierade PCR produkten föras in i pru1103. Ligeringen gjordes med T4 Ligase och 10x T4 ligase buffer ifrån Thermo Scientific. Återförsäljarens protokoll följdes för sticky-end ligation. 1µg plasmid ligerades med 28ng insert-dna för 2:1 förhållande och med 14ng insert-dna för 1:1 förhållande. Ligeringen inaktiveras i 65 C under 10 minuter. En volym på 60µl ligerat DNA erhölls och denna fälldes ut med etanol (se Appendix II). Resulterande DNA löstes i TE-Buffer Elektrokompetenta celler XL1-Blue, E. coli, gjordes elektrokompetenta för att kunna ta upp plasmid genom elektroporering. Alla tillsatser och centrifugeringar under framställningen av elektrokompetenta celler gjordes på is eller i 4 C. Först odlades en kultur av XL1-blue under natt (250 ml LB-medium, se Appendix I). Cellerna odlades kommande dag till ett OD på 0,62. Efter att cellerna fått kylas på is under ca 15 minuter centrifugerades de i 15 minuter, 4500 rpm i rotor SLA-3000 (Sorvall ). Pelleten som bildades resuspenderades i ungefär 100ml iskallt vatten. Provet centrifugerades som innan och resuspenderades med ytterligare 40ml iskallt vatten. Efter ännu en centrifugering, som ovan, resuspenderades cellerna i 5ml 10% glycerol två gånger. Sista gången resuspenderades de i 500µl 10% glycerol. Cellerna överfördes i 40µl portioner till eppendorfrör Transformation och elektroporering Transformation med XL1-Blue Competent Cells ifrån STRATAGENE utfördes, enligt medföljande protokoll med pru1103 innehållande insert ifrån PCR 3 (tabell 3). Elektroporeringen gjordes med Gene Pulser II ifrån Bio-Rad. Fältstyrkan sattes till 2,5 kv/cm, resistensen till 200 Ω och kapacitansen till 25 μf. I kyvetten (Bio-rad) var avståndet mellan elektroderna 0,2 cm. 40µl kompetenta celler pulsades en gång tillsammans ~40 ng plasmid. En tidskonstans på 5,01 erhölls. Direkt efter pulsen var skickad tillsattes 1ml SOCmedium (Appendix I). Cellerna inkuberades därefter i 5ml SOC-medium, 37 C under 1h. En positiv kontroll av puc18 gjordes under samma kriterier. Även otransformerade celler odlades upp i 5 ml SOC-medium för att beräkna mängden celler vilka överlevt elektroporeringen. Efter inkubering spreds de elektroporerade, transformerade, cellerna ut på 13

14 14 LB-agar plattor innehållande gentamicin (10µg/ml) för pru1103 och ampicilin (100µg/ml) för puc18. De otransformerade, elektrokompetenta cellerna spreds ut på LB-agar plattor utan antibiotika. På plattorna med XL-1 Blue och pru1103 sattes även X-gal (20mg/ml) för att kontrollera vilka kloner som tagit upp plasmid innehållande insert genom blå/vit screening. 3. Resultat och diskussion 3.1 Primerdesign De primer par som användes vid PCR såg ut enligt följande: Upstream: 5'GCC TGC AGC AAG CGG AAA GTG CAC GAA T 3' Den maximala frigjorda energin, ΔG max värdet, för hairpin och själv-dimer bildning var följande: Hairpin ΔG max : kcal/mol Self-dimer ΔG max : kcal/mol Downstream: 5' GGC AAG CTT CTG GAA CGG CAT AGA GCC AA 3' Hairpin ΔG max : kcal/mol Self-dimer ΔG max : kcal/mol ΔG max värdet för hetero-dimer bildning mellan de båda primrarna var: kcal/mol 5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTCCCCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCCACTGGAA CGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCAAACACATAAAAAAGGA GAAATGCGAAGATTCGTGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACC AAGCCGCCCA GC 3' Experimentell Transkriptionsstart Möjlig FNR-Box Möjliga -10 och -35 sekvenser Möjlig arca bindande sekvens Figur 3 Sekvens uppströms cld med primer sekvenser markerade i rött. Understruket ses möjlig ArsR bindande sekvens. Rödmarkerat ses inbindningssäten för uppströms och nedströms primer. Rödmarkerat i figur 3 är sekvenserna vid vilka primer paren kommer binda in. Den nya sekvensen ses i figuren nedan (figur 4). Detta är den avskalade sekvensen vilken klonades i plasmiden pru1103 i E. coli: 14

15 15 (5 )CTGGAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCAA ACACATAAAAAAGGAGAAATGCGAAGATTCGTGCACTTTCCGCTTG (3 ) Experimentell Transkriptionsstart Möjlig FNR-Box Möjliga -10 och -35 sekvenser Möjlig arca bindande sekvens Figur 4 Den förkortade sekvensen som klonas i pru1103. Understruket i figur ses möjligt ArsR bindande sekvens Plasmidpreparation Plasmiden pru1103 preparerades fram i olika fraktioner, dessa poolades samman till en slutvolym på 390 µl. Koncentrationen mättes till 63,35ng/µl, alltså en totalmängd på ~24µg DNA. Provets renhet mättes till 2,04 (A 260/280 ) vilket anses som rent (se tabell 3). Tabell 4 Absorbansmätning vid 260 och 280nm för koncentrations- och renhetsbestämning av pru1103. Medelvärde av pru1103 absorbans 260nm (A) 280nm (A) Konc (ng/µl) Ratio Volym (µl) 0, , ,35 2, Restriktionsklyvning För att kontrollera att restriktionsenzymerna PstI och HindIII var aktiva och resulterade i en klyvning av plasmiden gjordes kontrollklyvningar i samma buffer som användes till dubbelklyvningar (5). 15

16 16 Figur 5 Ifrån vänster till höger: 1: Stege, Lambda Eco : Oklyvd plasmid, pru1103 5: pru1103 klyvd med HindIII. 7: pru1103 klyvd med PstI. Resten av brunnarna är blanka I brunn nummer 3, i figur 5, ses två band för den okluvna plasmiden. Ett band i toppen av stegen, vid bp och ett strax under vid ungefär 7700 bp. Två band uppkommer eftersom plasmiden finns i cirkulärt ( relaxerat) och supercoilat tillstånd. Plasmid i cirkulärt tillstånd rör sig långsammare på gelen. I brunn nummer 7, i samma figur, ses ett band vid ungefär 8000 bp för pru1103 kluven med PstI. Plasmiden ser ut att ha kluvits fullständigt av PstI eftersom endast ett band ses i gelen vid önskad storlek, 7990 bp, med klyvd plasmid i linjär form. Om två band uppkommit även här hade plasmiden fortfarande varit okluven. I brunn nummer 3, i figur 5, syns inget band. Detta beror troligen på att en för liten mängd DNA användes till klyvningen med HindIII. Hind III klyvningen kontrollerades därför ytterligare en gång (figur 6). Den oklyvda plasmiden i cirkulärt tillstånd kunde förväntas röra sig enligt en dubbel så stor storlek. Det är därför troligt att detta är vad som ses på gelen i brunn 3 (figur 5). 16

17 17 Figur 6 I brunn 3 ses ett svagt band av pru1103 klyvd med HindIII. I brunn 7 finns DNA-stege lambda Eco1301. I brunn nummer 3, i figur 6, ses ett svagt band vid 8000 bp för pru1103 kluven med HindIII. Plasmiden ser ut att ha kluvits korrekt då endast ett band ses och det har den förväntade storleken på ca 8000 bp. Figur 7. I brunn 1 ses DNA-stege lambda Eco1301. I brunn 2 ses oklyvd pru1103. I brunn 4-7 ses pru1103 klyvd med PstI och HindIII. I brunn 8 ses DNA.stege Lambda Eco

18 18 I figur 7 ses i brunn nummer 4 till 7 pru1103 kluven med både HindIII och PstI. Ett band ses i respektive brunn vid lite mindre än 8000bp. Dubbelklyvningen ser korrekt ut eftersom ett band ses i brunnarna 4, 5, 6 och 7 och dem har den förväntade storleken på ca 7990 bp. I Brunn 2 ses ett band större än bp med okluven pru1103. Bandet med okluven pru1103 ligger över den förväntade storleken, på 7990 bp, eftersom den troligtvis befinner sig i relaxerad form och därför rör sig långsammare på gelen. Ifrån denna gel renades den dubbelklyvda plasmiden Rening av kluven plasmid Tabell 5 Absorbansmätning vid 260 och 280nm för koncentrations- och renhetsbestämning av pru1103 efter gelrening. Medelvärde av renad pru nm (A) 280nm (A) Konc (ng/µl) Ratio Volym (µl) 0,0195 0, ,4 1,87 90 Efter gelreningen poolades produkterna samman till en totalvolym på 90µl som koncentrationsbestäms till 19ng/µl (tabell 4). Detta ger en sammanlagd DNA mängd på 1,7µg DNA. Ett utbyte på 30 % erhölls ifrån gelreningen. Renheten mättes till 1,87 (tabell 4), vilket antyder att provet bör vara rent ifrån andra ämnen som proteiner och acetat. Reningen av gelen fick optimeras ett par gånger då utbytet blev mycket lågt vid de första försöken. Den största skillnaden mellan körningarna var i lufttorkningssteget. Pelleten fick torka under 15 minuter och resuspenderingen gjordes direkt då den vita färgen började träda fram. Pelleten blev lätt över- eller under-torkad. Detta resulterade antingen i att etanol fanns kvar och störde eller att pelleten blev för svår att resuspendera. Utbytet jämfördes med tidigare dokumenterade gelreningar ifrån samma kit där det maximala utbytet också visade sig vara 30 %. 18

19 PCR och transformation Figur 8 PCR 2, annealingtemperatur = 63 C. I brunn 2: "Prov 1". Brunn 5: "Prov 2". Brunn 6: Endast templat DNA (I. dechloratans). Brunn 7: Negativ kontroll, utan templat. Brunn 8: DNA-stege O Gene ruler, low range DNA ladder. Under de första körningarna av PCR används en annealing-(hybridisering) temperatur på 63 C (figur 8). I figur 8, brunnarna 2, 4 och 6 ses inga band. Ytterligare en reaktion gjordes, denna gång med en annealingtemperatur på 56 C (figur 9). I brunn 3, figur 19, ses ett band strax under 150bp för PCR produkten. I samma figur, brunn 4, ses ett band strax under 150 bp för den negativa kontrollen. I brunn 5 ses inget band för den positiva kontrollen. PCR produkten, i brunn 3, ligger i samma storlek som den väntade produkten på 127 bp. I brunnen med den negativa kontrollen, brunn 4, antogs det vara en kontaminering av genomiskt I. dechloratans DNA. Detta eftersom ett band med ungefär önskad produktstorlek, 126 bp, uppkom även här. Figur 9 PCR 3, annealingtemperatur = 56 C. I brunn 1 och 8 ses DNA-stege, O gene ruler, low range DNA- ladder. I bunn 3: "Prov". Brunn 4: Negativ kontroll utan templat. Brunn 5: Endast templat DNA (I. dechloratans). 19

20 20 Figur 10 Kolonier spädda med 100µl vatten ifrån koloni PCR. Brunn 1: Stege, O Gene ruler low range DNA-ladder. Brunn 2-11 kolonier 1-10 ifrån transformation av pru1103 med insert ifrån PCR 3. Brunn 15: Negativ kontroll. I figur 10 ses PCR av kolonier ifrån transformation av XL1-blue superkompetenta celler med pru1103 innehållandes produkt ifrån PCR 3 (figur 9). I brunn nummer 5, 6, 8 och 11 ses tydliga band vid lite under 150 bp. I Brunn 9, samma figur, ses ett svagt band vid lite under 150 bp. I brunn nummer 15 ses också ett band vid lite under 150 bp. I brunnarna 5, 6, 8 och 11 ser det önskade insertet ut att finnas då banden ligger vid önskad storlek, ungefär 126 bp. I den negativa kontrollen, brunn 15, ses också ett tydligt band vid ungefär 126 bp. Under tiden av koloni PCR en kontrollerades allt material använt vid PCR för kontamineringar. Olika koncentrationer detta materialet kördes ut på agarose geler, inga band uppkom och någon kontaminering hittades inte. Produkten ifrån PCR reaktionerna bör vara resultatet av en primer-dimer. För att komma runt detta problem användes en touchdown PCR, där annealingtemperaturen fick gå ifrån C (figur 11). Denna varierande annealingtemperatur ger de båda primrarna en chans att binda in vid sin optimala hybridiseringstemperatur. Temperaturintervallet valdes efter rekommendationer ifrån tidigare användare av metoden. Detta intervall var också baserat på det faktum att ingen produkt bildades vid en annealingtemperatur på 63 C. Mycket produkt bildades däremot vid 56 C, den optimala temperaturen ansågs därför finnas någonstans emellan de båda annealingtemperaturerna. 20

21 21 Figur 11 PCR 1, Touchdown. I brunn 1: stege, O gene ruler low range DNA-ladder. Brunn 2: prov ifrån PCR 1. Brunn 3: Negativ kontroll. I figur 11 ses resultatet ifrån PCR 1, av touchdown modell, av genomiskt I. dechloratans DNA. I brunn 2, ett band vid ungefär 126 bp. I brunn, negativa kontroll, 3 ses inget band. Produkten i brunn 2 ser ut att vara den rätta eftersom den negativa kontrollen nu är blank och bandet ligger vid storleken för den önskade produkten, 126 bp. Figur 12 LB- platta med XL1-blue transformerad med pru1103 innehållandes insert ifrån PCR 1 (touchdown). Materialen ifrån touchdown PCR'en (figur 11) ligerades in i pru1103. Sedan transformerades E. coli, XL1-Blue, genom elektroporering och kolonier odlades upp på x-gal. En av Ö. N kulturerna ses i figur 12, med många blåfärgade, men små, kolonier. Blåfärgade kolonier uppkom i alla Ö. N kulturer. Ifrån en spädning av transformanter med en 21

22 22 spädningsfaktor på 1: växte 60 kolonier på plattan. Detta gav 1,67*10 8 transformanter/µg DNA och 4,20*10 6 cfu/ml. De elektrokompetenta cellerna, vilka ej hade elektroporerats, späddes med en spädningsfaktor på 1: och gav 11 kolonier, 1,10*10 7 cfu/ ml. Vid processen då cellerna gjordes elektrokompetenta överlevde endast 2% (cellerna innan de gjorde elektrokompetenta hade 6,00*10 8 cfu/ml). Efter elektroporeringen och uppodling på antibiotika hade 38 % av cellerna överlevt. Figur 13 pru1103 med långt insert (promotor) odlad på X-gal Figur 14 - pru1103 utan insert odlad på X-gal I figurerna ovan (figur 13 och 14) ses pru1103 med det långa insertet (figur 1) och pru1103 utan insert odlade på LB-agar plattor med X-gal. I figur 13 ses blåfärgade kolonier. I figur 14 är kolonierna färglösa. De blåa kolonierna har producerat β-galactosidase och kan därför bryta ner X-gal till den blåfärgade produkten. Det långa insertet innehåller alltså en promotor sekvens. Det nedkortade sekvensen uppströms cld, i figur 12, innehåller troligtvis också en fungerande promotor eftersom kolonierna blivit blåfärgade även här. 22

23 23 Figur 15 PCR av kolonier ifrån transformation av XL1-blue med pru1103 (+ insert ifrån PCR 1 (touchdown)) I brunn 1 och 9: Stege, O'Generuler Low rangen DNA -ladder. Brunn 2, 4, 6, 10 och 12: Kolonier 1-5 spädda i 100 µl H 2O. Brunn 3, 5, 7 och 11: Kolonier 1-4 spädda i 1000µl H 2O. Brunn 8: Negativ kontroll, utan templat DNA. I figur 15 ses resultatet ifrån PCR på kolonier ifrån transformationen av XL1-Blue med pru1103 innehållandes det korta insertet ifrån PCR 1 (touchdown). I brunnarna 2, 4, 6, 10 och 12 ses kolonierna 1-5, spädda i 100 µl vatten, Här finns ett band vid ungefär 126 bp. I brunnarna 3, 5, 7 och 11 ses kolonier 1-4 spädda i 1000µl vatten. Här finns ett band vid 126 bp i alla brunnar utom nummer 10. I brunn nummer 8 finns den negativa kontroller, här ses inget band. I alla kolonier ser insertet ut att finnas då banden ligger vid storleken för produkten, 126 bp. Detta visar att transformationen har fungerat och att pru1103 har tagit upp det önskade fragmentet. Att det finns en band i brunn 11 men inte i brunn 10 kan bero på att cellerna ifrån koloni 4 spädda i 100µl inte lyserats på grund av att LB funnits kvar och inhiberat. De kloner som odlats upp på plattor är väldigt små, tillväxten ser ut av avstanna efter att de börjat växa på LB-plattan. Samma resultat sågs i alla kloner ifrån transformationen. En möjlighet är att en stor produktion av β-galaktosidas verkar toxiskt för cellen, eller att det finns inhiberande regioner vilka tagits bort i och med förkortningen. 23

24 24 Sammanfattande slutsats Att kolonierna ifrån elektroporeringen blivit blåfärgade tyder på att en fungerande promotor finns. Plasmiden pru1103 har alltså tagit upp ett insert innehållandes en promotorsekvens. Till denna promotorsekvens i plasmiden kan RNA-polymeras binda in och börja transkription av den efterföljande lacz genen vilket till att cellerna producerar β- Galaktosidas och färgar kolonierna blå i närvaro av x-gal. De designade primerparen har därmed fungerat och amplifierat det önskade området. Genom att PCR-reaktionen gjord på de transformerade klonerna ger en produkt av förväntad längd är det troligt att önskad sekvens har tagits upp. Ett nästa steg vore att jämföra promotor aktiviteten i det korta insertet med det tidigare klonade, långa, insertet. Promotor aktiviteten kan mätas och jämföras med avseende på enzymaktivitet i en β- Galaktosidas-assay. Ytterligare ett steg vore att klona den nya, kortare, promotor sekvensek i Ideonella dechloratans. Om framtida studier på klonerna ska vara möjligt behövs dock kolonier som växer bättre. Ett försök vore att odla dem på SOC-medium istället för LB-medium, då de får tillgång till mer mineraler och glukos. 24

25 25 Referenser 1. Ahn S. C, Hubbard B, Cha D, Kim B. J : Simultaneous removal of perchlorate and energetic compounds in munitions wastewater by zero-valent iron and perchlorate-respiring bacteria. Journal of Environmental Science and Health, Part A 2014;49: Schwarz AO, Urrutia H, Vidal JM, Perez N: Chlorate reduction capacity and characterisation of chlorate reducing bacteria communities in sediments of the rio cruces wetland in southern chile. WATER RESEARCH 2012;46: Wolff J: Perchlorate and the thyroid gland. Pharmacol Rev 1998;50: Health implications of perchlorate ingestion. The National Academies Press, Li H, Zhang X, Lin C, Wu Q: Toxic effects of chlorate on three plant species inoculated with arbuscular mycorrhizal fungi. Ecotoxicology and Environmental Safety 2008;71: Palma AT, Henríquez LA, Alvarez X, Fariña JM, Schwarz A, Lu Q: Do subtoxic levels of chlorate influence the desiccation tolerance of egeria densa? Environmental Toxicology and Chemistry 2013;32: DJ: Chlorate toxicity in aspergillus nidulans. Studies of mutants altered in nitrate assimilation. Molecular & General Genetics: MGG 1976;146: WSH: Chlorite and chlorate in drinking water. Background document for development of who guidelines for drinking-water quality. World Health Organization, Water Sanitation and Health, Nilsson T, Rova M, Smedja Bäcklund A: Microbial metabolism of oxochlorates: A bioenergetic perspective. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 2013;1827: Mehboob F, Wolterink AFM, Vermeulen AJ, Jiang B, Stams AJM, Kengen SWM, Hagedoorn PL: Purification and characterization of a chlorite dismutase from pseudomonas chloritidismutans. FEMS Microbiology Letters 2009;293: Malmqvist Å, Welander T, Moore E, Ternström A, Molin G, Stenström I-M: Ideonella dechloratans gen.nov., sp.nov., a new bacterium capable of growing anaerobically with chlorate as an electron acceptor. Systematic and Applied Microbiology 1994;17: Nelson DL, Cox MM, Lehninger AL: Lehninger principles of biochemistry / david l. Nelson, michael m. Cox. New York : W. H. Freeman ; Basingstoke : Palgrave [distributor], cop th ed., Hellberg Lindqvist M, Johansson N, Nilsson T, Rova M: Expression of chlorite dismutase and chlorate reductase in the prescence of oxygen and/or chlorate as the terminal electron 25

26 26 acceptor in ideonella dechloratans. Applied and Environmental Microbiology 2012;78: Bell A, Busby S: Location and orientation of an activating region in the escherichia coli transcription factor, fnr. Molecular Microbiology 1994;11: Lynch AS, Lin ECC: Transcriptional control mediated by the arca two-component response regulator protein of escherichia coli: Characterization of dna binding at target promoters. Journal of Bacteriology 1996;178: Joshi M, Dikshit KL: Oxygen dependent regulation of vitreoscilla globin gene: Evidence for positive regulation by fnr. Biochemical And Biophysical Research Communications 1994;202: Vasilieva SV, Strel'tsova DA, Moshkovskaya EY, Vanin AF, Mikoyan VD, Sanina NA, Aldoshin SM: Reversible no-catalyzed destruction of the fe-s cluster of the fnr[4fe-4s] transcription factor: A way to regulate the aidb gene activity in escherichia coli cells cultured under anaerobic conditions. Doklady Biochemistry & Biophysics 2010;435: Gao Ch, Yang M, He ZG: Characterization of a novel arsr-like regulator encoded by rv2034 in mycobacterium tuberculosis. PLoS ONE 2012; Park H-D, Guinn KM, Harrell MI, Liao R, Voskuil MI, Tompa M, Schoolnik GK, Sherman DR: Rv3133c/dosr is a transcription factor that mediates the hypoxic response ofmycobacterium tuberculosis. Molecular Microbiology 2003;48: Ölund D: Konstruktion av reporterplasmider innehållande möjliga promotorregioner för kloratreduktas respektive kloritdismutas från Ideonella dechloratans, 2012, pp Miller JH: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Karunakaran R, Mauchline TH, Hosie AH, Poole PS: A family of promoter probe vectors incorporating autofluorescent and chromogenic reporter proteins for studying gene expression in gram-negative bacteria. Microbiology 2005;151: Horwitz JP, Chua J, Curby RJ, Tomson AJ, Da Rooge MA, Fisher BE, Mauricio J, Klundt I: Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity. I. Some substituted 3-indolyl-β-d-glycopyranosides1a. Journal of Medicinal Chemistry 1964;7:

27 27 Appendix I Soc-Medium: 0,5% Jästextrakt 2% Tryptone 10mM NaCl 2.5mM KCl 10mM MgCl 2 10mM MgSO 4 20 mm Glukos 1 x TEA Buffer: 1mM EDTA 20mM Ättiksyra 40mM Trizma Base LB-Medium, 1 liter 10g NaCl 5g Jästextrakt 10g Tryptone fylls till 1 liter med H 2 O 27

28 28 Appendix II Etanol fällning: Uppskatta provets volym Tillsätt 1/10 volymer natriumacetat, ph 5,2 till en slutkoncentration på 0,3M (Förutsatt att DNA't finns i enbart TE-buffer. Om inte beräkna med avseende på saltkoncentrationen) Blanda väl Tillsätt 2 till 2.5 volymer iskall 99,9% Etanol Blanda väl Inkubera på is > 20 minuter Centrifugeras på14,5 x g, minuter Häll av supernatant Tillsätt 1ml 70% Etanol, centrifugeras snabbt och ta sedan bort supernatant Lufttorka pellet Resuspendera i önskad mängd TE-buffer 28

29 29 Appendix III Figur 16 DNA stege, O'gene Ruler. Bild ifrån ThermoScientific. Figur 17 DNA stege Lambda Eco1301. Bilden är en skärmdump ifrån tillverkarens (Fermentas) meföljande protokoll. 29