Realtids-PCR. icycler BioRad, mikrotiterplattor. LightCycler Roche, kapillärer. ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Realtids-PCR. icycler BioRad, mikrotiterplattor. LightCycler Roche, kapillärer. ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor"

Britt Jonsson
för 8 år sedan
Visningar:

1 Realtids-PCR icycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche, kapillärer ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor Molekylärbiologisk metodik T3 ht 2011 Märit Karls

2 Kunskapsmål för detta avsnitt Du skall kunna diskutera fördelar med realtids- PCR jämfört med traditionell PCR Du skall kunna diskutera för-och nackdelar med att detektera med SYBR Green respektive probe Du skall kunna redogöra översiktligt hur man kvantifierar med realtids-pcr Du skall kunna redogöra för hur man gör en smältkurva, samt förstå vilken information man kan få av en sådan analys

respektive probe Du skall kunna redogöra översiktligt hur man kvantifierar med realtids-pcr Du

3 Realtids-PCR Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkt varje cykel Tillämpningar Kvantitativ analys (Q-PCR) Mycket vanligt! Ex. RT-PCR (Reversed Transkriptas-PCR): jmf mrna i olika celler OBS! RT-PCR betyder INTE realtids-pcr! Multiplex PCR (specifika prober detekterar flera olika PCR-produkter) Detektion av mutationer, SNPs med två hybridiseringsprober och smältkurvsanalys

RT-PCR (Reversed Transkriptas-PCR): jmf mrna i olika celler OBS! RT-PCR betyder INTE realtids-pcr!

4 Brister med traditionell PCR Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering Långsam, svår att automatisera Mäter vid slutpunkt, när amplifieringskurvan kan ha planat ut; osäker kvantifiering Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner, osäker kvantif.

vid slutpunkt, när amplifieringskurvan kan ha planat ut; osäker

5 Jmf End point/real time lc_principles/lc_principles_ind.htm Konventionell PCR Detekterar PCRprodukt vid slutpunkt Realtidsmätning Bildad produkt detekteras med fluorimeter Mäter bildad PCR-prod varje cykel

6 AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 Exponentiell amplifiering PCR CYCLE NUMBER PCR CYCLE NUMBER 6

1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 Exponentiell amplifiering 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000

Ampliferingskurva Bakgrundsfas Log-fas Mättnadsfas Signalen mäter bildad produkt, är ett mått på mängden DNA från start Bakgrundsfas: trots fördubbling av DNA

7 Ampliferingskurva Bakgrundsfas Log-fas Mättnadsfas Signalen mäter bildad produkt, är ett mått på mängden DNA från start Bakgrundsfas: trots fördubbling av DNA varje cykel är signalen knappt högre än bakgrundsbrus (från BioRad) När får man det säkraste värdet??? Logfas: exponentiell fas Mättnadsfas: Varför planar signalen ut?

varje cykel är signalen knappt högre än bakgrundsbrus (från BioRad) När får man

8 Vilket prov innehåller mest DNA? Snabbare/långsammare Ju mer templat-dna i provet, desto ökar signalen

9 C T = Cykel vid tröskelvärde Bakgrundsfas Log-fas Mättnadsfas (från BioRad) Vad är C T -värdet i denna reaktion? Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA. Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden. Lägger en tröskel där signalen är pålitlig C T = den cykel när signalen passerar tröskeln Cp Crossing point Cq quantif. cycle

Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden.

10 Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering 96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar Tröskelvärde (C T ) varierar inte (Fig från BioRad) Var detekterar man i traditionell PCR?

11 Säkraste signalen när den ligger klart över bakgrundsbrus, men fortfarande i logfasen Vits med att mäta signalen varje cykel: ser vid vilken cykel man har en pålitlig signal, får ett pålitligt resultat 11

12 Hur mäts signalen? Varifrån kommer signalen på y-axeln? Hur mäter man bildad PCR-produkt?

13 Detektion: Fluorescerande molekyler som binder till amplifikat Icke-specifika SYBR Green 1 Specifika, prober som binder till specifik sekvens på mål-dna TaqMan Molecular beacon se fig i Brown Scorpions/Amplifluor Dual-hybridization probes/oligo FRET pairs (mutationsanalys)

specifik sekvens på mål-dna TaqMan Molecular beacon se fig. 9.

14 Detektion; SYBR Green 1 Denaturering: minimal fluorescens Syntes av ny sträng: SYBR green binder till ds DNA; fluorescerar Efter varje cykel mäts fluorescens Kombineras med smältkurvsanalys för detektion av ev. ospec. produkt

ds DNA; fluorescerar Efter varje cykel mäts fluorescens

15 Standardkurva Ct = f(konc) Range: kopior av målområdet i templatet Ct bör vara Absolut kvantifiering Spädningsserie av standard med känd koncentration ger amplifieringskurvor Bestäm Ct-värden

16 threshold Exempel på standardkurva SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 15 16

17 Standardkurva avslöjar PCR effektivitet! Lutningen på kurvan beror på PCR-reaktionens effektivitet (E eller η) Lutn.koeff: k = -1/logE 100 % effektivitet ger k= -3,32

18 PCR-reaktionens effektivitet Vid kvantifiering viktigt att ha hög effektivitet, helst 100 % Optimering viktig! Kort amplifikat, bp

19 Identifiering av primerdimer k=-2,48 Eff.= 153 % r= 0,957 r= korr.koeff. Mått på hur bra (BioRad) data stämmer med kurvan Mer än 100 % effektivitet! Flera produkter amplifieras! Primerdimer? Analysera med smältkurva!

20 Smältkurva avslöjar ospecifika produkter Utförs efter amplifiering PCR-prod. värms från ºC. dsdna denatureras Vid Tm sker en kraftig minskning av fluorescens Produkter med olika Tm-värden kan detekteras Tm för primerdimer?

dsdna denatureras Vid Tm sker en kraftig minskning av

21 Uppvärmning av PCR-produkt

22 Derivera signalen Smältkurvan

23 Identify Primer-Dimers by Melt Curve 10,000 copies 2,000 copies 400 copies (BioRad) No template control

24 Resultat med nya primers (BioRad) = 91.3% r = 0.999

25 Hybridisering med probe PCR-produkten får hybridisera till en specifik probe (en nukleotidsekvens som är komplementär till en del av mål-dna) GTTAAGCGCTGGAAACCGT AACGGACAATTCGCGACCTTTGGCATTCCGTG. Om proben binder till PCR-produkten får man signal Ospecifika produkter (t.ex. primerdimer) ger ingen signal. Varför inte?

26 FRET detektion R= Reporter, fluorofor, emitterar energi, överför till Q Perkin Elmer (Applied Biosystem) Q= quencher, absorberar energin om R och Q är på lämpligt avstånd

27 Mäter signal vid den våglängd reportern emitterar Intakt probe: emitterad våglängd absorberas av Q Klyvd probe: Signal detekteras

28 TaqMan probe Reporter i 5 ände Quencher i 3 ände, 3 OH kan ej fungera som start för ny syntes I intakt probe absorberar Q den energi som R avger ingen signal detekteras Perkin-Elmer (Appl.Biosystem)

29 TaqMan Probe Oligonukleotid som är komplementär till målsekvens i PCRprodukt Binder bara till måldna Vid syntes frigörs R, och fluorescerar Mer templatdna, mer PCR-produkt (amplicon), högre signal

30 Molecular beacon Se fig i Brown Ca 30 nt ssdna Fluorofor i 5 ände Quencher i 3 ände Hybridiserar till PCR-produkt, fluorescens Mäter signal vid annelingsteget

31 Kvantifiering av genuttryck Ex. vill se om gener slås av/på vid en viss behandling Försöksperson får cykla Biopsier tas före och efter träningen RNA prepareras cdna-syntes mha RT-polymeras Realtids-PCR Mängden amplifikat är ett mått på mängd start-dna, (motsvarande mrna)

32 Relativ kvantifiering Ofta räcker det att se skillnad i mängd mrna mellan olika prover. Beräknar en kvot Ex. jmf mrna före/efter träning Jmf mrna friska celler/cancerceller

33 Problem Kan finnas skillnader mellan proverna Variation i RNA-degradering Variation i cdna-reaktion Hur kan man kompensera för dessa skillnader? Finns det gener som borde ge lika mycket mrna i alla celler oberoende av behandling? Borde vara lika i alla prover.

control expt Referensgen Även vid Northern använder man referensgen (endogen kontroll, house-keeping gene) Målgen referensgen actin, GAPDH, RPLP0 etc Corrected fold

34 control expt Referensgen Även vid Northern använder man referensgen (endogen kontroll, house-keeping gene) Målgen referensgen actin, GAPDH, RPLP0 etc Corrected fold increase = 10/2 = 5 Ratio target gene in experimental/control = fold change in target gene fold change in reference gene 34

35 Lämplig referensgen? Bör uttryckas lika mycket i alla celler under alla betingelser, house-keeping gene. Bör ha ungefär samma PCReffektivitet som målgenen. Måste väljas med omsorg (helst 2st) 18 S rrna GAPDH 2 mikro (klass 1 MHC protein) actin Ribosomalt protein, RPLP0

36 FRET hybridiseringsprober för mutationsanalys Två prober hybridiserar svans mot huvud Avstånd 1-5 nt Reportern ger signal när båda proberna hybridiserar till PCR-produkten

37 FRET prober för mutationsanalys Smältkurvsanalys Mutation ger mismatch, lägre Tm-värde Kan skilja vildtyp från mutation Genotypning (SNP) RCConfigureUser?URL=StoreFramesetView&storeId= 10151&catalogId=10151&langId=-1&countryId=se

38 Strategi 1. Välj målområde (target, amplicon) bp Designa och beställ primers 2. Optimera med SYBR Green I Kontrollera effektivitet och specificitet Använd smältkurva och bekräfta med gel 3. Designa och beställ probe 4. Bekräfta att proben fungerar över ett brett dynamiskt område

Relevanta dokument

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction The Polymerase Chain Reaction Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls Kunskapsmål för detta avsnitt Från kursplan: Studenten skall kunna: förklara grundläggande principer