Jämförelse av kommersiella och InHouse kontroller för realtids-pcr vid diagnostik av Herpes simplexvirus 1 och 2

Transkript

1 Jämförelse av kommersiella och kontroller för realtids-pcr vid diagnostik av Herpes simplexvirus 1 och 2 HUVUDOMRÅDE: Biomedicinsk laboratorievetenskap FÖRFATTARE: Nelly Palma Jansson, Samuel Karlsson HANDLEDARE: Olaf Dienus, Molekylärbiolog, Lisa Stark, Metodspecialist JÖNKÖPING 2018 juni

2 Sammanfattning Herpes simplexvirus 1 och 2 orsakar godartade sjukdomar, men kan även orsaka mortalitet. Diagnostik av herpes simplexvirus 1 och 2 utförs numera framför allt med realtids- Polymerase chain reaction (PCR). I metoden amplifieras specifika deoxiribonukleinsyra(dna)-sekvenser till miljontals kopior vilka sedan detekteras med fluorescein. I realtids-pcr sätts positiva och negativa kontroller. De positiva kontrollerna kan vara eller kommersiella. Tolkningen av resultatet inkluderar inspektion av kontrollerna. DNA utsätts för nedbrytningsprocesser av olika slag, och kan förvaras på olika sätt för att upprätthålla stabilitet. Syftet med studien var att jämföra laboratoriets -kontroller med två kommersiella kontroller, för att utvärdera vilken av dessa som var mest stabila över tid. Utvärderingen utfördes genom att analysera tre kontroller med realtids-pcr, efter att de hade förvarats i -20 C, i 5 C och i 20 C, och var spädda i TE-buffert eller i PCR-vatten. De kommersiella och -kontrollerna visade sig vara jämbördiga. Vidare studier som görs under längre tid, i större omfattning och där koncentrationerna är samma för varje kontroll, föreslås. Nyckelord: DNA, förvaring, stabilitet. 2

3 Summary Comparison of commercial and controls for real-time PCR in the diagnosis of herpes simplex viruses 1 and 2 Herpes simplex viruses 1 and 2 which usually cause benign diseases but can even cause mortality. The diagnostics of herpes simplex virus 1 and 2 are performed with real-time Polymerase chain reaction (PCR). In the real-time PCR method, specific deoxyribonucleic acid (DNA) sequences are amplified into millions of copies which are then detected with fluorescein. Positive and negative controls are used in real-time PCR. The positive controls can be or commercial. The interpretation of the results includes inspection of the controls. DNA is subject to degradation processes of different kinds and can be stored in different ways to maintain stability. The purpose of the study was to compare the laboratory's controls with two commercial controls, to evaluate which of these were more stable over time. The evaluation was performed by analyzing the three controls with real-time PCR after they were stored in temperatures at -20 C, at 5 C and at 20 C, and were diluted in TE-buffer or in water. The commercial and controls proved to be equitable. Further studies carried out for a longer period of time, to a greater extent and where concentrations are the same for each control are suggested. Keywords: DNA, storage, stability. 3

4 Innehållsförteckning Bakgrund... 1 Herpes simplexvirus... 1 DNA-extraktion... 1 Polymerase chain reaction... 2 Amplifiering... 2 Realtids-PCR... 3 Prober... 4 Smältpunktsanalys... 5 Kontroller... 6 DNA-stabilitet... 7 Problemställning... 7 Syfte... 8 Material och metod... 9 Extraktion... 9 Spädningar och förvaring... 9 Primer och hybridiseringsprober Mastermix och provsättning Analys med realtids-pcr Bedömningskriterier Datainsamling och statistisk analys Etiska överväganden Resultat HSV I PCR-vatten I TE-buffert HSV I PCR-vatten I TE-buffert

5 Diskussion Zeptometrix Förvaringsmedium Spädningar Jämförelse av kontrollers stabilitet Slutsatser Omnämnanden Referenser Bilagor Bilaga 1: Resultattabell.... Bilaga 2: Körningsscheman

6 Bakgrund Herpes simplexvirus Herpes simplexvirus-1 (HSV 1) och herpes simplexvirus-2 (HSV 2) tillhör släktet herpesvirus. Herpesvirus innehåller en kapsid med dubbelsträngat DNA. Kapsiden är omgärdad av ett lipidhölje som innehåller glykoproteiner. Virusen som är vanligt förekommande i hela världen orsakar godartade sjukdomar men kan även orsaka allvarlig sjukdom och dödlighet, speciellt hos immunsupprimerade (1). HSV 1 och HSV 2 smittar genom kroppsvätskor, och tar sig genom innerverande nerver till ganglion och etablerar en latent infektion efter primärinfektionen. Viruset kan återvända till den ursprungliga platsen för infektion och orsaka smittsamma sår, vanligen orala och genitala, men kan även drabba andra kroppsdelar. I vissa fall kan viruset skada ögonen, orsaka encefalit eller meningit. Infektionen kan smitta från mor till barn vid förlossningen, så kallad neonatal HSV, vilket kan få allvarliga följder, till exempel disseminerad infektion, kutan manifestation och encefalit (1, 2). Oral herpes orsakas vanligtvis av HSV 1 och är förknippad med encefalit medan genital herpes vanligtvis orsakas av HSV 2 och är förknippad med meningit (3). Provtagning för virusen görs vanligtvis med steril bomullspinne i blåsor eller hudlesioner och tas i ett sterilt rör med natriumkloridlösning. Vid infektion i centrala nervsystemet (CNS) tas ett likvorprov i ett sterilt rör utan tillsats (4, 5). I Sverige är diagnostisering av HSV 1 och HSV 2 med polymerase chain reaction (PCR) vanligast (2). DNA-extraktion Det finns flera metoder för att extrahera DNA ur analysmaterial såsom organisk isolering, till exempel fenol och kloroform, oorganisk isolering, till exempel natriumacetat och isopropanol, och fastfas-isolering, till exempel silikatbaserade produkter. Vid fastfas-isolering extraheras DNA ur det organiska materialet genom antingen en silikat-kolonn eller genom så kallade magnetiska kulor (6). Dessa består av ferromagnetiska järnoxider beklädda med syntetiska eller biologiska polymerer som binder till DNA (7). Cellerna lyseras i en buffert med hög salthalt och lågt ph för att fälla ut proteiner. Vid användning av magnetiska kulor (med bundet DNA) tvättas de med buffert i flera steg genom att de hålls fast av en yttre magnet. DNA:t kan sedan 1

7 elueras med en svag basisk buffert innehållande låg salthalt. Det finns automatiserade metoder för att kunna utföra fastfas-isolering av DNA (6). Polymerase chain reaction PCR är en metod där specifika nukleinsyra-sekvenser amplifieras, vanligen deoxiribonukleinsyra (DNA), där den specifika sekvensen kan kopieras upp till miljontals kopior för att möjliggöra analyser (6). Amplifiering Amplifiering innebär att DNA-kopior bildas från ett templat genom flera cykler. En cykel är vanligtvis indelad i två eller tre steg. I det första steget, denaturering, upphettas reaktionslösningen till en temperatur på 94 C till 98 C och det dubbelsträngade DNA:t delas upp i två enkelsträngar, även kallat templat. Templatet används som mall för kopiering eller syntetisering av en komplementerande sträng. I det andra mest kritiska steget, hybridisering, binder två sekvensspecifika primrar in till det enkelsträngade DNA:t. Primrarna anger vilken del av templatet, som kommer bli förökat. Detta sker i en temperatur mellan 50 C till 70 C. Det sista steget kallas elongering, där primrarna initierar polymeras att syntetisera en kopia av DNA-strängen. I detta steg adderas nukleotiderna (adenin, tymin, guanin och cytosin) till primrarna. Adenin binder till tymin, och guanin binder till cytosin, med vätebindningar, och vice versa. Detta sker i en temperatur (ca 72 C) där polymeraset är som mest effektivt. I slutet av detta steg har ett dubbelsträngat DNA blivit replikerat och två identiska kopior har skapats. Cykeln har avslutats och en ny kan påbörjas (Figur 1). För varje cykel ökar antalet kopior exponentiellt (6). PCR-produkten kallas för amplikon. Amplikonen detekteras genom att färga produkten med ett kemiskt färgämne (till exempel etidiumbromid). Ett annat sätt att detektera amplikonen är att märka PCR-primrar eller nukleotider med fluorescenserande färger före PCRamplifiering, till exempel vid realtids-pcr (8). 2

8 Figur 1. Principen för polymerase chain reaction. 1. Denaturering: Dubbelsträngat DNA blir enkelsträngat DNA. 2. Hybridisering: Primrar binder till DNA-templat. 3. Elongering: Polymeras syntetiserar DNA med utgångspunkt från primrarna. 4. En kopia av den ursprungliga dubbelsträngade DNA har bildats (9). Realtids-PCR En vidareutveckling av PCR-tekniken är realtids-pcr även kallat qpcr, där amplifieringen kan följas i realtid. Mängden templat kan detekteras med fluorescerande molekyler som antingen kan vara i fri form eller bundna till så kallade prober. Vid realtids-pcr erhålls en amplifieringskurva baserad på flourescensnivån, där x-axeln visar antalet cykler medan y-axeln visar mängden amplikon som är kopplad till flourescensnivån (10). Ett tröskelvärde motsvarar den fluorescensnivå som tillväxtkurvan ska passera för att tolka provet som positiv (Figur 2). När amplifieringskurvan skär tröskelvärdet kan x-axeln läsa av cykeltröskelvärdet (Ct-värdet). Ett prov med lågt Ct-värde innehåller fler templat från början (6). Genom en standardkurva med kända koncentrationer kan ett Ct-värde kopplas till DNA-templatets koncentration. Ct-värdet är omvänt proportionellt mot templatets koncentration (11). 3

9 Figur 2. Amplifieringskurva för realtids-pcr. x-axeln anger antalet genomgångna cykler och y-axeln anger fluorescensnivån. Tröskelvärdet motsvarar fluorescensnivå som tillväxkurvan ska passera för att tolka provet som positivt. Ct-värde visar det antalet cykler där kurvan skär tröskelvärdet. Prober Det finns flera typer av prober. En typ är hydrolyseringsprobe, till exempel Taqman, vilket hybridiserar till en målsekvens på templatet och har två fluoroforer. Den ena fluoroforens energi i form av ljus absorberas av den andra fluoroforen, en så kallad quencher. När polymeras passerar målsekvensen och bryter ner proben frigörs den ena fluoroforen från quenchen och en signal kan skickas ut. En annan typ av probe är Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Proben består av nukleotider med var sin fluorofor med olika excitations- och emissionsspektra. Dessa binder in till amplifieringsprodukten med några nukleotiders mellanrum och emitterar ljus vid en specifik våglängd, vilket inte sker i fri lösning. FRETprober liksom SYBR green kan användas vid smältpunktsanalys. SYBR green binder till den dubbelsträngade produkten och ger sen en fluorescenssignal (10). 4

10 Figur 3. Detektion av målsekvenser med FRET-prober med var sin fluorofor (A) som vid bindning till amplifieringsprodukten (B) emitterar ljus i en specifik våglängd (12). Smältpunktsanalys Smältpunktsanalys av DNA är den temperatur där hälften av ett dubbelsträngat DNA blir enkelsträngat. Den temperaturen är specifik för sekvensen av den särskilda DNA-produkten. Smältpunktsanalys används för att upptäcka genetiska variationer och mutationer, till exempel för att skilja HSV 1 från HSV 2 (10, 13). Den amplifierade produkten värms upp gradvis. Temperaturen ökas några tiondels grader per sekund samtidigt som fluorescensen mäts. Smältpunkten beror på sekvensens sammansättning och längd (14). De dubbelsträngade DNA-sektionerna med flera baspar cytosin-guanin kräver högre temperaturer än de sektioner som har fler baspar med adenin-tymin, eftersom cytosinguanin binds till varandra med tre vätebindningar, medan adenin-tymin binder till varandra med två vätebindningar (13). 5

11 Kontroller Sedan PCR-tekniken introducerades i laboratorievärlden har kontamination varit ett problem som lett till falska positiva analysresultat. Kontamination är ett problem som finns inbyggt i tekniken eftersom det amplifieras upp mångfaldiga målmolekyler som sedan fungerar som templat för ny amplifiering. Ett annat problem som förekommer vid användning av PCRtekniken är inhibition (15) vilket innebär att amplifiering försämras eller helt förhindras och kan bero på en rad olika faktorer (16). Inhibition varierar mellan olika provtyper och påverkas av vilken typ av extraktionsmetod som används. Dessa problem har lett till att olika kontroller används vid PCR-baserade metoder för diagnostik (15). Kontroller är prover av känd typ och i vissa fall känd koncentration (6). Syftet med dessa kontroller är att förvissa sig om att alla steg i metoden blir som förväntat och säkerställer god kvalité. Vilka kontroller som används i en given metod beror delvis på vilket kontrollmaterial som finns tillgängligt för just den målsekvensen. Och det kan vara och kommersiella kontroller. Vid val av kontroller vägs också kvalitetsnivån in mot analyskostnaden. En standardiserad nomenklatur för kontroller i Sverige finns inte, men följande definitioner av kontroller är enligt referensmetodiken för molekylärbiologisk diagnostik: Extern amplifieringskontroll (positiv kontroll) kontrollerar reagenserna. Den består av en målsekvens av bestämd koncentration, är positiv och amplifieras separat från provet. För att kontrollera kontamination av reagenser och ospecifik amplifiering används negativ amplifieringskontroll (negativ kontroll). Den innehåller inget positivt material. Positiv extraktionskontroll extraheras tillsammans med provet. Denna kontroll består av ett bestämt antal målorganismer. Slutligen finns negativ extraktionskontroll som extraheras tillsammans med prover och med positiv extraktionskontroll. Den innehåller ingen målsekvens och kontrollerar kontamination vid extraktionen. Tolkning av resultat inkluderar alltid först en inspektion av kontrollerna för att verifiera ett pålitligt analysutförande (6). Med introduktion av realtids-pcr har risken för kontamination minskat, eftersom amplifieringen och detektionen äger rum i ett slutet system (15). Material som är avsett att användas som kontroller delas vanligtvis upp i mindre volym, alikvotering och förvaras. Insamlat material kan då användas under en längre tid (17) och upprepad infrysning och upptining (som har en negativ påverkan av materialet) undvikas (18). 6

12 DNA-stabilitet De kemiska processer som påverkar just DNA-stabilitet in vivo är hydrolys av vatten, oxidering av syre och icke-enzymatisk metylering som är orsakad av ett flertal små reaktiva molekyler (19). ning är den mest vanliga metoden för att förvara DNA-extrakt. DNA kan förvaras i längre perioder i torkad form, i flytande kväve eller i etanol i -80 C. Etanol och kväve som förvaringsmedium kräver att DNA isoleras och förflyttas till en vattenbuffert för analyser. Dessa manipulationer är inte önskvärda när kontroller behövs regelbundet (20). Kylda kontroller kan hålla i veckor medan frysta kontroller kan hålla i månader (21). Vatten är därför det mest lämpliga mediet. DNA utsätts dock i högre grad för nedbrytningsprocesser i vatten såsom depurinering, depyrimidination, deaminering och hydrolytisk klyvning. Jonstyrkan hos lösningen påverkar depurineringsgraden, så en förvaring i saltlösning, i motsats till låg jonstyrka, är att föredra. Vid frånvaro av nukleaser och förvaring av DNA i saltlösning med ph 8,4 så kommer de vanligaste skadorna orsakas av oxidation. Vid närvaro av övergångsmetaller, som järnjoner, så ökar nivåerna av oxidation. De-metallering kan signifikant reducera degradering under förvaringen. Kelater, som EDTA, i lösningen begränsar de metallkatalyserade reaktionerna, till exempel kan väteperoxid och järnjoner bilda DNA-nedbrytande fria radikaler (20). TE-buffert innehåller TRIS, ph 8 och en låg koncentration av EDTA och är kompatibel för sekvensering och enzymatiska applikationer (22). Problemställning Vid diagnostisering av herpesvirus på Länssjukhuset Ryhov har det visat sig att kontrollerna blir instabila över tid. Det kan finnas en rad olika faktorer som ligger till grund till detta, som typ av kontroller, kontrollens förvaringsmedium och temperaturer. I vår studie ska dessa faktorer studeras under sex veckor, för att kunna se vad som är avgörande för stabila kontroller. 7

13 Syfte Syftet med studien var att jämföra laboratoriets -PCR-kontroller för diagnostik av HSV 1 och HSV 2 med två kommersiella kontroller, för att utvärdera vilka av dessa som är mest stabil efter sex veckor. I utvärderingen jämfördes även hur förvaringsmedium och förvaringstemperaturer påverkar. 8

14 Material och metod I studien användes tre olika typer av externa amplifieringskontroller: -kontroller och två kommersiella kontroller. -kontrollerna bestod av blandade patientprover som var positiva för HSV 1 och 2 från den molekylärbiologiska avdelningen på Laboratoriemedicin, Länssjukhuset Ryhov Jönköping. De kommersiella kontrollerna var Quantitative Genomic (American Type Culture Collection (), Manassas, USA) som var rent extraherat DNA och NATrolTM-molecular control (Zeptometrix, New York, USA) vilket var hela inaktiverade viruspartiklar. Samtliga kontroller var för HSV 1, och HSV 2. Den negativa kontrollen bestod av molekylärbiologisk rent vatten (PCR-vatten). Extraktion DNA från - och Zeptometrix-kontrollerna extraherades med Biorobot EZ1 advanced XL (Qiagen, Hilden, Tyskland) med EZ1 DNA tissue kit (Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner. Den ursprungliga koncentrationen för Zeptometrix-kontrollerna var enligt tillverkaren 50 kopior (c)/ µl, för -kontrollerna var koncentrationen okänd. Av 200 µl kontroll, extraherades och eluerades 100 µl. Den teoretiskt erhållna koncentrationen för Zeptometrix-kontrollerna var då 100 c/ µl. Spädningar och förvaring För -kontrollen, vars ursprungliga DNA-koncentration var c/ µl, utfördes två spädningsserier, en med PCR-vatten och en med tio gånger utspädd TE-buffert (Tris-EDTA, 1x solution, ph 8.0, Molecular Biology, Fisher BioReagents) till följande koncentrationer: , 1 000, 500, 250, 100, 50, 25, och 10c/ 5µL. På samma sätt utfördes två spädningsserier med samma spädningssteg för -kontrollerna. Samtliga spädningsserier analyserades med realtids-pcr i triplikat. Tre av de åtta spädningarna valdes ut för HSV 1 och HSV 2 i respektive lösningsmedium (Tabell 1). För att veta koncentrationerna av dessa upprättades en standardkurva baserad på de kända koncentrationerna för -kontrollerna. En spädning med låg koncentration (10c/ 5 µl), en spädning med mellankoncentration (ex 50c/ 5 µl) och en spädning med hög koncentration (ex 500c/ 5 µl) valdes ut. 9

15 Tabell 1. Antal kopior per PCR-reaktion för -, - och Zeptometrix-kontrollerna för HSV 1 och 2. Zeptometrix Koncentration HSV 1 HSV 2 HSV 1 HSV 2 HSV 1 HSV 2 (c/5 µl) (c/5 µl) (c/5 µl) (c/5 µl) (c/5 µl) (c/5 µl) Hög (500) 40 (500) (100) 2 (100) Låg (50) 1 (50) Teoretiska koncentrationer Av detta urval alikvoterades 25 µl spädningarna i mikrocentrifugrör och förvarades i tre olika temperaturer, rumstemperatur (RT) 20 o C, i kyl 5 o C och i frys 20 C. Spädningar från extraherad Zeptometrix-kontroll gjordes i följande koncentrationer: 500, 100 och 50c/5 µl. Samtliga tre koncentrationer alikvoterades och frystes in i -20 C. En alikvot per koncentration och temperatur analyserades varje vecka under 6 veckors tid. Primer och hybridiseringsprober De primrar och hybridiseringsprober (TIB Molbiol, Berlin, Tyskland) som användes tillsammans med LightCycler FastStart DNA Master-HybridizationProbes kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) anges i tabell 2. De virala DNA-sekvenserna amplifierades med specifika primrar, och detekterades med hybridiseringsprober märkta med Fluorescein och LightCycler Red 640. Signalen från mottagarproben detekterades vid 640 nanometer. De reagenser som användes förvarades enligt tillverkarens rekommendationer. 10

16 Tabell 2. Primrar och prober som användes för analys av Herpes simplexvirus typ 1 och 2 med realtids-pcr. Koncentration Sekvens Primers pol A 10µM 5 -TGC GGT TGA TAA AGC GCA GT pol F 20µM 5 -GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C Prober Koncentration Sekvens FLU 18µM 5 -GCG CAC CAG ATC CAC GCC CTT GAT GAG C-FL LCR 18µM 5 -LC Red640-CTT GCC CCG CAG ATG ACG CC * Beteckningarna anger namn på primrar och prober. Värdena i parentes anger koncentrationerna i PCR. Primar pol A och pol F står för delar av polymerasgenen. FLU står för Fluorescein och LCR står för LightCycler Red 640. Mastermix och provsättning Mastermix för HSV bereddes enligt Tabell 3. Alla reagenser centrifugerades kort, mastermixen blandades, placerades i ett kylblock och användes direkt efter beredning. Tabell 3. Reagenser som ingår i mastermixen för en PCR-reaktion. HSV Volym (µl) PCR-vatten 10,45 MgCl 2 0,8 HSV pol A 0,5 HSV pol F 0,5 HSV FLU 0,5 HSV LCR 0,5 Polymerasmix 2,0 I en 96-hålsplatta, (LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) pipetterades 15 µl mastermix till respektive brunn. PCR-vatten tillsattes som negativ kontroll till avsedda brunnar och 5 µl av respektive kontroll tillsattes enligt följande: varje virus analyserades i två 96-hålsplattor enligt samma pipetteringsschema. Den ena plattan innehöll kontroller som förvarats i TE-buffert och den andra innehöll kontroller som förvarats i PCR-vatten. I dessa plattor sattes HSV 1 eller HSV 2 i form av -, - 11

17 och Zeptometrix-kontroller. På varje platta sattes de tre olika kontrollerna i de tre olika förvaringstemperaturerna (med undantag för Zeptometrix-kontrollen som enbart förvarades i frys), och i de tre olika spädningarna. Alla kontroller (i de tre koncentrationerna) sattes i triplikat (Bilaga 2) Efter att ha förslutit plattan centrifugerades den i Universal 320 Hettich Zentrifugen (Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Tyskland) vid 1800 x g i 2 minuter. Analys med realtids-pcr Analyserna gjordes i realtids-pcr-instrumentet LightCycler 480 II (Roche). Trestegamplifiering med följande termoprofil gjordes enligt instruktioner (Tabell 4). Tabell 4. Termoprofil med trestegsamplifiering för Herpes simplexvirus typ 1 och 2. Aktivering Amplifiering Smältning Kylning Segment Cykler (antal) Måltemperatur ( C) Tid (s) Temp ökning ( C/s) ,2 20 Mätningstyp Enkel Kont Signalen från proberna detekterades i red 640 kanalen. Kontrollernas Ct-värden och kurvornas intensitet bedömdes (Figur 4), samt de negativa kontrollerna. HSV 1 påvisas när en produkt har en smältpunkt på ~58,0 o C och när en produkt i samma kanal har en smältpunkt på ~70 C är HSV 2 påvisad (Figur 5). 12

18 Figur 4. Amplifieringskurva för HSV 1 (brun) och HSV 2 (röd). Figur 5. Smältkurvor för HSV 1 (blå) och HSV 2 (brun). Bedömningskriterier De kriterier som användes för att klassificera kontrollernas stabilitet var om dessa uppvisade en ökning av Ct-värdet på mer än 2,5 cykler efter sex veckors tid. Även kontroller som under de sex veckorna uppvisat två negativa mätningar klassificerades som instabila. Avvikande värde i triplikatet kategoriserades som bortfall och exkluderades. 13

19 Datainsamling och statistisk analys Analysdatamaterialet samlades in från instrumentet och sorterades efter de olika kriterierna: förvaringstemperatur, koncentration, förvaringsmedium och kontroll baserat på art och typ av kontroll. Den insamlade datan för varje kategori var inte tillräcklig för att göra statistisk analys, därför gjordes enbart en deskriptiv analys. Etiska överväganden Studien var ett utvecklingsarbete för diagnostik och innefattar inte något spårbart patientmaterial; enbart avidentifierade positiva prover för tillgång till virusmaterial som insamlats av rutinverksamheten användes. Inga etiska överväganden eller godkännanden behövdes därför. Utvärdering och jämförelser av kontroller är väl berättigade för att bevara en hög säkerhet och kvalitet för diagnostiken inom laboratoriemedicin. 14

20 Resultat Kontrollerna analyserades under sex veckor för att observera stabilitet när de förvarats under olika förhållanden. Av de stabila kontrollerna så ökade Ct-värdena i 64% av fallen. Inga negativa kontroller blev positiva. För att jämföra och få en översikt över kontrollernas teoretiska koncentrationer, bestämda koncentrationer och Ct-värden, upprättades en tabell (Tabell 5). 15

21 Tabell och Zeptometrix-kontrollernas teoretiska och bestämda (med standardkurvan) koncentrationerna i kopior per 5µL, samt Ct-värde för dem låg, medel och hög koncentrationerna. Detta för HSV 1 och 2 förvarat i PCR-vatten och TE-buffert. HSV 1 Zeptometrix Vatten TE-buffert Vatten TE-buffert Teoretisk koncentration (c/5µl) Bestämd koncentration (c/5µl) Ct-värde (cykler) Ct-värde (cykler) Teoretiskkoncentration (c/5µl) Ct-värde (cykler) Ct-värde (cykler) Teoretisk koncentration (c/5µl) Bestämd koncentration (c/5µl) Ct-värde (cykler) Låg ,07 39, ,33 37, ,51 38, ,64 35, Hög ,13 34, ,22 32, ,95 HSV 2 Zeptometrix Vatten TE-buffert Vatten TE-buffert Teoretisk koncentration (c/5µl) Bestämd koncentration (c/5µl) Ct-värde (cykler) Ct-värde (cykler) Teoretiskkoncentration (c/5µl) Ct-värde (cykler) Ct-värde (cykler) Teoretisk koncentration (c/5µl) Bestämd koncentration (c/5µl) Ct-värde (cykler) Låg ,77 41, ,63 35, ,57 35, ,90 33, Hög ,38 34, ,64 28, ,59 16

22 HSV 1 I PCR-vatten För HSV 1 som förvarats i PCR-vatten uppvisade -kontrollerna vid låg koncentration instabilitet. och höga koncentrationer för de kontroller som förvarats i kyl eller frys var stabila, medan de kontroller som förvarats i rumstemperatur var instabila vid alla koncentrationer (Tabell 6). Ct-värdena hade i det fallet ökat med 9 % (3,3 cykler) i genomsnitt jämfört med kontroller förvarade i övriga temperaturer som ökat med 4 % (1,3 cykler). kontrollerna i PCR-vatten visade sig alla vara stabila vid alla temperaturer och koncentrationer. Alla Zeptometrix-kontrollerna i PCR-vatten var stabila förutom de med låg koncentration där två mätningar blivit negativa vid två tillfällen. I TE-buffert För de HSV 1-kontroller som förvarats i TE-buffert uppvisade -kontrollerna instabilitet vid låga koncentrationer. och höga koncentrationer var stabila med undantag för de frysta kontrollerna i medelkoncentration. Alla frysta - och Zeptometrix-kontroller var instabila i TE-buffert. Alla övriga -kontroller i TE-buffert var stabila (Tabell 6). 17

23 Tabell 6. Variation i stabiliteten från vecka 1 till vecka 6. HSV 1 Zeptometrix RT Låg Hög Låg Hög Låg Hög Vatten * 0 0 0* TE * 0* 0* Kyl Vatten * TE ** * Vatten *** * 0 0 TE * ** 0* ** * * * Pil ner anger en förändring i Ct-värde som är större än 2,5 cykler eller där två av resultatet varit negativa. 0 anger en förändring i Ct-värde som är mindre än 2,5 cykler. Låg, medel och hög anger koncentrationer. RT, kyl och frys anger förvaringstemperaturer. Vatten och TE står för lösningsmedier som kontrollerna förvarats i. 500c/ 5µL för Zeptometrix i TE-buffert fanns inte att analysera. * Ett negativt värde vid ett analystillfälle förekom. ** Två negativa värden vid ett analystillfälle förekom. *** Tre negativa värden vid ett analystillfälle förekom. 18

24 HSV 2 I PCR-vatten HSV 2-kontroller i PCR-vatten visade sig vara stabila i alla koncentrationer och temperaturer med undantag för de låga -kontrollerna, vilka var instabila (Tabell 7). I TE-buffert -kontrollerna klassificerades som instabila vid låga koncentrationer. Övriga kontroller var stabila med undantag för medelkoncentrationen för kontroller förvarade i frys. (Tabell 7). 19

25 Tabell 7. Variation i stabiliteten från vecka 1 till vecka 6. HSV 2 Zeptometrix RT Låg Hög Låg Hög Låg Hög Vatten * TE 0 0* 0 0* Kyl Vatten * TE Vatten *** 0 0* TE ** 0* * 0* Pil ner anger en förändring i Ct-värde som är större än 2,5 cykler eller där två av resultatet varit negativa. 0 anger en förändring i Ct-värde som är mindre än 2,5 cykler. Låg, medel och hög anger koncentrationer. RT, kyl och frys anger förvaringstemperaturer. Vatten och TE står för lösningsmedier som kontrollerna förvarats i. 500c/ 5µL för Zeptometrix i TE-buffert fanns inte att analysera. * Ett negativt värde vid ett analystillfälle förekom. ** Två negativa värden vid ett analystillfälle förekom. *** Tre negativa värden vid ett analystillfälle förekom. 20

26 Diskussion Syftet med studien var att jämföra laboratoriets -PCR-kontroller för diagnostik av HSV 1 och HSV 2 med två kommersiella kontroller. Under sex veckor gjordes analyser för att studera vilken av dessa kontroller som var mest stabil över tid. I utvärderingen jämfördes förvaringsmedium och temperatur. Lämpliga koncentrationer valdes efter Ct-värden från PCRanalys. Totalt utfördes 222 mätningar per virus. Det resultat som erhölls ledde till att förvaringsmedium och temperaturer för respektive kontroll kunde jämföras med varandra. Liknande studier har tidigare gjorts där stabiliteten av DNA undersökts över tid, men i dessa fall har undersökningarna gjorts under längre tid än sex veckor. Dessa studier har likt vår jämfört DNA-stabilitet i frys, i kyl och i rumstemperatur, men även andra temperaturer har undersökts, till exempel 37 C och 50 C. Jämförelser har även gjorts mellan olika förvaringsbuffertar. Nämnda undersökningar har gjorts i större omfattningar där statistiskt signifikanta skillnader kunnat fastställas till skillnad från denna studie (23, 24). Att inga negativa kontroller blev positiva tyder på att ingen kontamination förekommit och att utförandet kan bedömas vara acceptabelt. Det är alltid en risk att jobba med mycket positivt material särskilt över tid. Eftersom alla koncentrationer av kontroller sattes i triplikat kunde det resultat som avvek från de två övriga identifieras och exkluderas. De kriterier som användes för att bedöma kontrollernas stabilitet baserades på om det förekommit negativa resultat mer än två gånger (för samma kontroll, koncentration, förvaringstemperatur och förvaringsmedium) eller om det skett en ökning av Ct-värdet som var större än 2,5 cykler. En negativ mätning på grund av slumpen kan tolereras, men om det förekommer upprepade gånger är det tillräckliga skäl för att bedöma kontroller som instabila och därmed olämplig att använda som kontroll. En förändring med 3,3 cykler motsvarar en tiofaldig förändring i koncentrationen (25) och skulle därför kunna användas för att identifiera stora avvikelser, men få mätningar uppvisade så stora avvikelser. Därför valdes ett snävare intervall på 2,5 cykler för att inkludera de resultat som tydligt visade på ökade Ct-värden. Att Ct-värdena i många fall tenderade att öka något även vid stabila fall beror troligtvis på att DNA bröts ner (20). För -kontrollerna som laboratoriet nu använder visade de låga koncentrationerna på en tydlig instabilitet, vilket är förväntat. Dessa var främst instabila på grund av mätningar i triplikaten, som var negativa. Enligt resultatet från standardkurvorna innehåller dessa endast ett 21

27 fåtal kopior per reaktion. Ingen skillnad mellan HSV 1 och HSV 2 kunde observeras förutom att HSV 1 var mer känsliga vid förvaring i rumstemperatur. DNA degraderas i rumstemperatur och utan speciella förvaringsmedier är det inte en lämplig förvaringsform (23, 24). Med tanke på detta är det anmärkningsvärt att så många kontroller trots allt visade sig vara stabila i rumstemperatur under studien. -kontrollerna för båda virustyperna var stabila i medelkoncentration och i frysning, vilket är den rekommenderade förvaringstemperaturen. Kontrollerna var även stabila i medelkoncentration när de förvarades i kyla vilket ger orsak att fundera över om det är nödvändigt att göra en nedfrysning och en upptining inom några få veckors intervall. De kommersiella kontrollerna från visade på en tydlig stabilitet vid förvaring i PCRvatten. I enbart ett fall hade en mätning av tre blivit negativ. Detta var en kontroll med hög koncentration som förvarats i rumstemperatur. Detta var ett oväntat resultat med tanke på antalet kopior vid mätningen (500c/ 5µL). Troliga anledningar till att resultatet blivit negativ kan vara för lite eller inget kontrollmaterial eller mastermix i brunnen, eller något fel vid alikvoteringen. Eftersom det bara skett vid ett enstaka tillfälle och i en ej rekommenderad förvaringstemperatur så bör inte någon större vikt läggas vid detta. Zeptometrix Det fanns bara frysta kontroller för Zeptometrix under studien. Kontrollen visade på god stabilitet vid förvaring i PCR-vatten (förutom HSV 1 i låg koncentration). Den teoretiska koncentrationen efter extraktion för Zeptometrix låg på 500 c/ 5 µl, medan den koncentrationen som bestämdes genom standardkurvan låg på 30 c/ 5 µl för HSV 1 och 40 c/ 5 µl för HSV 2. Det ger anledning att fråga hur pass nära den verkliga koncentrationen ligger tillverkaren och hur pass bra utbytet är vid DNA-extraktionen. Har rätt spädning utförts vid upprättandet av standardkurvan? Var till exempel koncentrationerna för -kontrollerna rätt? Det kan också vara en kombination av fel koncentrationer och dåligt utbyte eftersom skillnaden är så stor. Förvaringsmedium I studien användes både PCR-vatten och TE-buffert som förvaringsmedium. I många fall visade det sig att kontrollerna spädda i TE-buffert som förvarats i frys var instabila. Många av dessa hade minst en mätning i triplikat som blev negativt under studien. Detta kunde observeras genomgående men var mer tydligt för HSV 1. Dessutom hade en negativ mätning i triplikatet 22

28 observeras i en något högre frekvens för TE-buffert jämfört med PCR-vatten för alla temperaturer och koncentrationer. Kombinationen TE-buffert och frys fungerade sämre under studien jämfört med PCR-vatten. Någon förklaring till detta har inte hittats i litteraturen. EDTA, en komponent i TE-buffert kan verka kelaterande på magnesium, som i sin tur kan inhibera PCR-reaktionen. En för hög koncentration av bufferten kan ha varit en faktor. (26) Enligt resultatet som fåtts i denna studie så rekommenderas inte TE-buffert som förvaringsmedium med tanke på att kontrollerna i verksamheten förvaras i frys. Men frågan är om kontrollerna håller bättre i TE-buffert än i PCR-vatten i längden? Förvaring i kyl och rumstemperatur visade sig vara bättre i TE-buffert i studien och förvaring i kyl ska hålla i upp till tre år (27). Spädningar Koncentrationen för respektive spädning i spädningsserierna som gjordes för kontrollerna var okända, men späddes i lika stora spädningssteg som gjordes för, som i detta fall hade känd koncentration. Spädningsserierna analyserades med realtids-pcr. De lägsta spädningarna var avsedda att vara de lägst detekterbara koncentrationerna i triplikat. Detta för att från början kunna ha en stabil låg koncentration med positivt resultat. Denna kontroll kommer med stor sannolikhet bli negativt efter en tid. En lämplig kontroll ska vara i så låg koncentration som möjligt men vara stabilt detekterbar över tid. Det förekom dock inte så pass låga spädningar att det fanns några negativa resultat i spädningsserien som utfördes, således valdes de spädningar med lägst koncentration att analyseras. Ct-värdena för kontrollerna låg på minst 37 cykler. Så höga Ct-värden tyder på att det fanns få DNA-kopior. Kontrollerna låg ändå innanför gränsen för var som var detekterbart. -kontrollerna låg på minst 33 cykler och därmed fanns det fler kopior än i -kontrollerna och de kunde förmodligen spätts i ytterligare några steg. Optimalt hade varit att göra ytterligare spädningssteg för att hitta den lägst detekterbara spädningen, men studiens tidsram var begränsad. Därför prioriterades inte detta. De höga koncentrationerna valdes utifrån Ct-värden som motsvarar en så hög koncentration av kopior att kontrollen förmodligen skulle hålla sig stabil under alla sex veckor. koncentrationerna valdes mellan den höga och den låga koncentrationen, för att den förmodligen ligger nära en lämplig koncentration för en kontroll, med åtanke att den låga kontrollen antagligen skulle bli negativt med tiden. Koncentrationerna för Zeptometrixkontrollen valdes utifrån tillverkarens angivelse av koncentration och uppmätt Ct-värde till att approximativt ligga nära de övriga kontrollernas koncentrationer, vilket det i efterhand visade 23

29 sig göra. Även här kunde en spädningsserie upprättats likt de övriga kontrollerna under optimala förutsättningar. Genom att alikvotera kontrollerna med utvalda spädningarna kunde det material som behövdes för varje analystillfälle tas fram smidigt. En stor mängd alikvoter behövde göras på så kort tid som möjligt för att kunna förvara dem i vald temperatur på ett likvärdigt sätt. Vidare studier skulle med en annan metod kunna fastställa kontrollernas verkliga koncentration. Sedan kunde koncentrationerna justerats så att antalet kopior per reaktion blir lika för alla tre spädningskategorier som då blir mer jämförbara. Jämförelse av kontrollers stabilitet -kontrollen som används på länssjukhuset Ryhov visade sig i den här studien hålla en bra stabilitet jämfört med de kommersiella kontrollerna. Enbart i de fall där koncentrationerna var låga eller varit förvarat i TE-buffert uppvisade instabilitet. hade visserligen mer stabila kontroller vid låga koncentrationer, men dessa hade också något högre koncentrationer, baserad på Ct-värde, jämfört med de övriga kontrollerna För kontroller som förvarade i TEbuffert visade -kontrollerna sig vara mer stabila både i kyl och i frys. En aspekt är priset där -kontroller har fördelen av att inte kosta någonting i inköp. I maj 2018 kostade kopior av HSV 1/HSV 2 från 3940 SEK medan samma antal kopior för samma virus kostade 5920 SEK från Zeptometrix. (Stark, Lisa. Muntlig referens. Medicindiagnostik Länssjukhuset Ryhov Jönköping ) Dessutom så förloras kopior vid extraktionen. Så är billigare än Zeptometrix. Studien var kort, bara sex veckor, men utifrån den data som insamlats finns det ingen större anledning att sluta använda -kontrollen. Vilken koncentration som är lämplig är inte helt lätt att svara på. Både HSV 1 och HSV 2 blir instabila vid runt ett tiotal kopior per 5 µl. Enligt den egna metodvalideringen ligger detektionsgränsen vid 50 c/ 5 µl för HSV 1 och under 5 c/ 5µL för HSV 2 (28). En kontroll bör ligga något över dessa värden. Något som talar för är att den kan användas som enbart extern amplifieringskontroll. Dessutom står tillverkaren för kvalitén av kontrollen och om något inte fungerar är det upp till företaget att lösa problemet. Men vid användning av -kontroller, om kvalitén av olika anledningar sviktar måste problemet lösas på plats. Någon skillnad mellan - och Zeptometrix-kontrollerna i PCR-vatten kunde inte ses. Både kontrollerna för HSV 1 och 2 tenderade att klara sig bättre i TE-buffert jämfört med 24

30 Zeptometrix. Fördelen med Zeptometrix jämfört med är att den kan användas både som extraktionskontroll och extern amplifieringskontroll, men här kan inte koncentrationen fastställas med lika stor säkerhet som med. 25

31 Slutsatser Analysresultaten som erhölls för de kommersiella kontrollerna och Zeptometrix, visar att stabiliteten hos dessa kontroller är likvärdiga med -kontrollerna, som för närvarande används på laboratoriet på molekylärbiologiska avdelningen på Laboratoriemedicin, Länssjukhuset Ryhov. När det gäller förvaringstemperaturerna, är kontrollerna något känsligare för rumstemperatur än vad de är för kyl och frys. PCR-vatten som förvaringsmedium verkar vara stabilare än TE-buffert, särskilt när TE-buffert kombinerades med frystemperatur. Vidare studier som görs under längre tid, i större omfattning och där koncentrationerna är samma för varje kontroll, behövs göras. Detta för att kunna dra mer generella slutsatser. 26

32 Omnämnanden Ett stort tack till våra handledare, Lisa Stark, metodspecialist, Olaf Dienus, molekylärbiolog, och Ann-Christin Nordqvist, metodansvarig biomedicinsk analytiker för vägledning och stöd under hela studiens gång. Även tack till Molekylärbiologiska avdelningen, Laboratoriemedicin, Medicindiagnostik Länssjukhuset Ryhov Jönköping för gott bemötande. 27

33 Referenser 1. Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Medical microbiology. 8th ed. Philadelphia: P.A. Elsevier; p Referensmetodik. Herpes simplexvirus typ 1 och 2 (CNS). NS), [ ] PCR assay for herpex simplex virus and varicella zoster virus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2013;46(5): Referensmetodik. Genital herpessimplex-provtagning. 3. Rodrigues D, de-paris F, Minuto Paiva R. Minimum detection limit of an nested [ ] 5. Referensmetodik. Nukleinsyrabaserad metod för påvisning av Herpes simplexvirusbilaga8. r_p%c3%a5visning_av_herpes_simplexvirus-bilaga8, [ ] 6. Buckingham L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods and clinical applications. 2nd ed. Philadelphia: F.A. Davis, p 70-75, , 137, 140, , , Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and technology. 2006;73(3): Garibyan L, Avashia N. Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology. 2013;133: Manske M, CC BY-SA 3.0, [ ] 28

34 10. Referensmetodik. Realtids-PCR [ ] 11. Doucette L. Mathematics for the clinical laboratory. 3rd ed. Philadelphia: P.A. Elsevier; p Koch WH. Technology platforms for pharmacogenomic diagnostic assays. Nature Reviews Drug Discovery. 2004;3: Figure 2, Genotype analysis approaches: hybridization probes. Redigerad av Samuel Karlsson och Nelly Palma Jansson 13. Tille P. Bailey & Scott's Diagnostic microbiology. 13th ed. St. Louis: Mosby Elsevier, p 118, Referensmetodik. Molekylärbiologisk diagnostik. ologisk_diagnostik, [ ] 15. Referensmetodik. Kvalitetssäkring och validering av PCR-baserade molekylärbiologiska metoder. ng_av_pcrbaserade_molekyl%c3%a4rbiologiska_metoder#kontrollernas_anv.c3.a4ndning, [ ] 16. Wilson IG. Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification. Applied and enviromental Microbiology. 1997;63(10): Woods S & Botha A. The new ISO Guide 80: Guidance for the preparation of quality control materials (QCMs). Accredation and Quality Assurance. 2014;19(6):

35 18. Brunstein J. Freeze-thaw cycles and nucleic acid stability: What's safe for your samples? Medical Laboratory Observer. 2015;47(9): Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 1993;362: Oxford Gene Technology. DNA storage and Quality [ ] 21. Rifai N. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 6th Ed. Philadelphia: P.A. Elsevier; p Thermo Fisher Scientific [ ] 23. Smith S, Morin P. Optimal storage conditions for highly dilute DNA samples: A role for trehalose as a preserving agent. Journal of Forensic Sciences. 2005;50(5): Howlett S, Castillo H, Gioeni L Robertson J, Donfack J. Evaluation of DNAstable for DNA storage at ambient temperature. Forensic Science International: Genetics. 2014;8(1): Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl M, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qpcr efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3: Khosravinia H, Ramesha K. Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction. African Journal of Biotechnology 2007:6(3);

36 27. Droog S, Lakenberg N, Meulenbelt I, De Maat M, Huisman L, Jie A, et al. Isolation and storage of DNA for population studies. Fibrinolysis and Proteolysis 1996;10: Juris J. Verifiering av instrumentbyte för påvisning Herpes och Varicella med Cobas z 480. Medicindiagnostik Region Jönköping;

37 Zeptometrix Bilagor Bilaga 1: Resultattabell HSV1, Vatten Ct-värden Skillnad i Ctvärde vecka 6 och vecka 1 Skillnad i procent vecka 6 och vecka 1 Vecka 1 Vecka 2 Vecka 3 Vecka 4 Vecka 5 Vecka 6 37,07 38,44* 39,57 38,46 *** 39,30* 2,23 6,0% Kyl Låg 37,07 39,43 39,76 40,21 39,64* 38,50 1,43 3,9% RT 37,07 38,88 39,63 40,09 40,59 39,90* 2,83 7,6% 35,51 37,38 37,23 37,43 36,80 37,10 1,59 4,5% Kyl 35,51 36,76 36,74 37,49 37,98 36,50 0,99 2,8% RT 35,51 36,91 37,08 38,47 40,24 39,20 3,69 10,4% 32,13 33,30 33,29 33,68 33,29 33,30 1,17 3,6% Kyl Hög 32,13 32,80 33,36 33,32 33,28 32,80 0,67 2,1% RT 32,13 32,41 33,63 34,65 34,83 35,40 3,27 10,2% 35,33 35,42 34,87 35,55 35,37 35,00-0,33-0,9% Kyl Låg 35,33 35,17 35,02 35,30 34,84 34,80-0,53-1,5% RT 35,33 34,23 34,78 35,10 34,98 35,00-0,33-0,9% 32,64 32,67 32,85 33,59 32,68 32,90 0,26 0,8% Kyl 32,64 32,75 33,02 32,96 32,91 32,70 0,06 0,2% RT 32,64 32,29 32,56 33,35 32,96 33,00 0,36 1,1% 28,22 32,08 28,95 29,18 28,94 29,00 0,78 2,8% Kyl Hög 28,22 28,66 28,88 28,81 28,69 28,50 0,28 1,0% RT 28,22 28,62 29,25 29,70 29,68* 30,00 1,78 6,3% låg 37,74 41,42 39,97* 42,89* 39,70 1,96 i 5,2% i 36,28 37,85 38,58 37,55 38,20 1,92 i 5,3% i Hög 33,95 33,66 33,53 34,17 33,82 33,90-0,05-0,1% i Skillnad vecka 6 och vecka 2 * Ett negativt värde vid ett analystillfälle förekom. ** Två negativa värden vid ett analystillfälle förekom. *** Tre negativa värden vid ett analystillfälle förekom.

38 Zeptometrix HSV 1, TE-buffert Ct-värden Skillnad i Ctvärde vecka 6 och vecka 1 Skillnad i procent vecka 6 och vecka 1 Vecka 1 Vecka 2 Vecka 3 Vecka 4 Vecka 5 Vecka 6 39,43 38,51* 40,31* 41,40 40,57 39,32-0,11-0,3% Kyl Låg 39,43 38,22 41,44** 41,66* 41,64 40,02* 0,59 1,5% RT 39,43 38,20 41,67 40,58* 40,87* 40,69 1,26 3,2% 38,00 35,67 37,89** 38,87 37,72 36,86-1,14-3,0% Kyl 38,00 35,74 38,00 38,02 38,25 35,99-2,01-5,3% RT 38,00 35,47 39,19 38,59 37,81* 36,31-1,69-4,4% 34,71 32,71 35,14 35,30 35,63* 32,96-1,75-5,0% Kyl Hög 34,71 32,32 34,75 34,66 35,15 32,93-1,78-5,1% RT 34,71 33,06 36,35 35,43 35,15* 34,16-0,55-1,6% 37,88 36,46 38,52 39,25** 37,88 36,97-0,91-2,4% Kyl Låg 37,88 36,55 38,45 38,94 38,81 37,14-0,74-2,0% RT 37,88 36,30 38,82 39,19 38,66 37,12-0,76-2,0% 35,93 34,29 37,13* 36,65 36,47* 35,90-0,03-0,1% Kyl 35,93 34,71 37,17* 37,64 37,17 36,08 0,15 0,4% RT 35,93 35,08 38,05 39,26 38,88 38,71 2,78 7,7% 32,18 31,08 32,62* 33,21 33,89* 32,05-0,13-0,4% Kyl Hög 32,18 30,74 32,56 32,92 33,83 32,71 0,53 1,7% RT 32,18 31,75 34,79 34,35 35,14 35,31 3,13 9,7% Låg 37,41 40,55 40,10 40,05* 38,70 2,64 i 3,4% i 36,08 38,30 40,10 38,95 37,24 2,87 i 3,2% i i Skillnad vecka 6 och vecka 2 * Ett negativt värde vid ett analystillfälle förekom. ** Två negativa värden vid ett analystillfälle förekom. *** Tre negativa värden vid ett analystillfälle förekom.

39 Zeptometrix HSV2, Vatten Ct-värden Skillnad i Ctvärde vecka 6 och vecka 1 Vecka 1 Vecka 2 Vecka 3 Vecka 4 Vecka 5 Vecka 6 37,77 38,58 *** 39,23* 38,91 39,13 1,36 3,6% Kyl Låg 37,77 39,25 38,58* 38,35 38,73 38,89* 1,12 3,0% RT 37,77 38,36* 39,36 39,90 39,70* 38,78* 1,01 2,7% Skillnad i procent vecka 6 och vecka 1 34,57 34,63 34,89 34,87 34,80 35,17 0,60 1,7% Kyl 34,57 34,27 34,56 34,16 34,33 34,00-0,57-1,6% RT 34,57 34,51 34,80 34,66 34,66 34,04-0,53-1,5% 32,38 32,98* 32,99 32,98 33,45 32,69 0,31 1,0% Kyl Hög 32,38 32,12 32,28 32,38 32,26 32,02-0,36-1,1% RT 32,38 32,15 32,21 32,06 32,14 31,64-0,74-2,3% 33,63 33,96 34,00 33,95 33,97 33,19-0,44-1,3% Kyl Låg 33,63 33,66 33,65 33,63 33,65 33,31-0,32-1,0% RT 33,63 33,26 33,57 33,81 33,55 33,49-0,14-0,4% 31,90 31,64 31,59 31,70 31,64 31,08-0,82-2,6% Kyl 31,90 31,40 31,41 31,24 31,35 30,82-1,08-3,4% RT 31,90 30,85 30,22 31,26 30,78 31,08-0,82-2,6% 26,64 27,42 27,31 27,57 27,43 27,28 0,64 2,4% Kyl Hög 26,64 27,17 27,44 27,36 27,32 27,05 0,41 1,5% RT 26,64 27,45 28,13 28,49 28,02 28,59 1,95 7,3% Låg 38,18 37,66 37,31 37,72 36,38-1,80 i -4,7% i 36,69 34,93 35,14 35,59 34,42-2,27 i -6,2% i Hög 31,59 31,52 31,68 31,71 31,60 31,35-0,24-0,8% i Skillnad vecka 6 och vecka 2 * Ett negativt värde vid ett analystillfälle förekom. ** Två negativa värden vid ett analystillfälle förekom. *** Tre negativa värden vid ett analystillfälle förekom.

40 Zeptometrix HSV 2, TE-buffert Ct-värden Skillnad i Ctvärde vecka 6 och vecka 1 Skillnad i procent vecka 6 och vecka 1 Vecka 1 Vecka 2 Vecka 3 Vecka 4 Vecka 5 Vecka 6 41,57 40,21** 40,71** 43,42* 41,45* 41,86* 0,29 0,7% Kyl Låg 41,57 41,71* 40,99* 40,99* 41,23** 41,07** -0,50-1,2% RT 41,57 40,65** 42,07** *** 41,36** 41,72 0,15 0,3% 35,45 36,60 36,87 36,88 36,78 36,85** 1,40 3,9% Kyl 35,45 36,65 37,51 38,00 37,39 37,63 2,18 6,2% RT 35,45 37,26 38,05 38,00 37,77 37,94 2,49 7,0% 34,06 34,30 35,35 35,50 35,05 35,30* 1,24 3,6% Kyl Hög 34,06 34,36 35,80 36,36 35,51 35,89 1,83 5,4% RT 34,06 35,92 36,33 36,06 36,10* 36,17 2,10 6,2% 35,17 35,93 36,27 36,31 36,17 36,25 1,08 3,1% Kyl Låg 35,17 35,31 35,93 35,92 35,72 35,86 0,69 2,0% RT 35,17 35,67 36,86 37,11 36,55 36,84 1,67 4,8% 33,14 33,14 33,47 33,60 33,40 33,49 0,35 1,1% Kyl 33,14 32,87 33,25 33,40 33,17 33,27 0,14 0,4% RT 33,14 33,03 33,53 33,85 33,47* 33,62 0,48 1,5% 28,50 29,38 30,04 30,24 29,89 30,06 1,56 5,5% Kyl Hög 28,50 29,31 29,73 30,12 29,72 29,86 1,36 4,8% RT 28,50 29,62 29,81 30,15 29,86 29,94 1,44 5,0% Låg 36,91 37,38 36,77 37,02* 37,06 0,15 i 0,4% i 34,93 35,60 34,98* 35,17 35,25 0,32 i 0,9% i i Skillnad vecka 6 och vecka 2 * Ett negativt värde vid ett analystillfälle förekom. ** Två negativa värden vid ett analystillfälle förekom. *** Tre negativa värden vid ett analystillfälle förekom.

41 Bilaga 2: Körningsscheman

42 PCR system: PCR på LightCycler Körningsschema:_HSV 1/HSV A Låg Hög Kyl Låg Kyl Kyl Hög RT Låg RT RT Hög Zeptometrix Låg Zepto Zepto Hög B Låg Hög Kyl Låg Kyl Kyl Hög RT Låg RT RT Hög Zepto Låg Zepto Zepto C Låg Hög Kyl Låg Kyl Kyl Hög RT Låg RT RT Hög Zepto Låg Zepto Zepto D Negativ Kontroll C F Låg Hög kyl Låg Kyl Kyl Hög RT Låg RT RT Hög Negativ Kontroll G Låg Hög kyl Låg Kyl Kyl Hög RT Låg RT RT Hög H Låg Hög kyl Låg Kyl Kyl Hög RT Låg RT RT Hög