Den stora tekniken för vävnadsanalys och in-vivo analys är ljusmikroskopi.

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Den stora tekniken för vävnadsanalys och in-vivo analys är ljusmikroskopi."

Anita Lindberg
för 7 år sedan
Visningar:

1 Fluorescens Teori Kvantutbyte Våglängdsshift Ligandinteraktioner Membraninteraktioner Att utnyttja quenchningseffekter Fluorescensanisotropi rörelse och molekylvikt Fluorescens in-vivo Lokalisering Avståndsmätning FRET FCS / FCCS

2 Den stora tekniken för vävnadsanalys och in-vivo analys är ljusmikroskopi. Haematoxylin and eosin staining protocol is used frequently in histology to examine thin sections of tissue. Haematoxylin stains cell nuclei blue, while eosin stains cytoplasm and connective tissue pink or red. Eosin is strongly absorbed by red blood cells, colouring them bright red.

3 Fördelar Nackdelar Enkelt Snabbt Billig utrustning (ljusmikroskop) En mängd färgämnen finns väl utprovade Viss selektion för olika typer av vävnader Endast ett fåtal färgämnen kompatibla med invivo studier Även ofärgat material syns vid belysning med vitt ljus blandning av färgämnen kan inte separeras

4 Vad kan vara fördelen med att använda fluorescenta färgämnen (dyes)?

5 Lokalisering av läkemedelsanaloger i parasiten Leishmania Dodge et al., Molecular Microbiology (2004) Parasiten Leishmania

6 Vad är viktigt när man väljer en fluorofor för mikroskopiska studier? In-vivo vs in-vitro?

7 Fluorescerande ämnen för studier i cellen

8 Exempel på hur ett fluorescent färgämne tas upp i cellen

9 GFP ett naturligt fluorescerande protein från maneten Aequora victoria Originalartikel: Ormö M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ Science 273: Review (på blackboard): RY Tsien, Annual Reviews in Biochemistry, 1998.

10 Mutationer i core hos vildtyps-gfp förändrar dess absorbans/emissions-egenskaper

11 ger olika exitations- och emissionsspektra (a) wild-type (grön), (b) Emerald (förbättrad vildtyp), (c) H9-40 (gröngul), (d ) Topaz (yellow), (e) W1B (cyan), och ( f ) P4-3 (blue).

12 och kan klonas ihop som fusionsprotein med intressanta targets för studier in vivo.

13 Enligt C&S Beskrivning av FRET

14 Energiöverföringen är proportionell mot avståndet mellan fluoroforerna Effektivitet i överföringen = 1 / (1 + (r/r o ) 6

15 Avståndsmätning möjlig! Änd-ändavstånd för en 4-varvs helix: 20 Å = 2 nm

16 Avståndsmätning kräver Tillräcklig närhet för interaktioner mellan de båda övergångsdipolerna samt överlapp mellan fluorescensemission hos donor och absorbans hos acceptorn. Hink et al., Plant Molecular Biology, 2002

17 Första test-caset: Calmodulin! + M13 är en peptid som binder till den calciumladdade formen av CaM. När M13 binds viks de båda halvorna av CaM mot varandra kring peptiden.

18 Vi vet att domänerna närmar sig varandra - får vi FRET eller inte? Fluorescent indicators for Ca 2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Miyawaki et al., Nature 1997

19 Miyawaki et al., Nature 1997 Så här blev emissionen vad händer vid tillsats av calcium? Varför?

20 Varför? Hintar: Hur ser det totala emissionsspektrumet för CFP+YFP a) Om ingen FRET sker? b) Om vi har FRET?

21 FRET in vivo: kan detekteras genom att se om summan av fluorescensen av de separata proberna är lika med det spektrum som observeras Functional interaction of phytochrome B and cryptochrome 2. Paloma Más, Paul F. Devlin, Satchidananda Panda & Steve A. Kay Nature 2000

22 Konfokalmikroskopi Fluorescenta prober exciteras med laserljus The big picture. Technology Feature article, Nature 2005

23 Senaste infärgningsmetoden: nanopartiklar Vilka fördelar jfrt fluorescens???

24 FCS, Fluorescenskorrelationsspektroskopi Här studeras fluorescensen hos enstaka molekyler - single molecule fluorescence - när de passerar det konfokala fönstret i ett speciellt utrustat lasermikroskop. Medina & Schwille, Bioassays, 2002 Hink et al., Plant Molecular Biology, 2002

26 Molekylrörelser mäts med FCS genom att studera autokorrelationsfunktionen

27 Cellulära komponenters translationsrörelse kan bestämmas Medina & Schwille, Bioassays, 2002

28 Fluorescens en teknik för detektion av Lokala interaktioner Förändringar i core folding/unfolding Ligandbindning Rörelse och dynamik In-vivo-mätningar möjliga Avstånd - Interaktion Känsligt vi har ingen bakgrund och kan ofta excitera specifika fluoroforer Ofta modellberoende information om dynamik ges indirekt Vi ser bara i närheten av en fluorofor!

Relevanta dokument

) / (c l) -A R ) = (A L. -ε R. Δε = (ε L. Tentamen i Biomätteknik (TFKE37), 9 januari Uppgift 1 (10p)

) / (c l) -A R ) = (A L. -ε R. Δε = (ε L. Tentamen i Biomätteknik (TFKE37), 9 januari Uppgift 1 (10p) Tentamen i Biomätteknik (TFKE37), 9 januari 2014. Uppgift 1 (10p) För akronymerna FT- IR, AUC, AFM, UV och MALDI: a) Skriv ut förkortningen! b) Föreslå för varje metod två egenskaper hos biomolekyler som