QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA För In Vitro Diagnostisk Användning CLIA Komplexity: Hög

Transkript

1 QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA För In Vitro Diagnostisk Användning CLIA Komplexity: Hög Avsedd användning QUANTA Lite TM F-Actin IgA är en enzymlänkad immunosorbent analys (ELISA) för semikvantitativ detektering av IgA-antikroppar hos F-aktinkomponenten hos slät muskulatur i humant serum. Hos patienter med kliniska rön som tyder på celiaki kan förekomsten av anti-f-aktin IgA-antikroppar bidra till en utvärdering av sannolikheten för betydande tarmluddsatrofi. Summering och förklaring av testet Anti-F-aktinautoantikroppar utgör huvudkomponenten i det som kallas slät muskel-antikroppar (ASMA). Dessa antikroppar har en specificitet mot F-aktinkomponenten i cytoskelettet och detekteras traditionellt genom indirekt immunofluorescens med användning av tunna snitt av lever, njure eller mage från råtta som substrat. 1-3 Slät muskel-antikroppar riktar sig mot flera olika komponenter, varav den viktigaste är F-aktin, men immunofluorescens kan även detektera antikroppar mot tubulin och mellansträngar. 4,5 Hos patienter med autoimmunhepatit (AIH), återspeglar antislätmuskelreaktivitet primärt anti-f-aktinantikroppar, under det att antislätmuskelreaktivitet vid sådana virusinfektioner som infektiös mononukleos, viral hepatit, mässling och påssjuka beror på reaktivitet för cytoplastiska non-f-aktinantigener. 4-8 Anti-F-aktin IgG-antikroppar har rapporterats hos % av patienter med AIH och hos 22 % av patienter med primär biliärcirros (PBC). 7-9,12-16 Anti-F-aktin IgG-antikroppar (vanligen med låg titer) har rapporterats i 3-18 % av sera från den friska populationen. 17 I motsats till anti-f-aktin IgG-antikroppar, som är karakteristiska för patienter med autoimmunhepatit, så är anti-faktin IgA-antikroppar kliniskt relevanta för patienter med celiaki. Nyligen genomförda studier har funnit att IgAantikroppar mot F-aktin uppvisar en betydande korrelation med graden av tarmluddatrofi hos patienter med celiaki Clemente et al, användning av en immunofluorescensanalys (IFA) för detektering av anti-f-aktin IgAantikroppar på specialbehandlade enterocyter, fann att 98.2 % av celiakipatienter med en flat slemhinna, 89 % av patienter med subtotal luddatrofi, 30 % av patienter med partiell luddatrofi och 0 % av de endomysiala och vävnadstransglutaminasnegativa kontrollerna var positiva för anti-f-aktin IgA-antikroppar. 25 Pedreira, S. et al. rapporterade att 95 % av obehandlade celiakipatienter hade förhöjda anti-f-aktin IgA-antikroppsvärden jämfört med normala kontroller. 23 Gruppen fann även att högre titer för anti-f-aktinantikroppar korrelerade med allvarligare tarmskador. Anti-F-aktin IgA-antikropparna minskar efter införande av en glutenfri diet och antyder att mätning av dessa antikroppar kan ha betydelse för övervakning av efterlevnad av glutenfria dieter. 22 Immunofluorescensrutiner för detektering av F-aktin eller slätmuskelantikroppar är subjektiva och analysernas prestanda beror på den typ av vävnad som används, konjugatspecificiteten, styrkan hos det mikroskopsystem som används för att läsa resultatet och observatörens tekniska kunnande. ELISA-metoder för detektering av F- aktinantikroppar rapporterades först i mitten av 80-talet till början av 90-talet 4,5,7,8 och har potential för mer standardiserade och tekniskt mindre krävande och automatiserbara prestanda. 7,9-12 Procedur Renat F-Actin antigen är bundet till väggarna i brunnarna på en mikrotiterplatta. Förspädda kontroller och utspädda patientserum adderas till egna mikrotiterbrunnar, vilket låter förekommande F-Actin antikroppar att binda till det immobiliserade antigen. Obundet prov tvättas bort och ett enzymmärkt anti-humant IgA konjugat adderas till varje brunn. En andra inkubation tillåter den enzymmärkta antikroppen att binda till patientantikropparna, som har fast sig vid mikrotiterbrunnarnas väggar. Efter att ha tvättat bort obundet enzymmärkt anti-humant IgA, så kan den återstående enzymaktiviteten mätas genom att tillsätta ett cromogent substrate och mäta intensiteten i färgutvecklingen. Assayen kan utvärderas spektrofotometriskt genom att mäta och jämföra färgintensiteten i patientbrunnen med färgen i kontrollbrunnarna. Reagens 1. Polystyren microtiter ELISA platta coatad med renat F-Actin antigen (12-1 x 8 wells), med hållare i folieförpackning med torktillsats 2. ELISA Negativ Kontroll, 1 flaska med buffer innehållande konserveringsmedel och humant serum utan antikroppar mot F-Actin, förspädd, 1.2 ml 1

2 3. F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, 1 flaska med buffer innehållande konserveringsmedel och humant serum med antikroppar mot F-Actin, förspädd, 1.2mL 4. F-Actin IgA ELISA Hög Positiv, 1 flaska med buffer som innehåller konserveringsmedel och humant serum med antikroppar mot F-Actin, förspädd, 1.2mL 5. HRP Prov Diluent, 1 flaska färgad rosa innehållande Tris-buffrad koksaltlösning, Tween 20, protein stabiliserare och konserveringsmedel, 50mL 6. HRP Tvättlösningskoncentrat, 1 flaska med 40x koncentrat färgad röd innehållande Tris-buffrad koksaltlösning och Tween 20, 25mL. OBS, Se Metod delen för spädningsinstruktioner. 7. HRP IgA Konjugat, (get), anti-human IgA, 1 flaska färgad gul innehållande buffer, protein stabiliserare och konserveringsmedel, 10mL 8. TMB Cromogen, 1 flaska innehållande stabiliserare, 10mL 9. HRP Stopplösning, 0.344M Svavelsyra, 1 flaska färglöst, 10mL Varning 1. VARNING: Den här produkten innehåller kemikalier (0.02% chloramphenicol) i provspädningsbufferten, kontrollerna och konjugatet, som av delstaten California är kända för att orsaka cancer. 2. Allt humant material som använts till förberedning av kontroller för denna produkt har testats och befunnits vara negativt avseende antikroppar mot HIV, HBsAg, och HCV med FDA registrerade metoder. Ingen testmetod kan fullständigt garantera att HIV, HBV, HCV eller andra infektiösa smittbärande substanser inte finns i materialet. Därför bör F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, F-Actin IgA ELISA Hög Positiv och ELISA Negativ Kontroll hanteras på samma sätt som potentiellt infektiöst material Sodium Azid används som konserveringsmedel. Sodium Azid är ett gift och kan vara giftigt om det inmundigas eller absorberas genom huden eller ögon. Sodium azide kan reagera med bly och koppar i avloppsledningar och bilda potentiellt explosiva metallazider. Spola ur avloppen med stora mängder vatten för att förebygga bildandet av metallazider. 4. HRP konjugatet innehåller en utspädd giftig/korrosiv kemikalie, som kan vara giftig om den inmundigas i stora mängder. För att förebygga kemikalie skador, undvik kontakt via hud och ögon. 5. TMB Cromogenet innehåller en irritant, som kan vara skadlig om den inhaleras, inmundigas eller absorberas via huden. För att undvika skada, undvik inhalation, inmundigande eller kontakt med hud och ögon. 6. HRP Stopplösningen består av en utspädd svavelsyralösning. Undvik exponering för basiska material, metaller eller andra ämnen som kan reagera med syror. Svavelsyra är giftigt och korrosivt och kan vara giftigt om det inmundigas. För att undvika kemikalieskador, undvik kontakt med hud och ögon. 7. Använd lämplig personlig skyddsutrustning när du arbetar med de inkluderade reagenserna. 8. Utspillt reagens bör torkas upp omedelbart. Var vänlig att respektera all gällande lagstiftning när ni hanterar kemikalierester. Försiktighetsåtgärder 1. Denna produkt är avsedd för In Vitro Diagnostiskt bruk. 2. Utbyte av komponenter i detta kit, mot andra än sådana som levererats med reagenskitet kan leda till felaktiga resultat. 3. Ofullständig tvätt eller en ineffektiv tvätt samt otillräcklig aspiration av vätska från mikrotiterbrunnarna kommer att orsaka försämrad precision och/eller hög bakgrund. 4. Anpassning av detta test för användning med automatiserad provhanterare eller andra vätskehanteringssystem kan resultera i skillnader i testresultat, jämfört med den manuella proceduren. Det är varje laboratoriums ansvar att validera att deras instrument ger provsvar som är acceptabla. 5. Många olika faktorer kan påverka testets prestanda. Dessa är bland andra start temperatur för reagenserna, omgivningstemperaturen, noggrannheten och reproducerbarhet i pipetteringstekniken, noggrannheten i tvätt och aspiration av vätska från mikrotiterbrunnarna, fotometern som används för att mäta färgutvecklingen, och inkubationstidernas längd under assay proceduren. Noggrann uppmärksamhet är nödvändig för att erhålla korrekta och reproducerbara resultat. 6. Rekommendationen är att följa protokollet i detalj. 7. Dålig förslutning av den zip-lock försedda foliepåsen innehållande mikrotiterbrunnremsor och torkmedel kommer att resultera i antigen degradering och försämrad precision. 8. Oacceptabelt låga absorbanser kan erhållas efter två eller flera användningar av en flaska HRP konjugat efter en tid. Det är viktigt att följa rekommendationer avseende hantering av HRP konjugat för att undvika att detta problem uppstår. 9. Kemisk kontamination av HRP konjugatet kan resultera från otillräcklig rengöring eller sköljning av 2

3 utrustning eller instrument. Rester av vanliga laboratoriekemikalier såsom formalin, blekmedel, etanol eller tvättmedel orsakar nedbrytning av HRP konjugatet över tid. Skölj noggrant all utrustning och alla instrument efter användning av kemiska rengöringsmedel/desinficeringsmedel. Lagringsförhållanden 1. Lagra alla kitreagenser i 2-8 C. Frys inte ner. Reagenserna är stabila tills utgångsdatum om dom lagras och hanteras enligt rekommendation. 2. Oanvända antigen coatade mikrotiterbrunnsremsor bör förvaras i den noggrant återförslutna foliepåsen tillsammans med torkningsmedlet och lagras i 2-8 C. 3. Färdigspädd tvättbuffer är stabil i 1 vecka vid lagring i 2-8 C. Provinsamling Denna testprocedur bör utföras med ett serumprov. Tillsatser av azid eller andra konserveringsmedel kan påverka resultaten negativt. Mikrobiologisk kontaminering, värmebehandling eller prover som innehåller synliga partiklar bör inte användas. Prover med kraftig hemolys, lipemiska serum eller prover bör undvikas. Efter insamling så skall provet separeras från koagel. NCCLS Document H18-A3 rekommenderar följande lagringsförhållanden för prover: 1) Lagra prover vid rumstemperatur i högst 8 timmar. 2) Om testproceduren inte kommer att vara utförd inom 8 timmar förvara provet i kyla vid 2-8 C. 3) Om testproceduren inte kommer att utföras inom 48 timmar, eller om prover skall skickas, frys ner provet och förvara det vid -20 C eller lägre. Frusna prover måste mixas efter de är tinade. 29 Procedur Inkluderat material 1 F-Actin ELISA microtiterbrunnplatta (12-1 x 8 brunnar), med hållare 1 1.2mL förspädd ELISA Negativ Kontroll 1 1.2mL förspädd F-Actin IgA ELISA Låg Positiv 1 1.2mL förspädd F-Actin IgA ELISA Hög Positiv 1 50mL HRP Provdiluent 1 25mL HRP Tvätlösningskoncentrat, 40x koncentrat 1 10mL HRP IgA Konjugat, (get), anti-humant IgA 1 10mL TMB Cromogen 1 10mL HRP Stopplösning, 0.344M Svavelsyra Rekommenderad utrustning som inte ingår Mikropipetter för dispensering av 5, 100, och 500µL Engångsspetsar för mikropipett Provrör för spädning av patientprover, 4mL volym Destillerat eller avjoniserat vatten 1L behållare för utspädd HRP Tvättlösning Mikrotiterplattläsare som kan läsa Absorbans vid 450nm (och 620nm för referensvåglängd) Metod Innan du startar 1. Alla reagens och prover skall ha rumstemperatur (20-26 o C) och mixa dom noga. 2. Späd HRP Tvättkoncentratet 1:40 genom att addera innehållet till en behållare med 975mL destillerat eller avjoniserat vatten. Om hela plattan inte används kan en mindre kvantitet förberedas genom att addera 2.0mL av koncentratet till 78mL destillerat eller avjoniserat vatten per två remsor av mikrotiterbrunnar som används. Den utspädda bufferten är stabil i en vecka vid 2-8 o C. 3. Förbered en 1:101 spädning av varje patientprov genom att addera 5µL patientprov till 500µL HRP provdiluent. Utspädda prover måste användas inom 8 timmar. SPÄD INTE F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, F-Actin IgA ELISA Hög Positiv och ELISA Negativ Kontroll. 4. Bestämning av förekomsten eller frånvaron av F-Actin IgA antikroppar använder arbiträra enheter och kräver två brunnar för varje av de tre kontrollerna och en eller två brunnar för varje patient prov. Det är rekommenderat att analyserna utför i duplikat. 3

4 Assay procedur 1. ALLA REAGENS MÅSTE HA RUMSTEMPERATUR (20-26 C) INNAN ASSAYEN PÅBÖRJAS. Placera det erforderliga antalet mikrotiterbrunnar/remsor i hållaren. Stoppa omedelbart in ej använda remsor med mikrobrunnar i foliepåsen tillsammans med torkmedlet och återförslut den för att minimera exponeringen för vattenångor. 2. Addera 100µL av den förspädda F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, F-Actin IgA ELISA Hög Positiv, och ELISA Negativ Kontroll samt de spädda patientproverna till brunnarna. Täck brunnarna och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur på en jämn yta. Inkubationstiden börjar efter tillsatsen av det sista provet. 3. Tvättsteg: Aspirera noggrant innehållet i varje brunn. Addera µL av den utspädda HRP Tvättbufferlösningen till alla brunnar, aspirera sedan. Repetera detta två gånger till, totalt tre tvättcykler. Vänd upp och ner på plattan och knacka den mot ett absorberande material för att avlägsna återstående vätska efter den sista tvättcykeln. Det är viktigt att helt tömma varje brunn efter varje tvättsteg. Bibehåll samma sekvens för aspireringen av vätska som användes vid tillsättningen av prover. 4. Addera 100 µl av HRP IgA Konjugatet till varje brunn. Konjugatet skall avlägsnas från flaskorna under renliga förhållanden och enligt god laboratorieteknik. Avlägsna endast den mängd av konjugat som behövs för att utföra assay proceduren. FÖR ATT UNDVIKA POTENTIELL MIKROBIOLOGISK OCH/ELLER KEMISK KONTAMINATION, HÄLL ALDRIG TILLBAKA OANVÄNT KONJUGAT I FLASKAN. Inkubera brunnarna i 30 minuter som i steg Tvätt steg: Repetera steg Addera 100µL av TMB Cromogen till varje brunn och inkubera i mörker i 30 minuter vid rumstemperatur. 7. Addera 100µL av HRP Stopplösning till varje brunn. Upprätthåll samma sekvens och timing som vid tillsättningen av TMB Cromogen. Knacka försiktigt med ett finger på plattan för att mixa reagenserna i brunnarna noggrant. 8. Läs absorbansen (OD) för varje brunn vid 450nm inom en time från det att reaktionen stoppats. Om bikromatiska mätningar önskas kan 620nm användas som referens våglängd. Kvalitetskontroll 1. F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, F-Actin IgA ELISA Hög Positiv och ELISA Negativ kontroll bör användas i varje batch av regaenser för att säkerställa att alla reagenser och procedurer har fungerat korrekt. 2. Var uppmärksam på att F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, F-Actin IgA ELISA Hög Positiv och ELISA Negativ Kontroll alla är förspädda och att dom inte kan avslöja hanteringsfel vid spädning av prover. 3. Ytterligare kontroller kan testas i enlighet med de krav eller guidelines som gäller för det enskilda laboratoriet. Ytterligare lämpliga kontrollsera kan förberedas genom allikvotering av en pool med humant serum som lagras vid <-20 C. 4. För att test resultaten skall anses vara giltiga, måste samtliga nedanstående kriterier uppfyllas. Om något eller några av dessa inte är uppfyllt bör analyssvaret anses vara ogiltigt och analysen bör upprepas. a. Absorbansen hos F-Actin IgA ELISA Hög Positiv måste vara större än absorbansen hos F-Actin IgA ELISA Låg Positiv, som måste vara större än absorbansen hos ELISA Negativ Kontroll. b. F-Actin IgA ELISA Hög Positiv måste ha en absorbans större än 1.0 OD och ELISA Negativ Kontroll får inte ha en absorbans som överstiger 0.2. OD. c. F-Actin IgA ELISA Låg Positiv måste ha en absorbans som är mer än två ganger högre än absorbansen hos ELISA Negativ Kontroll eller överstiga 0.25 OD. d. ELISA Negativ Kontroll och F-Actin IgA ELISA Hög Positiv är avsedda att monitorera för substantiella reagens fel. F-Actin IgA ELISA Hög Positiv säkerställer inte precision vid testets cutoff. e. Användaren bör följa NCCLS Document C24-A3 för ytterligare vägledning avseende lämpliga QC procedurer. 30 4

5 Beräkning av Semikvantitativa resultat - Ratio Metoden Den genomsnittliga absorbansen (OD) för varje set av duplikat bestäms först. Reaktiviteten för varje prov kan då beräknas genom att dela den genomsnittliga absorbansen med den genomsnittliga absorbansen för F-Actin IgA ELISA Låg Positiv. Resultaten multipliceras med det antal units som tilldelats F-Actin IgA Låg Positiv och kan läsas på etiketten. Provets OD Provets Units = x F-Actin IgA ELISA Låg Positiv (Units) F-Actin IgA ELISA Låg Positiv OD Reaktiviteten är relaterad till kvantiteten av närvarande antikropp på ett icke-linjärt sätt. Även om ökningar och minskningar kommer att reflekteras av en motsvarande ökning och minskning i reaktivitet så är inte förändringen proportionell. (t.ex.en dubblering av antikroppskoncentrationen kommer inte att dubblera reaktiviteten). Om en mer precis bestämning av patientens antikroppsnivå krävs, så kan seriella spädningar av patientprovet göras och den sista spädningen som är positiv i analysen bör rapporteras som patientens antikroppstiter. Tolkning av Resultat Ett ELISA test är en känslig teknik som kan mäta mycket små skillnader i patient populationer. Värdena som visas här är endast förslag. Varje laboratorium bör etablera sina egna normalvärden som baserar sig på sina egna tekniker, kontroller, utrustning och patientpopulation enligt deras egna etablerade procedurer. Proverna kan sedan klassificeras som negativ, tvivelaktiga, eller positiv i enlighet med nedanstående tabell. Units Negativ < 20 Tvivelaktiga Positiv > Ett positivt anti-f-aktin IgA-resultat hos patienter med celiaki indikerar en ökad sannolikhet för svår tarmluddsatrofi. 2. Ett negativt resultat indikerar att inga F-Actin IgA antikroppar finns i provet eller att förekomsten är vid en så låg koncentration att nivån understiger den cut-off som testet har. 3. Det föreslås att följande ordalydelse följer provsvaret vid laboratoriets rapport: Resultaten har erhållits med INOVA QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. F-Actin IgA värden erhållna med olika tillverkares assay metoder kan inte jämföras direkt. Storleken av de rapporterade IgA nivåerna kan inte korreleras till en end-point titrering. Begränsningar i Proceduren 1. Förekomsten av immunkomplex eller andra immunoglobulin aggregat i patient provet kan orsaka en ökad nivå av icke-specifik bindning och producera falskt positiva svar i denna assay. 2. Alla celiakipatienter är inte positiva för F-aktin IgA-antikroppar. 3. Alla positiva slätmuskelprover har inte F-aktin IgA-antikroppar. 4. Detektering av F-aktin IgA-antikroppar hos patienter med leversjukdom ska tolkas med försiktighet eftersom förekomsten av F-aktin IgG-antikroppar i denna sjukdomsgrupp många gånger åtföljs av F-aktin IgA-antikroppar som kan vara orelaterade till tarmpatologi. F-aktin IgA-antikroppar ska endast mätas hos patienter med celiaki som ett hjälpmedel för bedömning av tarmskador. 5. Resulten av denna assay bör användas i kombination med kliniska fynd och andra serologiska tester. Testets prestanda har inte undersökts med andra matrix än serum. Prestandadata Förväntade värden Normal värden En panel bestående av 500 prover tagna från synbarligen friska personer (250 män och 250 kvinnor) testades med QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA-satsen. Åldrarna låg vid (median = 41). Analysspecificiteten var 92.2 % (461/500). Tre av de 39 proven var specifika för ttg IgA-antikroppar och kan därför utgöra odiagnosticerade celiakipatienter. Ett av dessa tre prover var även endomysialpositivt och är mer eller mindre helt säkert verklig celiaki. Utbredningen av celiaki i den normala USA-populationen har bedömts uppgå till 1:133 och därför är detekteringen av odiagnosticerade celiakipatienter i den normala kohorten inte oväntad. 26 Klinisk Sensitivitet och Specificitet Eftersom den avsedda användningen av QUANTA Lite TM F-Actin IgA-analysen är att bedöma sannolikheten för tarmskador hos patienter med celiaki så beräknades känsligheten och specificiteten på basis av 445 prover med biopsiresultat. Av de 445 proverna hade 157 Marsh 3 - och 288 Marsh 0-, 1- eller 2-patologi. 27 N =445 Marsh Utfall F-Actin IgA Units M3a/b/c M0,M1,M2 Totalt Pos (>24.9 units) Neg (<24.9 units) Totalt Tvivelaktiga resultat räknades som negativa (dvs. ej positiva) Klinisk Sensitivitet: 48.4% (76/157) (95% CI, 40.4% to 56.5%) Klinisk Specificitet: 95.1% (274/288) ( %) Positiv Förutsägande värde: 84.4% Negativ Förutsägande värde: 88.4% Effektivitet: 78.7% 5

6 Om beräkningarna utförs med enbart M3c (total luddatrofi) som referensindex så blir känsligheten och specificiteten 59,4 % respektive 91,3 %, som framgår nedan. N =445 Marsh Utfall F-Actin IgA Units M3c Non-M3c Totalt Pos (>24.9 units) Neg (<24.9 units) Totalt Tvivelaktiga resultat räknades som negativa (dvs. ej positiva) Klinisk Sensitivitet: 59.4% (60/101) (95% CI, 49.2% to 69.1%) Klinisk Specificitet: 91.3% (314/344) ( %) Positiv Förutsägande värde: 66.7% Negativ Förutsägande värde: 88.5 Effektivitet: 78.7% Jämförelse med förutsägande enhet QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA jämfördes med en av FDA godkänd enhet för detektering av IgA-antikroppar för celiakimarkörvävnadstransglutaminas (ttg). Den positiva procentuella överensstämmelsen var 74/128 = 57.8 % och den negativa procentuella överensstämmelsen var 27/29 = 93.1 % när celiakipatienter med Marsh 3a, 3b eller 3c testades med de två enheterna. När endast personer med Marsh 3c (total luddatrofi) testades uppgick den positiva överensstämmelsen till 60/98 = 61.2 % och den negativa procentuella överensstämmelsen till 3/3 = 100 %. De flesta positiva F-aktin IgA-prover är även ttg-positiva men endast celiakipatienter med svåra tarmskador är F-aktin IgA-positiva. Korsreaktivitet Sera från 36 patienter med autoimmun/infektiössjukdomsantikroppar eller specifika sjukdomstillståndssera, inklusive gastrisk parietalcell, RNP, SSA, Sb, Scl70, Jo1, glomerulär basmembran, LKM-1, löslig leverantigen, centromer, kromatin, autoimmunhepatit, primär biliärcirros, hepatit B-virus, hepatit C-virus, primär skleroserande kolangit, testades med avseende på korsreaktivitet med QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. Flera prover med leversjukdom var positiva för F-aktin IgA-antikroppar. Detektering av F-aktin IgA-antikroppar hos patienter med leversjukdom ska tolkas med försiktighet eftersom förekomsten av F-aktin IgG-antikroppar i denna sjukdomsgrupp många gånger åtföljs av F-aktin IgA-antikroppar som kan vara orelaterade till tarmpatologi. Precision och reproducerbarhet Prestanda inom analyser bedömdes genom att sex prover kördes sammanlagt sju gånger vardera. Tabell 1: Intra-assay Performance of QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Spec. 1 Spec. 2 Spec. 3 Spec. 4 Spec5 Spec6 Mean units SD CV % Variationen mellan analyser bedömdes genom dubblerad test av sex prover med kitets höga positiva kontroll (HPC) och negativa kontroll (NC) två gånger dagligen (en gång på förmiddagen och en gång på eftermiddagen) i tre dagar. Tabell 3: Inter-assay Performance for QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA HPC Spec. 1 Spec. 2 Spec. 3 Spec. 4 Spec. 5 Spec.6 NC Mean units SD CV % Referenser 1. Gabbiani, G. et al. Human smooth muscle autoantibody. Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to "nonmuscular" cells. Am J Pathol 72, (1973). 2. Anderson, P. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26, (1976). 3. Bottazzo, G. F. et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 29, (1976). 4. Toh, B. H. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38, (1979). 5. Toh, B. H. et al. Viral infections and IgM autoantibodies to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37, (1979). 6. Andersen, P., Small, J. V., Andersen, H. K. & Sobieszek, A. Reactivity of smooth-muscle antibodies with F- and G-actin. Immunology 37, (1979). 7. Bretherton, L. et al. ELISA assay for IgG autoantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51, (1983). 8. Kurki, P. Determination of anti-actin antibodies by a solid-phase immunoenzymatic assay and by indirect immunofluorescence technique. Clin Immunol Immunopathol 11, (1978). 9. Dighiero, G., Lymberi, P., Monot, C. & Abuaf, N. Sera with high levels of anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin Exp Immunol 82, 52-6 (1990). 6

7 10. De Scheerder, I. et al. Post-cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56, (1985). 11. Leibovitch, L., George, J., Levi, Y., Bakimer, R. & Shoenfeld, Y. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Lett 48, (1995). 12. Frenzel, C. et al. Evaluation of F-Actin ELISA for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol 101, (2006). 13. Czaja, A. J., Cassani, F., Cataleta, M., Valentini, P. & Bianchi, F. B. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24, (1996). 14. Kurki, P. et al. Different types of smooth muscle antibodies in chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis: their diagnostic and prognostic significance. Gut 21, (1980). 15. Granito, A. et al. Antibodies to filamentous actin (F-Actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 59, (2006). 16. Liaskos, C., Bogdanos, D. P., Davies, E. T. & Dalekos, G. N. Diagnostic relevance of anti-filamentous actin antibodies in autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 60, (2007). 17. Fagraeus, A. & Norberg, R. Anti-actin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82, 1-13 (1978). 18. Carroccio, A. et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: A multicentre study. Dig Liver Dis 39, (2007). 19. Carroccio, A. et al. Anti-actin antibodies in celiac disease: correlation with intestinal mucosa damage and comparison of ELISA with the immunofluorescence assay. Clin Chem 51, (2005). 20. Clemente, M. G. et al. Immune reaction against the cytoskeleton in coeliac disease. Gut 47,520-6 (2000). 21. Clemente, M. G. et al. Detection of Autoantibodies against Enterocyte Actin Filaments as Serological Predictive Test for Intestinal Villous Atrophy in Celiac Disease: Results of a Polycentric Study. Gastroenterology 124, A-660 (2003). 22. Granito, A. et al. Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease. Clin Exp Immunol 137, (2004). 23. Pedreira, S. et al. Significance of smooth muscle/anti-actin autoantibodies in celiac disease. Acta Gastroenterol Latinoam 35, (2005). 24. Norman, G. L. et al. in Association of Medical Laboratory Immunologists (Chicago, Ill, 2007). 25. Clemente, M. G. et al. Enterocyte actin autoantibody detection: a new diagnostic tool in celiac disease diagnosis: results of a multicenter study. Am J Gastroenterol 99, (2004). 26. Fasano, A. et al. Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study. Arch Intern Med 163, (2003). 27. Antonioli, D. A. Celiac disease: a progress report. Mod Pathol 16, (2003). 28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 29. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38): CLSI (NCCLS). Feb Statistical quality control: Principles and definitions: Approved Guideline Third Edition. CLSI Document C24-A3, Vol 26(25):1999 Tillverkad av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service SWE April 2008 Revision 0 7