PLATELIA H. PYLORI IgG TEST DETEKTION AV ANTI-HELICOBACTER PYLORI IgG I HUMANT SERUM GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS

Transkript

1 PLATELIA H. PYLORI IgG TEST DETEKTION AV ANTI-HELICOBACTER PYLORI IgG I HUMANT SERUM GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS 1- KLINISK BETYDELSE Helicobacter pylori, som identifierades av Warren och Marshall 1983, är en spiralformad gramnegativ bakterie som har konstaterats ha en viktig roll i orsaksmekanismen för en rad inflammatoriska gastroduodenala sjukdomar [1]. Förekomsten av H. pylori-infektioner är mycket stor. H. pylori-infektion kan förekomma hos hela 50 % av invånarna som är över 50 år i industrialiserade länder och hos 90 % av hela befolkningen i utvecklingsländer [2]. H. pylori-kolonisering i magsäckens slemhinna kan förbli symtomfri eller orsaka svåra kliniska symtom däribland kronisk gastrit, duodenalsår eller magsår, slemhinnerelaterade lymfom i lymfvävnaden och magsäckscancer [3]. Testning med avseende på H. pyloriär ett viktigt steg vid diagnostisering av personer med symtom på gastroduodenal inflammation. Övertygande bevis har erhållits om att en effektiv och varaktig läkning av duodenala sår är beroende av utrotningen av H. pylori [4]. Denna bakterie kan påvisas genom följande test: Direkt via biopsiprov (histologiska studier och odlingar). Detta omfattar ett invasivt förfarande som förknippas med obehag och trauma för patienten, en risk för negativa effekter och en risk för falskt negative resultat på grund av att biopsin görs i fel område. Indirekt genom serologisk testning. Denna icke-invasiva metod har en global metods känslighet och är både enkel och relativt billig att utföra. 2- TESTPRINCIP Platelia H. pylori är ett immunoenzymatiskt test med vilket antikroppar mot H. pylori kan detekteras i humant serum. Mikroplattorna har sensibiliserats med ett delvis renat antigenextrakt som ej innehåller flagellantigen som eventuellt kan orsaka korsreaktioner [6]. Testserum och kalibratorer späds ut och fördelas i mikroplattans brunnar som är belagda med H. pylori-antigen. Under den första inkuberingsperioden binder ev. H. pylori IgG-antikroppar i provet, till H. pylori-antigen i brunnen. Efter inkuberingen tas icke-specifika immunoglobuliner och serumproteiner bort genom tvättning. Därefter tillsätts konjugatet, en peroxidasmärkt monoklonal antikropp, specifik för human Ig-G, i mikroplattans brunnar och inkuberas. Under denna andra inkuberingsperiod binder den märkta monoklonala antikroppen till H. pylori IgG-antikropp H. pylori antigen-komplexen. Efter inkubering tas obunden märkt antikropp bort genom tvättning. En framkallningsreaktion sätts igång genom tillsättning av en lösning innehållande ett peroxidassubstrat och en kromogen. Den enzymatiska reaktionen avbryts genom tillsättning av syra. Optisk densitet avläses med hjälp av spektrofotometer, inställd på 450/620 nm. Den optiska densiteten är proportionell mot mängden IgG-antikroppar mot H. pylori i provet. 3- PRODUKTINFORMATION Mer information om förvaringsvillkor och sista förbrukningsdag finns angivet på förpackningen. Etikett Reagenser Kvantitet R1 Microplate Mikroplatta (färdig att använda): 12 remsor med vardera 8 brunnar som kan brytas av, belagda med H. pylori-antigen och förpackade i en försluten, foliebelagd påse. R2 R3 Concentrated Washing Solution Negative Control Koncentrerad tvättlösning (10x): TRIS-NaCl-buffert (ph 7,4), 1% Tween 20. Konserveringsmedel: 0,01% thimerosal. Negativ kontroll (human) Konserveringsmedel: < 0,1% natriumazid 1 1 x 100 ml R4 Cut-off Control Gränsvärdeskontroll (human) Konserveringsmedel: < 0,1% natriumazid R5 Positive Control Positiv kontroll (human) Konserveringsmedel: < 0,1% natriumazid 1

2 R6 Sample Diluent Prov-spädningsvätska: Konserveringsmedel: 0,01% thimerosal 1 x 110 ml R7a R7b Conjugate (40x) Conjugate Diluent Koncentrerat konjugat (40x): Murin monoklonal antikropp mot human IgG, märkt med pepparrotsperoxidas. Konserveringsmedel: 0,01% thimerosal Konjugat-spädningsvätska: Konserveringsmedel: 0,01% thimerosal 1 x 0,45 ml 1 x 12 ml R8 R9 TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution TMB-substratlösning (färdig att använda): Citronsyra- och natriumacetatlösning (ph 5,2) innehållande 0,009% H 2 O 2 och 4% DMSO Kromogen: TMB/DMSO-lösning Lösning innehållande 0,6% tetrametylbensidin (TMB) 1 x 60 ml R10 Stopping Solution Stopplösning (färdig att använda): 1,5N svavelsyralösning 1 x 12 ml Självhäftande folie 4 4- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas: Använd ej reagens efter passerat bäst före-datum. Låt reagens uppnå rumstemperatur (18 30 C) före användning. Blanda inte reagens från olika partier inom en bestämd analysomgång. Tvättlösningen (R2) är utbytbar mellan partierna förutsatt att samma parti används inom en bestämd analysomgång. Rekonstituera och späd noggrant reagenserna och undvik kontamination. Utför ej testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika konjugat- eller substratlösningarna. Den utspädda kromogenlösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara färglös. Använd ej lösningen om den blir blå ett par minuter efter rekonstituering. Bered denna lösning i ett rent engångstråg av plast eller i en glasbehållare som först har förtvättats med 1N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Förvara lösningen i mörker. Använd en ny pipettspets för varje prov. Tvättningen av mikroplattan är ett kritiskt steg i detta förfarande. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren och innan reagenstillsättning. Använd aldrig samma behållare för fördelning av konjugat- och framkallningslösning. Kontrollera noggrannhet och funktion för pipetter och annan utrustning.. HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR Använd engångshandskar vid reagenshantering. Munpipettera ej. Material av humant ursprung som använts vid beredning av reagenser har testats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B ytantigen (HBs Ag), antikroppar mot hepatit C-virus (anti-hcv) och antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv1 och anti-hiv2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittämnen, skall reagens av humant ursprung och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta allt material, däribland tvättlösningen, som kommer i direkt kontakt med prover och reagenser av humant ursprung som potentiellt smittsamma. Undvik spill. Vid spill av syra måste den neutraliseras med natriumbikarbonat, därefter rengöras med 10% blekmedel och torkas upp med absorberande papper. Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover, reagens av humant ursprung, liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter får endast kastas efter att sanering har skett. Ställ inte in lösningar som innehåller natriumhypoklorit i autoklaven. Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen och tvättlösning eftersom detta kan leda till förgiftning, irritation eller brännskador. VARNING! Xi - Irriterande Tvättlösningen, R10, består av 1,5N svavelsyralösning. Svavelsyra (H 2 SO 4 ) 1,5N: DMSO (dimethylsulfoxyde) 90% R36/38 Irriterar ögonen och huden. S26/30 Vid kontakt med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Häll aldrig vatten på eller i produkten. Ett varuinformationsblad kan beställas efter behov. 2

3 5- PROV 1. Den rekommenderade provtypen är serum insamlat i torra rör. 2. Lägg märke till följande rekommendationer om hantering, bearbetning och förvaring av serumprover. - Iakttag normala försiktighetsåtgärder vid provtagning. - Låt serumprover koagulera fullständigt före centrifugering. - Rören ska alltid vara förslutna. - Separera serum efter centrifugering och förvara i ett tätt förslutet förvaringsrör. - Proverna kan förvaras vid+2 8 C om screening sker inom 24 timmar. - Om analysen ej kommer att slutföras inom 24 timmar, eller vid provtransport, ska proverna frysas i 20 C eller kallare. - Tina helst proverna endast en gång. Serum som har varit fryst skall blandas ordentligt innan testet utförs.. 3. Prover som innehåller upp till 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 30 g/l triolein (triglycerid) och hemolyserade prover som innehåller upp till 10 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. 4. Värm inte proverna. 6- TESTFÖRFARANDE 6.1 Nödvändig men ej bifogad material Vortexmixer. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter (*). Vattenbad eller motsvarande inkubator för mikroplattor, inställd via termostat på 37± 1 C (*). Manuell, halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor (*). Behållare för smittförande avfall. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten. Graderade mätglas med volymerna 25, 50, 100 och ml. Engångshandskar av latex. Skyddsglasögon. Absorberande papper. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller multipipetter för att mäta och fördela 10 till µl respektive 1, 2 och 10 ml. Engångsrör. (*) Begär gärna mer information om den utrustning som vår tekniska avdelning rekommenderar. 6.2 reagensrekonstituering R1: Klipp upp påsen 0,5 1 cm ovanför linjen. Lägg omedelbart tillbaka oanvända remsor i påsen. Se till att torkmedlet ligger kvar i påsen. Stäng noggrant påsen och förvara den i +2 8 C. R2: Späd 1/10 med destillerat vatten. Bered 350 ml för en platta med 12 remsor om tvättningen sker manuellt. R7: Bered strax före användning den mängd konjugat som behövs för en analysomgång genom att späda en del konjugatkoncentrat (40x) (R7a, blå) med 40 delar konjugatspädningsvätska (R7b, röd). Det erhållna konjugatet är lila (innehåller natriummertiolat vid en koncentration som ej överstiger 0,01%). R9: Späd med substratbuffert (R8) 1/50 (exempel: 200 µl R ml R8). Bered 4 ml reagens per remsa. 6.3 Förvaring av öppnade och/eller rekonstituerade reagenser R1: När väl den vakuumförslutna påsen har öppnats förblir remsorna stabila i upp till sex veckor förutsatt att de förvaras i +2 8 C i samma väl förslutna påse innehållande torkmedel. R2: När tvättlösningen väl är utspädd kan den förvaras i 15 dagar i +2 8 C. Den koncentrerade tvättlösningen kan förvaras i C. R3, R4, R5, R7a och R7b: Kontrollserum R3, R4, R5, konjugatet R7a respektive dess spädningsvätska R7b kan förvaras i +2 8 C i samma väl förslutna flaska i upp till sex veckor efter att flaskan öppnades första gången. R7: När konjugatlösningen väl är rekonstituerad kan den förvaras i 2 timmar i rumstemperatur ( C). R9: När lösningen väl är utspädd är den stabil i upp till 6 timmar om den förvaras mörkt i rumstemperatur ( C). R6, R8, R9, R10: När reagenserna väl har öppnats är de stabila, vid förvaring i +2 8 C till det sista förbrukningsdatum som finns angivet på etiketten. 6.4 Förfarande Följ noggrant testförfarandet. Använd kalibratorerna vid varje analysomgång för att validera testresultaten. Låt reagens uppnå rumstemperatur (18 30 C) före användning. 1. Fastställ noggrant ett provsättningsprotokoll, inbegripet en brunn för negativ kontroll (R3), tre brunnar för gränsvärdeskontroll (R4) och en brunn för positiv kontroll (R5). 2. Späd tvättlösningen (R2). (Se avsnitt 6.2). 3. Ta ut brickan och remsorna (R1) ur skyddsförpackningen. 4. Späd provet och kontrollserumen 1/101 med spädningsvätska R6 (10 µl serum + 1 ml spädningsvätska R6). Gör tre spädningar 1/101 av gränsvärdeskontrollserumet (R4) i tre olika rör (10 µl + 1 ml R6) och använd ett rör per brunn. Blanda spädda prover med vortexmixer. 5. Vid manuellt utförande av testet tillsätts 100 µl av kontrollerna (R3, R4, R5), spädning 1/101, och proverna (S1, S2 etc ), spädning 1/101, i brunnarna enligt förslaget nedan : 3

4 A R3 S4 B R4 S5 C R4 S6 D R4 S7 E R5 S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Täck mikroplattan med självhäftande folie. Tryck till ordentligt så att det sluter tätt. Inkubera mikroplattan i ett termostatstyrt vattenbad eller inkubator för mikroplattor i 30 minuter vid 37 C. 7. Innan den första inkuberingsperioden är slut bereds konjugatlösningen (R7) genom att späda den 40 gånger: Späd 25 µl R7a (blå) med 1 ml R7b (röd) (för en remsa) (se avsnitt 6.2). Blanda väl. 8. När den första inkuberingperioden är slut tas den självhäftande folien bort. Aspirera innehållet i alla brunnar i en behållare för smittförande avfall (innehållande natriumhypoklorit). Tvätta mikroplattan 3 gånger. Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot det absorberande papperet för att ta bort resterande vätska. 9. Tillsätt 100 µl konjugatlösning (R7) i varje brunn. Lösningen måste skakas varsamt före användning. 10. Täck mikroplatten med självhäftande folie. Tryck till ordentligt så att det sluter tätt. Inkubera mikroplattan i ett termostatstyrt vattenbad eller inkubator för mikroplattor i 30 minuter vid 37 C. 11. När den andra inkuberingsperioden är slut tas den självhäftande folien bort. Aspirera alla brunnar och tvätta 4 gånger. Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot det absorberande papperet för att ta bort resterande vätska. 12. Bered den enzymatiska framkallningslösningen (R9 utspädd 1/50 med R8) (se avsnitt 6.2) och tillsätt 200 µl i varje brunn. Låt reaktionen fortgå i mörker i 30 minuter vid rumstemperatur ( C). Använd ingen självhäftande folie under denna inkubering. 13. Tillsätt 100 µl stopplösning (R10) i varje brunn. Fördela i samma ordning och med samma hastighet som för framkallningslösningen. 14. Torka noggrant av mikroplattans botten. Läs av optisk densitet vid 450/620 nm med hjälp av en mikroplattavläsare inom 30 minuter efter att reaktionen har avbrutits (remsorna måste alltid hållas borta från direkt ljus före avläsningen). 15. Kontrollera alla resultat med avseende på överensstämmelse mellan spektrofotometrisk och visuell avläsning och provsättningsprotokoll för plattan 7- BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 7.1 Kvalitetskontroll Inkludera alla kalibratorerna vid varje analysomgång. För att testet ska betraktas som giltigt måste följande kriterier uppfyllas. Värden för optisk densitet: - OD R4 0,500 - OD R4 1,100 Kvot: - OD R3 / medelvärdet för OD R4 0,250 - OD R5 / medelvärdet för OD R4 1,500 Om kvalitetskontrollkriterierna inte är uppfyllda ska testet göras om 7.2 Beräkning av gränsvärde (cov) COV = medelvärde för OD (R4) Observera: Gränsvärdet (COV) är medelvärdet för den optiska densiteten (OD) för brunnarna som innehåller gränsvärdeskontrollen R4. Värden som ligger utanför ska ignoreras: OD R4 0,500 eller OD R4 1, beräkning av kvot för varje prov Provkvot = provets OD/COV (medelvärdet för OD R4) 4

5 7.4 utvärdering av resultat Kvot för vuxna Kvot för barn Resultat > 1,10 0,90 Positiv 1,10 0,90 < 0,90 0,80 Tveksam < 0,90 < 0,80 Negativ Utvärdering Förekomst av antikroppar med en signifikant titer som överensstämmer med H. pyloriinfektion Ingen signifikant antikropptiter. Om nydebuterad infektion misstänks rekommenderas att ett nytt serumprov tas två till tre veckor efter det första provet. Analysera båda serumproverna under samma analysomgång. Frånvaro av immunologiskt belägg för H. pylori-infektion. Om nydebuterad infektion misstänks rekommenderas att ett nytt serumprov tas två till tre veckor efter det första provet. Analysera båda serumproverna under samma analysomgång. För att öka känsligheten bör gränsvärdet sänkas för prover från barn. 7.5 Felsökning Icke validerade eller icke repeterbara reaktioner orsakas ofta av följande: Otillräcklig tvättning av mikroplattan. Kontaminering av negativa prov med serum eller plasma med en hög antikropptiter. Kontaminering av framkallningslösningen med oxidationsmedel (blekmedel, metalljoner ). Kontaminering av stopplösningen. 8- TESTETS BEGRÄNSNINGAR NEGATIVA RESULTAT: Är oftast en indikation på avsaknad av H. pylori-infektion. I början av en infektion kan dock antikropptitern vara för låg för att ge ett positivt resultat. Om man misstänker en nydebuterad infektion bör ett nytt serumprov tas två till tre veckor efter det första och båda serumen ska analyseras under samma analysomgång. Om den specifika IgG-titern ökar mellan de två provtagningstillfällena är detta en indikation på H. pylori-infektion. POSITIVA RESULTAT: Med testet går det inte att skilja mellan en tidigare infektion och en aktiv infektion. Resultatet bör därför utvärderas mot bakgrund av kliniska symtom. Diagnos av nydebuterad infektion kan endast fastställas utifrån en kombination av kliniska observationer och serologiska data. Resultatet av ett enstaka serumprov är inte ett tillräckligt bevis för diagnos av en nydebuterad infektion. Det finns ingen korrelation mellan kvoten som uttrycker antikropptitern och de kliniska symtomens svårighetsgrad. 9- SÄRSKILDA EGENSKAPER 9.1 känslighet och specificitet Kliniska studier av Platelia H. pylori-testet har utförts på två grupper av serum från patienter med dyspepsi. Ett biopsiprov togs från varje patient samtidigt som blodprov togs. Känslighet och specificitet för testet beräknades med hänsyn till resultat från mikrobiologisk och histologiskundersökning av biopsiprov. H. pylori-infektion definierades som växt av H. pylori i odlingar och/eller påvisande av H. pylori i histologiska preparat och/eller ett positivt ureastest, medan frånvaro av H. pylori infektion definierades som negativt resultat för alla tre testerna. Resultat VUXNA (medelålder 44±15 år) BARN (medelålder 9±4,7 år) Antal serumprover 92 (31Hp-; 61 Hp+) 160 (106 Hp-; 54 Hp+) Känslighet 100,0 % (61/61) 98,1 % (51/52) Specificitet 90,0 % (27/30) 89,3 % (92/103) PPV 95,3 % (61/64) 82,2 % (51/62) NPV 100,0 % (27/27) 98,9 % (92/93) Indeterminanta resultat 1,1 % (1/92) 3,1 % (5/160) 5

6 9.2 Precision Reproducerbarhet inom en analysomgång 8 serumprover testades med 10 replikat: 4 positiva serum (P1, P2, P3 och positiv kontroll R5) och 4 negativa serum (N1, N2, N3 och negativ kontrollserum R3). serum Medelvärde av kvoterna CV P1 P2 P3 R5 N1 N2 N3 R3 1,42 2,47 1,91 2,03 0,43 0,15 0,21 0,08 4,0 % 4,4 % 5,2 % 3,9 % 3,3 % 3,8 % 3,7 % 9,7 % Reproducerbarhet mellan analysomgångarna 4 positiva serum (P1, P2, P3 och positiv kontroll R5) och 8 negativa serum (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7 och negativt kontrollserum R3) testades i 5 olika analysomgångar under olika dagar. serum Medelvärde av kvoterna DS CV P1 P2 P3 R5 2,64 2,00 2,38 2,16 0,161 0,067 0,074 0,097 6,1 % 3,4 % 3,1 % 4,5 % N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 R3 0,10 0,21 0,39 0,10 0,05 0,13 0,12 0,08 0,012 0,005 0,008 3,6 % 1,8 % 3,1 % 5,2 % 7,6 % 6,3 % 3,6 % 5,2 % 9.3 Korsreaktivitet För att undvika korsreaktioner med flagellerade organismer (t.ex. Campylobacter jejuni) kommer antigen som används i testet från en H. pylori-stam utan flagellstrukturer. 10- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagens tillverkas och prepareras i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till slutlig marknadsföring av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad. 6

7 11- REFERENSER 1. Blaser M.J., Hypothesis on the pathogenesis and natural history of Helicobacter pylori-induced inflammation. Gastroenterology, 102 : Vincent P., Epidémiologie de l infection à Helicobacter pylori. La Lettre de l infectiologue : VIII, De Korwin JD. Les pathologies associées à l'infection par Helicobacter pylori. Ann. Inst. Pasteur/actualités, 1995, 2 : Patchett S., Beattle S., Leen C., Keane C., O Morain C., Helicobacter and duodenal ulcer recurrence. Am. J. Gastr., 87 : Widmer M., de Korwin JD, Aucher P., Thiberge J.M., Labigne A., Fauchère JL, Performances of native and recombinant antigens for Helicobacter pylori serology. Gut, suppl.2, 39, A Lee A., Logan S.M., Trust T.J., Demonstration of flagellar antigen shared by a diverse group of spiral shaped Bacteria that colonize intestinal mucus. Inf. Immun. 55 : Newell D.G., Identification of the outer membrane proteins of C. pyloridis and antigenic cross-reactivity between C. pyloridis and C.jejuni. J. Gen. Microbiol., 133 : Warren JR & Marshall BJ,1983. Unidentified curved Bacilli on gastric epithelium in active gastritis. Lancet, i : Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /2009 7