M1551_v02 11/2016 (sv) ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551. ELISA-set för kvantitativ bestämning av humana IgG-subklasser i serum (sv)

Transkript

1 Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: reagents@sanquin.nl Website: M55_v0 /0 (sv) ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 ELISAset för kvantitativ bestämning av humana IgGsubklasser i serum (sv) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL sv Antikroppar mot Svart Buffert Kalibrerare Konjugat Kontroll DIL GREEN HRP HUM HO MOU sv Spädning Grön HRP Human Hydrogenperoxid Mus RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS sv Röd Plattlock Lager Stopp Subklasserr Substrat WASH WELL YELLOW sv Tvätta Brunnar Gul Gränsvärden ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS

2 sv I. INLEDNING Humant IgG best av fyra subklasser: IgG, IgG, IgG och IgG. De biokemiska kännetecknen för lggsubklasserna har beskrivits ingående (5). Skillnaderna mellan lggsubklasserna återspeglas i olika biologiskt viktiga funktioner som antigenigenkänning, komplementaktivering och bindning till cellytreceptorer. Många studier har utvisat att avvikande serumnivåer hos lggsubklasser kan kopplas till olika sjukdomsstadier. Särskilt kopplingen mellan selektiv lggsubklassbrist med ökad mottaglighet för virala eller bakteriella infektioner har dokumenterats ingående (, 5). Låga serumnivåer av lgg eller lgg har rapporterats hos patienter med återkommande övre och nedre luftvägsinfektioner. Andra har hittat en koppling mellan mycket låga lggserumkoncentrationer och återkommande sinuspulmonalinfektioner (). Avvikande serumnivåer hos lggsubklasserna har också observerats vid autoimmunsjukdomar, neurologiska rubbningar och HIVinfektioner (). II. TEKNISK PRINCIP PeliClass humana subklass ELISAset är en enzymimmunanalys av 'sandwich'typ. Setet best av remsor med mikrobrunnar belagda med mycket aktiva monoklonala antikroppar, var och en specifik för en av de humana IgGsubklasserna. Prover, kalibrerar och kontrollserum inkuberas i respektive brunn. IgGsubklassen som ska bestämmas kommer att binda till den solida fasen och obunden IgG tvättas bort. Därefter tillsätts peroxidaskonjugerat antihumant IgGantiserum i varje brunn och obundet konjugat tvättas bort. Efter inkubation med substratlösning (ABTS) och HO stoppas reaktionen med en syrabuffert. Den grönfärgade reaktionsprodukten mäts med absorbering och koncentrationen av IgGsubklass i provet beräknas relativt till värdena på en referenskurva. IgGsubklass kontrollserum analyseras för att kontrollera kalibreringskurvornas giltighet och hur pass korrekt IgGsubklassbestämning var. IgGsubklassnivåerna i kalibrerarna fastställdes med en kalibrerare som avletts av WHO 7/97 referenspreparat som kalibrerare. De rekommenderade mätvärdena på 5,0 g/l för IgG,, g/l för IgG, 0, g/l för IgG och 0,5 g/l för IgG användes (7). III. FÖRVARING OCH STABILITET PeliClass humana subklass ELISAset bör förvaras i upprätt position i 8 C. Den kan användas fram till utgångsdatumet som finns på etiketten. För alla komponenter är stabiliteten vecka efter öppning vid förvaring vid 8 C. Transportförhållandena kan avvika från förvaringsförhållandena. IV. SETETS INNEHÅLL Se vidare i tabellen i början av denna bipacksedel. PeliClass humana subklass ELISAset innehåller tillräckligt med reagens för 8 prover för varje subklass, inklusive kalibrerare, kontroller och tomma. Monoklonala antikroppar har renats från vävnadsodlingsmedium med hjälp av kolonnkromatografi (jonbyte och affinitetskromatografi). Kalibrerar och kontrollsubstansen är flytande humanserum. V. SÄKERHET Denna PeliClass human subclass ELISA kit har en stopbuffer som innehåller farliga ämnen. Farosymbol: Signalord: Riskfraser: H9 Varningsfraser: P80 P P05+P5+P8 P7+P GHS07 Varning Orsakar allvarlig ögonirritation. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det g lätt. Fortsätt att skölja Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp VI. YTTERLIGARE MATERIAL SOM KRÄVS Destillerat vatten för förtunning av tvättnings, förtunnings och substratbuffrar. Pipettutrustning för att få korrekta volymer. En inkubator (7 ± C). En ELISAtvättare av standardtyp eller en 500 ml plastsprutflaska för automatisk eller manuell tvättning av remsorna. En ELISAavläsare av standardtyp för mätning av absorbering vid nm eller 05 nm. Loglineärt papper. VII. HANTERING AV PROVERNA Endast serumprover skall testas. Proverna ska vara så färska som möjligt eller förvaras frysta. Proverna bör spädas ut manuellt före användning (se VII ANALYSPROTOKOLL). VIII. ANALYSPROTOKOLL Se till att alla reagenser f rumstemperatur (85 C) och blanda grundligt. Undvik bubblor eller skum. Vi rekommenderar att alla prover, kontroller och kalibrerarförtunningar testas i två exemplar.

3 . MIKROTITERPLATTA PeliClass humana IgGsubklass ELISAset ger flexibiliteten att använda partiella plattor vid separata tillfällen. Före plastpåsen öppnas, bestäm antalet remsor som krävs för att testa önskat antal prover plus brunnar som krävs för att köra kalibrerare, kontroller och tomma i två exemplar. Avlägsna remsor som inte kommer att användas från plattramen och packa in dem på nytt i plastpåsen som innehåller torkmedlet och förvara vid 8 C.. BUFFERTPREPARATIONER Tvättningsbuffert: Framställ tvättningsbufferten genom att tillsätta hela innehållet i flaskan med tvättningsbuffertskoncentrat i 950 ml destillerat vatten. Den utspädda tvättningsbufferten måste förvaras vid 8 C och förblir stabil i vecka. Obs: Den koncentrerade bufferten kan innehålla saltkristaller. Före den utspädda bufferten framställs, värm den koncentrerade bufferten KORT till 7 C för att lösa upp kristallerna. Förtunningsbuffert: Beräkna mängden förtunningsbuffert som krävs (ca. ml outspädd buffert per mikrobrunnsremsa) och framställ en utspädd lösning genom att späda ut bufferten 0 gånger i destillerat vatten.. PREPARATION AV KALIBRERAREN OCH KONTROLLSERUM För koncentrationer, se Tabell och i den bifogade informationsbroschyren. Kalibrerare: (Se Tabell i den bifogade broschyren) Etikettera ett 0 ml rör med ':500' och åtta ml rör med 'Cal till Cal8' respektive. Använd en pipett och spruta in,99 ml förtunningsbuffert i 0 ml röret och tillsätt 0 µl kalibrerarserum (initial utspädning :500). Använd en pipett och spruta in,9 ml förtunningsbuffert i röret med texten 'Cal' och,0 ml i rören med texterna 'Cal Cal8'. Använd en pipett och spruta in 00 µl :500 utspädd kalibrerare i röret Cal och från det här röret gör du sju tvåfaldiga seriella utspädningar genom att tillsätta,0 ml från föregående förtunning i nästa 'Cal'rör. För varje IgGsubklass väljer du serie kalibrerarförtunningar: IgG : : IgG, IgG och IgG :0 000 : Kontroll: Förse ett rör med texten :500 och två ml rör med :0 000 (för IgG,, ) och :0 000 (för IgG) respektive. Använd en pipett och spruta in i röret med texten :500,99 ml förtunningsbuffert och 0 µl kontrollserum. Använd en pipett och spruta in i röret med texten : µl förtunningsbuffert och 5 µl :500förtunning. Använd en pipett och spruta in i röret med texten : µl förtunningsbuffert och 5 µl av :0 000förtunningen. Framställ ett rör på ml med ml förtunningsbuffert som tomt.. PREPARATION AV PROVER Späd ut proverna med förtunningsbuffert enligt samma protokoll som för kontrollserum. För resultat som ligger utanför de angivna gränsvärdena (se Tabell i den bifogade informationsbroschyren) ska testet upprepas med en annan provförtunning. 5. FÖRSTA TVÄTTNINGSSTEGET Tvätta de mikrobrunnarna som ska användas i plattramen fyra gånger med tvättningsbuffert. För manuell tvättning, fyll brunnarna helt och hållet (> 00 µl) med tvättningsbuffert och kasta bort. Upprepa proceduren tre gånger. Slutligen bör brunnarna vara helt tomma. Efterföljande reagens bör tillsättas omedelbart. Låt inte brunnarna stå torra under en längre tid.. FÖRSTA INKUBERINGSSTEGET Tillsätt 00 µl av de utspädda kalibrerarna, proverna och tomma i lämpliga brunnar. Täck över plattan med en häftande försegling, skaka försiktigt genom att knacka på kanten på mikrotiterplattan i några sekunder för att blanda innehållet i varje brunn. Inkubera i timme vid 7 C. Strax före tvättning, framställ nästa inkubationsreagens enligt beskrivningen i punkt ANDRA TVÄTTNINGSSTEGET Sug ut supernatant från brunnarna och tvätta plattan enligt beskrivningen under punkt INKUBATION MED HRPKONJUGERAD ANTIKROPP TILL HUMANT IgG Späd ut konjugatet :500 genom att spruta 0 µl av konjugatet med pipett till,97 ml förtunningsbuffert. Späd ytterligare ut konjugatet till: :000 genom att spruta, ml av :500förtunningen med pipett till,0 ml förtunningsbuffert. :000 genom att spruta,0 ml av :500förtunningen med pipett till,0 ml förtunningsbuffert. :000 genom att spruta,5 ml av :500förtunningen med pipett till,5 ml förtunningsbuffert. Tillsätt: 00 µl av :500förtunningen till antiigg mikrobrunnsremsorna 00 µl av :000förtunningen till antiigg mikrobrunnsremsorna 00 µl av :000förtunningen till antiigg mikrobrunnsremsorna 00 µl av :000förtunningen till antiigg mikrobrunnsremsorna Täck över plattan med en häftande försegling, skaka försiktigt genom att knacka på kanten på mikrotiterplattan i några sekunder för att blanda innehållet i varje brunn. Inkubera i timme vid 7 C. Strax före tvättning, framställ nästa inkubationsreagens enligt beskrivningen i punkt TREDJE TVÄTTNINGSSTEGET Sug ut supernatant från brunnarna och tvätta plattan enligt beskrivningen under punkt INKUBATION MED ABTSSUBSTRAT Beräkna mängden substratlösning (ca. 0,9 ml per mikrobrunnsremsa kommer att behövas). Tillsätt motsvarande 00 µl hydrogenperoxid moderlösning och 00 µl ABTS moderlösning i 0 ml utspädd substratbuffert ( ml substrat moderlösning + 8 ml destillerat vatten). Tillsätt 00 µl substratlösning i alla brunnar. Skaka försiktigt genom att knacka på kanten på mikrotiterplattan i några sekunder för att blanda innehållet i varje brunn. Inkubera i 0 minuter i rumstemperatur (85 C).. STOPPA ENZYMATISK REAKTION Tillsätt 50 µl stopplösning i alla brunnar.. AVLÄSNING AV PLATTA Avläs inom timme vid (helst) eller 05 nm i en ELISAavläsare. IX. RESULTAT OCH TOLKNING AV DATA Registrera absorberingen vid (helst) eller 05 nm för varje brunn och beräkna genomsnittet på duplikatvärdena. För varje prov bör duplikaten inte avvika mer än 5 % från medelvärdet. Om duplikaten avviker mer bör analysen göras om. Markera de genomsnittliga absorberingarna av kalibrerarna (yaxel) jämfört med den relaterade subklasskoncentrationen i ng/ml (xaxel) på loglineärt papper och rita bäst passande kurva. IgGsubklassnivåerna av kontrollserumet ska ligga inom de gränsvärden som anges i Tabell i den bifogade informationsbroschyren. Interpolera de genomsnittliga absorberingsvärdena för varje prov på referenskurvan.

4 Prover som visar en genomsnittlig absorbering utanför området för referenskurvans förtunningar bör spädas ut på lämpligt sätt. För en utvärdering av IgGsubklasskoncentrationen i ett prov, jämför de nivåer som hittades med de normala värdena för IgGsubklasser (se X REFERENSOMRÅDEN). X. ANALYSOMRÅDEN Se Tabell i den bifogade informationsbroschyren för de setspecifika analysområdena. XI. REFERENSOMRÅDEN Referensområden (g/l) för IgGsubklasser hos serumprov från friska vita individer (8). För andra populationer ska andra referensområden användas. Ålder IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XII. a SPECIFIKATIONER Reproducerbarhet IgGsubklasskoncentration IgG IgG IgG IgG variation inom analysen (%) variation mellan analyser (%) 7 7 b Jämförelse mellan PeliClass human IgGsubklassset och Mancini Koncentrationerna av IgG, IgG, IgG och IgG i serum fastställdes med en ELISAanalys och jämfördes med de motsvarande värden som hittades i Mancini. Följande korrelationer fastställdes: IgGsubklass lineär regressionslinje korrelation IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Obs: De värden som anges för testets specifika prestationskännetecken representerar typiska resultat och ska inte betraktas som specifikationer för detta set. XIII. RESTRIKTIONER. Användaren ska ha utbildning i och känna till ELISAanalyser och testproceduren.. Kraftigt hematolyserade eller lipemiska prover ska inte användas. Oväntade resultat kan erhållas av prover med rematoidfaktor, höga bilirubinnivåer eller andra existerande immunkomplex. Sådana prover ska analyseras med andra metoder.. Prover som ligger utanför gränsvärdena, t.ex. vad gäller paraproteiner, ska upprepas med en annan förtunning.. Om en minskad nivå av en av lggsubklasserna skulle hittas kan det inte betraktas som en definitiv diagnos utan enbart som en indikation på att immunsystemet är rubbat, vilket kräver fler undersökningar. 5. Använd alltid kontrollserum för att kontrollera kalibreringskurvornas giltighet. När kontrollen ligger utanför gränserna är provresultaten inte pålitliga. Testet bör göras om.. Reagenser från olika batches kan inte bytas ut mot varandra. 7. Reagensrester (t.ex. död volym) ska inte blandas med innehållet i nyöppnade flaskor. 8. Lock och flaskor f inte bytas ut. Locken ska sättas tillbaka på de rätta flaskorna. 9. Trots att den humana kalibreraren och kontrollserumet har testats på markörer av specifika sjukdomsöverförande agenter i enlighet med gällande EUdirektiv om GMP och befunnits vara nonreaktiva, ska alla komponenter från människor betraktas som potentiellt infektionsfarliga. 0. Konserveringsmedel: Thiomersal 0,00%.. Använd nya plattlock för varje inkubation/fixeringssteg i ELISAexperimentet för att undvika korskontamination. Använd inte aluminiumfolie.. Använd engångspetsar för pipetten för varje överföring för att undvika kontamination.. Varje gång setet används bör färska förtunningar av kalibrerare, konjugat och buffrar göras.. Använd inga andra reagenser och mikrotiterremsor än de som levereras med setet. 5. Natriumazid inaktiverar HRP. Använd inte lösningar som innehåller natriumazid, tillsätt inte heller natriumazid i buffrarna.. Avfallshanteringen skall ske enligt gällande föreskrifter på laboratoriet.

5 XIV. REFERENSER. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. och Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). Sanquin produkter ger garanterat de prestanda som beskrivs i originaltillverkarens bruksanvisning. Det är mycket viktigt att strängt följa beskrivna procedurer, testuppställningar och rekommenderade reagensmedel och apparatur. Sanquin frånsäger sig allt ansvar till följd av att detta försummas. 5